表现出外位点介导的超级活性的FVIIa-sTF复合物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了二硫键连接的包含突变G109C的SEQIDNO:3的可溶性组织因子(sTF)变体和包含突变Q64C和位置M306的引起因子VIIa多肽中的酶原样构象的突变的SEQIDNO:1的FVIIa变体的复合物。所述复合物可以用于治疗凝血病。
【专利说明】表现出外位点介导的超级活性的FVIla-sTF复合物 发明领域
[0001] 本发明涉及凝血因子Vila多肤和组织因子多肤的促凝复合物。
[0002] 通过引用并入序列表 序列表为10. 878字节，在2012年3月22日创建并通过引用并入本文。
[000引背景 在具有凝血病的主体中，诸如在具有血友病的个体中，凝血级联的各个步骤由于例如 凝血因子的不存在或不足的存在而致使功能障碍。凝血级联的一部分的此类功能障碍导 致不足的血液凝固和可能的威胁生命的出血，或对于内部器官诸如关节的损害。具有A和 B型血友病的个体可W接受凝血因子替代治疗诸如分别接受外源因子VIII(FVIII)或因子 IX(FI幻。具有A和B型血友病的个体可能发展分别针对FVIII或FIX的抑制剂（抗体）， 在该种情况下，使用旁路剂化ypassingagents)诸如外源因子Vila(FVIIa)进行治疗可能 有必要。
[0004] 因子VII(FVII)是主要在肝脏中产生的糖蛋白。成熟蛋白由406个氨基酸残基组 成，并且由如通过同源性限定的四个结构域组成。存在N末端Gla结构域，随后为两个表皮 生长因子（巧GF)-样）结构域和C末端丝氨酸蛋白酶结构域。FVII在血浆中作为单链分 子循环。在活化为活化的FVII(FVIIa)后，分子在残基Argl52和Ilel53之间切割，导致通 过二硫键结合在一起的二链蛋白。轻链含有Gla和EGF样结构域，而重链是蛋白酶结构域。 FVIIa要求与其辅因子组织因子（T巧结合，W获得完整的生物学活性。
[0005]TF是位于血管外膜细胞上的263个氨基酸的完整膜糖蛋白受体。其由折叠成两个 各被单一二硫键稳定化的紧凑III型纤连蛋白-样结构域（1-219)的细胞外部分、一个跨 膜区段（220-242)和一个短细胞质尾（243-263)组成。它通过与FVII形成在血管损伤后 可从循环中被捕获的紧密Ca2+依赖复合物而充当凝血的关键引发剂。TF通过充当分子支 架、通过为其生理学底物提供需要的外位点（exosite)相互作用和通过诱导导致蛋白酶的 活性位点区域的成熟的FVIIa的蛋白酶结构域中的构象变化而大大增加FVIIa对其生理学 底物因子IX和因子X的蛋白水解活性。由直接蛋白-蛋白相互作用引起的TF对FVIIa的 活化可在体外通过用TF的可溶性外结构域诸如sTF(l-219)饱和FVIIa而进行模拟。
[0006]EP2007417B1公开了包含FVIIa多肤和可溶性TF多肤的复合物。已经显示该些复 合物在磯脂膜上表现出非常高的蛋白水解活性，但该种有利特征伴随着在溶液中的高蛋白 水解活性和对小肤底物的高醜胺水解活性，W及循环血浆抑制剂诸如抗凝血酶III(ATIII) 的快速抑制。在体内环境中，此类复合物可被迅速失活，导致短药代动力学曲线。
[0007] 因此，存在对于W下包含FVIIa多肤和可溶性TF多肤的复合物的需要，所述复合 物在膜表面上表现出高蛋白水解活性W及在溶液中降低的醜胺分解活性和降低的蛋白水 解活性的期望特性。此类复合物是，优选地，最小免疫原性的。
[0008] 概述 本发明涉及二硫键连接的（i)包含用切S取代氨基酸残基Gln64和用另一个天然存在 的氨基酸残基取代氨基酸残基Me口06的SEQIDNO: 1的FVIIa变体和（ii)包含用切S取 代氨基酸残基Glyl09的SEQIDN0:3的可溶性组织因子（sT巧变体的复合物。FVIIa变体 多肤可W进一步包含氨基酸残基Asp309的取代。本发明还涉及包含二硫键连接的复合物 的核酸分子和表达二硫化物复合物的细胞。
[0009] -种制备本发明的二硫键连接的复合物的方法，包括；（i)在哺乳动物细胞中产 生包含用切S取代氨基酸残基Gln64和用另一个天然存在的氨基酸残基取代氨基酸残基 Me口06的SEQIDNO: 1的因子Vila变体；（ii)在原核或真核细胞中产生包含用切S取代 氨基酸残基Glyl09的SEQIDN0:3的可溶性组织因子变体；（iii)用其中官能团之一是半 脫氨酸反应性的异双官能试剂标记切S;和（iv)借助所述异双官能试剂的第二个官能团 将所述可溶性组织因子变体交联至因子Vila变体。
[0010] 根据本发明的二硫键连接的复合物可W用作药物，特别是用于治疗凝血障碍。
[0011] 附图简述 图1 ;FVIIa(Q64C) (M30抓)-sTF佑109C)复合物中蛋白酶结构域的酶原样构象的证据。 (参）150nMwt-FVIIa() 10nMwt-FVIIa+ 100nMsTF(▲) 152nMFVIIa(Q64C) (M30抓)-sTF佑109C)的氨甲醜化。将所述种类与0. 2MKOCN赔育，并在所示时间点测定残 余活性。发现FVIIa(Q64C)(M30抓)-sTF佑109C)复合物具有与游离的FVIIa的氨甲醜化概 况相同的氨甲醜化概况。
[0012] 图2;在10:90PS:PC囊泡不存在和存在的情况下针对S-2288生色底物的醜胺水 解活性和针对巧的蛋白水解酶活性。活性被提供为在相同条件下关于游离的wt-FVIIa的 相对数。发现醜胺分解活性增加1.8倍，而发现在囊泡不存在的情况下蛋白水解活性增加 9倍。在磯脂囊泡存在的情况下，活性增加的^3000倍。
[001引 图3 ;与FVIIa治疗的FVIIIK0小鼠和wt小鼠相比，FVIII敲除化0)小 鼠中复合物的体内试验的结果。星号标记没有统计学差异的样品。对于FVIIa Q64C-STF(1-219)G109C复合物（Q64C)，看到适度的促凝效果，而对于两种剂量的FVIIa Q64CM30抓-sTF(l-219)G109C，看到正常化至wt水平。
[0014] 序列简述 SEQIDNO: 1提供了天然（野生型）人因子VII的氨基酸序列（1-406)。H字母标记 "GLA"指4-駿基谷氨酸（y-駿基谷氨酸）。
[00巧]SEQIDN0:2提供了天然（野生型）人因子VII的核巧酸序列，包括信号肤（力口 下划线）。
[001引SEQIDN0:3提供了天然（野生型）人可溶性组织因子（1-219)的氨基酸序列。
[0017]SEQIDN0:4提供了天然（野生型）人可溶性组织因子（1-219)的核巧酸序列，包 括信号肤（加下划线）。
[0018]SEQIDNO;5至12提供了用于构建质粒的DM寡核巧酸的核巧酸序列，如表1中 、1以/JN〇
[0019] 详述 本发明涉及二硫键连接的因子VII(a)(FVII(a))多肤和组织因子（T巧多肤的复合 物。通过在FVIIa-TF界面中的特定位点引入一个或多个二硫键，当用TF饱和时，获得了具 有与wt-FVIIa的醜胺分解活性相当的醜胺分解活性的复合物。
[0020] 在本发明的上下文中，术语"FVII(a)"涵盖未分裂的酶原、FVII、W及分裂且因 此活化的蛋白酶FVIIa。FVII(a)包括FVII(a)的天然等位基因变体，其可W存在并从一 个个体到另一个个体中发生。SEQIDN0:1W及Proc.化tl.Acad.Sci.USA1986; 83:2412-2416中提供了一种野生型人FVII(a)氨基酸序列。
[0021] 本文中的术语"FVII(a)多肤"是指野生型FVII(a)分子W及FVII(a)变体， FVII(a)衍生物和FVII(a)缀合物。此类变体、衍生物和缀合物可W表现出相对于野生型人 FVIIa基本上相同、降低或改善的生物和/或药代动力学活性。
[0022] 在本上下文中，术语"组织因子多肤"是指包含组织因子的可溶性外结构域即氨 基酸1-219 (下文中被称作sTF或sTF(1-219))或其功能变体或截短形式的多肤。优选 地，该组织因子多肤至少包含对应于组织因子的氨基酸序列6-209的片段。特定实例为 sTF化-209)、sTF(1-209)和sTF(1-219)。
[0023] 上述复合物的FVII(a)多肤可W是包含用切S取代氨基酸残基Gln64的SEQID NO: 1的FVII(a)变体。所述复合物的TF多肤可W是包含用切S取代氨基酸Glyl09的SEQ IDNO: 3的可溶性组织因子（sT巧变体。FVII(a)多肤进一步包含废除TF对FVIIa的变构刺 激的一个或多个突变。因此获得具有FVIIa蛋白酶结构域的酶原样构象的复合物，导致接 近野生型醜胺分解活性和低程度的抗凝血酶III(ATIII)反应性。例如，所述FVIIa多肤可 W进一步包含用另一个天然存在的氨基酸残基诸如Asp取代氨基酸残基Met306WiocAe皿 (2001) 40,3251-3256) 〇
[0024] FVIIa多肤可W包含用天然存在的极性氨基酸残基（即Arg、Asn、Asp、切S、Glu、 Gin、His、Lys、Ser、T虹或Tyr)取代氨基酸残基Met306。
[00巧]FVIIa多肤可W包含用天然存在的非极性氨基酸残基（即Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、T巧或Val)取代氨基酸残基Me口06。
[0026] FVIIa多肤可W包含用天然存在的中性氨基酸残基（即Ala、Asn、切S、Gin、Gly、 His、lie、Leu、Met、化6、Pro、Ser、1'虹、T巧、Tyr或Val)取代氨基酸残基Me口06。
[0027]FVIIa多肤可W包含用在中性抑为酸性的天然存在的氨基酸残基（即Asp或Glu) 取代氨基酸残基Met306。
[002引 FVIIa多肤可W包含用在中性抑为碱性的天然存在的氨基酸残基（即Arg、Lys或 化S)取代氨基酸残基Met306。
[0029] FVIIa多肤可W包含用Asp取代氨基酸残基Me口06。
[0030]FVIIa多肤可W包含用Ala取代氨基酸残基Me口06。
[0031] FVIIa多肤可W包含用Arg取代氨基酸残基Me口06。
[0032]FVIIa多肤可W包含用Asn取代氨基酸残基Me口06。
[0033]FVIIa多肤可W包含用切S取代氨基酸残基Me口06。
[0034]FVIIa多肤可W包含用Glu取代氨基酸残基Me口06。
[00巧]FVIIa多肤可W包含用Gin取代氨基酸残基Me口06。
[0036]FVIIa多肤可W包含用Gly取代氨基酸残基Me口06。
[0037] FVIIa多肤可W包含用His取代氨基酸残基Me口06。
[003引 FVIIa多肤可W包含用lie取代氨基酸残基Met306。
[0039] FVIIa多肤可W包含用Leu取代氨基酸残基Me口06。
[0040]FVIIa多肤可W包含用Lys取代氨基酸残基Me口06。
[0041] FVIIa多肤可w包含用Met取代氨基酸残基Me口06。
[0042] FVIIa多肤可W包含用Phe取代氨基酸残基Me口06。
[0043] FVIIa多肤可W包含用Pro取代氨基酸残基Me口06。
[0044] FVIIa多肤可W包含用Ser取代氨基酸残基Me口06。
[0045] FVIIa多肤可W包含用T虹取代氨基酸残基Me口06。
[0046] FVIIa多肤可W包含用T巧取代氨基酸残基Me口06。
[0047] FVIIa多肤可W包含用Tyr取代氨基酸残基Me口06。
[0048] FVIIa多肤可W包含用Val取代氨基酸残基Me口06。
[0049] FVIIa多肤可W包含用Ser取代氨基酸残基Me口06。
[0050] FVIIa多肤可W包含用T虹取代氨基酸残基Me口06。
[0051] FVIIa多肤可W包含用Asn取代氨基酸残基Me口06。
[005引为了使与TF的相互作用不稳定，FVIIa多肤可W进一步包含用另一个天然存在的 氨基酸残基取代位置309的Asp,其可W由核酸构建体编码。
[005引 FVIIa多肤可W包含用天然存在的极性氨基酸残基（即Arg、Asn、Asp、切S、Glu、 Gin、His、Lys、Ser、T虹或Tyr)取代氨基酸残基Asp309。
[0054] FVIIa多肤可W包含用天然存在的非极性氨基酸残基（即Ala、Gly、Ile、Leu、Met、 Phe、Pro、T巧或Val)取代氨基酸残基Asp309。
[005引 FVIIa多肤可W包含用天然存在的中性氨基酸残基（即Ala、Asn、切S、Gin、Gly、 His、lie、Leu、Met、化6、Pro、Ser、1'虹、T巧、Tyr或Val)取代氨基酸残基Asp309。
[0056] FVIIa多肤可W包含用在中性抑为酸性的天然存在的氨基酸残基（即Asp或Glu) 取代氨基酸残基Asp309。
[0057] FVIIa多肤可W包含用在中性抑为碱性的天然存在的氨基酸残基（即Arg、Lys或 化S)取代氨基酸残基Asp309。
[0058] FVIIa多肤可W包含用Asp取代氨基酸残基Asp309。
[0059] FVIIa多肤可W包含用Ala取代氨基酸残基Asp309。
[0060] FVIIa多肤可W包含用Arg取代氨基酸残基Asp309。
[0061] FVIIa多肤可W包含用Asn取代氨基酸残基Asp309。
[0062] FVIIa多肤可W包含用切S取代氨基酸残基Asp309。
[0063] FVIIa多肤可W包含用Glu取代氨基酸残基Asp309。
[0064] FVIIa多肤可W包含用Gin取代氨基酸残基Asp309。
[0065] FVIIa多肤可W包含用Gly取代氨基酸残基Asp309。
[0066] FVIIa多肤可W包含用His取代氨基酸残基Asp309。
[0067] FVIIa多肤可W包含用lie取代氨基酸残基Asp309。
[0068] FVIIa多肤可W包含用Leu取代氨基酸残基Asp309。
[0069] FVIIa多肤可W包含用Lys取代氨基酸残基Asp309。
[0070] FVIIa多肤可W包含用Met取代氨基酸残基Asp309。
[0071] FVIIa多肤可W包含用Phe取代氨基酸残基Asp309。
[0072] FVIIa多肤可W包含用Pro取代氨基酸残基Asp309。
[0073] FVIIa多肤可W包含用Ser取代氨基酸残基Asp309。
[0074] FVIIa多肤可W包含用T虹取代氨基酸残基Asp309。
[00巧]FVIIa多肤可W包含用T巧取代氨基酸残基Asp309。
[0076]FVIIa多肤可W包含用Tyr取代氨基酸残基Asp309。
[0077]FVIIa多肤可W包含用Val取代氨基酸残基Asp309。
[0078]FVIIa多肤可W包含用Ser取代氨基酸残基Asp309。
[0079]FVIIa多肤可W包含用T虹取代氨基酸残基Asp309。
[0080]FVIIa多肤可W包含用Asn取代氨基酸残基Asp309。
[0081]FVIIa多肤可W包含用Asp取代氨基酸残基Met306和用Ser取代氨基酸残基 Asp309〇
[0082]FVIIa多献可W包含用Ala取代氨基酸残基Met306和用Ser取代氨基酸残基 Asp309〇
[0083]FVIIa多肤可W包含用Ser取代氨基酸残基Met306和用Ser取代氨基酸残基 Asp309〇
[0084]FVIIa多肤可W包含用T虹取代氨基酸残基Met306和用Ser取代氨基酸残基 Asp309〇
[0085] FVIIa多献可W包含用Asn取代氨基酸残基Met306和用Ser取代氨基酸残基 Asp309〇
[0086] FVIIa多献可W包含用Asp取代氨基酸残基Met306和用Ala取代氨基酸残基 Asp309〇
[0087] FVIIa多献可W包含用Ala取代氨基酸残基Met306和用Ala取代氨基酸残基 Asp309〇
[0088]FVIIa多献可W包含用Ser取代氨基酸残基Met306和用Ala取代氨基酸残基 Asp309〇
[0089] FVIIa多肤可W包含用T虹取代氨基酸残基Met306和用Ala取代氨基酸残基 Asp309〇
[0090] FVIIa多献可W包含用Asn取代氨基酸残基Met306和用Ala取代氨基酸残基 Asp309〇
[0091] 还可W被取代W进一步降低醜胺分解活性、同时维持相对高的蛋白水解活 性的FVII(a)蛋白酶结构域的残基列在Proc.化t.Acad.Sci.USA(1996)，93， 14379-14384 的表 1、BI和BII中。
[0092] 上述复合物的FVII(a)多肤可W与SEQIDNO: 1代表的FVII(a)多肤至少80%， 诸如至少85%，诸如至少90%，诸如至少95%，诸如至少96%，诸如至少97%，诸如至少 98%，诸如至少99 %相同。
[0093] 上述复合物的TF多肤可W与SEQIDN0:3代表的TF多肤至少80%，诸如至少 85%，诸如至少90%，诸如至少95%，诸如至少96%，诸如至少97%，诸如至少98%，诸如至 少99%相同。
[0094] 本领域中已知的术语"同一性"是指如通过比较序列确定的两个或更多个多肤的 序列之间的关系。在本领域中，"同一性"还意指如由两个或更多个氨基酸残基的串之间 的匹配数确定的多肤之间的序列相关性程度。"同一性"测量了具有通过特定数学模型或 计算机程序（即"算法"）解决的缺口比对（如果有的话）的两个或更多个序列之间中较 小者的相同匹配的百分比。易于通过已知方法计算相关肤的同一性。此类方法包括，但不 限于那些在如下文献中描述的方法；Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed. , Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W. , ed. , Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M.,和Gridin, H. G. , eds. , Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. , Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.和Devereux, J., eds. , M. Stockton Press, New York, 1991;和Carillo等人，SIAM J. Applied Math. 48，1073 (1988)。
[0095] 设计用于测定同一性的优选的方法，W给出测试序列之间的最大匹配。测定同一 性的方法在公开可利用的计算机程序中描述。用于测定两个序列之间同一性的优选计算 机程序包括GCG程序包，包括GAP(Devereux等人，Nucl. Acid. Res. 12，387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLAST?>BLASTN 和FASTA (Altschul等人，J. Mol. Biol. 215，403-410 (1990))。可W从化tional Center for Biotechnology Information (NCBI)和其它来源炬LAST Manual, Altschul等 人肥8/化]?/^祖66地63(13，1(1.20894;4113油111等人，同上）公共获得化451《程序。 众所周知的Smith waterman算法也可W用于测定同一'生。
[0096]例如，使用计算机算法GAP(GeneticsComputerGroup,Universityof Wisconsin,Madison,Wis.)，对待测定百分比序列同一'I"生的两个多肤进行序列对比，W达 到其各自氨基酸的最佳匹配（"匹配的跨度"，如通过算法测定的）。缺口开放罚分（gap openingpenalty)(计算为3x对角线平均值（averagediagonal)对角线平均值"是所 用比较矩阵的对角线的平均值；"对角线"为通过特定比较矩阵指定各完美氨基酸匹配的评 分或数字）和缺口延长罚分（通常为{分数（l/l〇)}x缺口开放罚分）W及比较矩阵，诸如 PAM250或化0SUM62与算法结合使用。算法还使用标准比较矩阵（参见：用于PAM250 比较矩阵：Dayhoff等人，AtlasofProteinSequenceandStructure,vol. 5,supp. 3 (1978);用于化0SUM62 比较矩阵；Hen化off等人，Proc.化tl.Acad.SciUSA(1992) 89， 10915-10919)。
[0097] 用于肤序列对比的优选参数包括W下；算法；Needleman等人，J.Mol.Biol. 48，443-453 (1970);比较矩阵；BLOSUM62fromHenikoff等人，PNASUSA89， 10915-10919 (1992);缺口罚分；12，缺口长度罚分；4，相似性阔值；0。
[0098]GAP程序利用上述参数是有用的。上述参数为使用GAP算法进行肤对比（对末端 缺口而言无罚分）的默认参数。
[009引术语"相似性"是相关的概念，但与"同一性"相比，是指包括相同匹配和保守取 代匹配的序列关系。如果两个多肤序列具有，例如，（分数（10/20))相同的氨基酸，并且 其余都是非保守取代，则百分比同一性和相似性将都是50%。如果，在相同实例中，多存 在5个有保守取代的位置，则同一性百分比仍然是50%，但相似性百分比将是75% (分数 (15/20))。因此，在存在保守取代的情况下，两个多肤之间的相似性程度将比那两个多肤之 间的百分比同一性更高。
[0100]FVII(a)-TF复合物的活性可w使用本领域技术人员众所周知的各种方法进行测 试。合适的方法包括实施例中详细描述的体外基于溶液的蛋白水解测定法、体外醜胺分解 测定法、凝血弹性描记（TEG)测定法、氨甲醜化测定法、抑制测定法和体外抗凝血酶III抑 制测定法。
[0101] 如实施例中所示，本发明的FVII(a)-TF复合物在溶液中具有降低的醜胺分解活 性和降低的蛋白水解活性，同时在膜表面上保留高蛋白水解活性的期望特性。因此受体发 展弥散性血管内凝血的风险尽可能降低。此外，复合物可W具有延长的循环时间。进一步 优点是，复合物仅仅受其外位点特异性控制，该意味着例如蛋白酶活化受体（PARS)的裂解 将是低的。目前复合物的再进一步优点是，被引入的突变没有表面暴露，因此降低了免疫原 性的风险。
[0102] 本文公开的复合物的FVII(a)中间体可W是使用众所周知的生产和纯化方法血 浆来源的或重组产生的。本文公开的复合物的TF中间体可W是使用众所周知的生产和纯 化方法重组产生的。糖基化、Y-駿化和其它翻译后修饰的程度和位置可W根据选择的宿 主细胞和其生长条件而变化。
[0103] 因子VII多肤和组织因子多肤也可W共表达于细菌诸如大肠杆菌中或转基因动 物诸如W0 05/075635中公开的那些中。然后可W将FVII(a)和TF中间体交联。
[0104] 在一个特别有趣的变体中，制备该复合物的方法涉及共表达因子VII多肤和组织 因子多肤，由此可在细胞内容易建立两个多肤之间的共价连接。
[0105] 一种可W产生二硫化物复合物的方法包括（a)用（i)包含编码如本文定义的SEQ IDNO: 1的因子Vila变体的核酸分子和与其可操作连接的表达控制区域的表达载体；和 (ii)包含编码如本文定义的SEQIDNO: 3的可溶性组织因子变体的核酸分子和与其可操作 连接的表达控制区域的表达载体转染细胞；化）在用于表达因子VII多肤和组织因子多肤 的条件下培养该转染细胞；C)选择使用FVII核酸分子的表达控制区域稳定表达复合物的 细胞，和d)分离表达的复合物。
[0106] 蛋白生产领域的技术人员众所周知在细胞中的表达蛋白。在实施本发明方法时， 细胞通常为真核细胞，更优选建立的真核细胞系，包括但不限于C册（例如，ATCCC化61)、 C0S-1 (例如，ATCCC化1650)、幼仓鼠肾炬HK)和肥K293 (例如，ATCCC化1573; Gr址am等人，J.Gen.Virol. 36:59-72，1977)细胞系。优选的BHK细胞系为tk-tsl3 BHK细胞系（Waechter和Base;rga,Proc.化1:1.Acad.Sci.USA79:1106-1110, 1982)， 下文中称作BHK570细胞。该BHK570细胞系可从美国典型培养物保藏中也（12301Parklawn Dr.，Rockville,MD20852)获得，ATCC登录号为邸L10314。tk-tsl3BHK细胞系也可 从ATCCW登录号0?L1632获得。优选的CH0细胞系是可从ATCCW登录号CC161获得的 CH0K1细胞系。
[0107] 其它适合的细胞系包括但不限于大鼠化PI(大鼠肝癌；ATCCC化1600)、大鼠 舶PII(大鼠肝癌；ATCCC化 1548)、TCMK(ATCC(XL139)、人肺细胞（ATCC皿 8065)、 NCTC1469(ATCC(XL9. 1) ;DUKX细胞（C册细胞系）（化laub和Chasin,Proc.化tl. Acad.Sci.USA77:4216-4220，1980)值UKX细胞也被称作DXBll细胞）和DG44(CHO 细胞系）（Cell, 33: 405, 1983,和SomaticCellandMolecularGenetics12: 555, 1986)。其它可用的是3T3细胞、Namalwa细胞、骨髓瘤W及骨髓瘤和其它细胞的融合体。在 一些实施方案中，该细胞可为突变或重组细胞，诸如例如与它们的来源细胞类型表达定性 或定量不同范围的催化蛋白转录后修饰的酶类（例如，糖基化酶诸如糖基转移酶和/或糖 巧酶，或加工酶诸如前肤）的细胞。合适的昆虫细胞系还包括但不限于鱗翅目细胞系，诸如 草地贪夜蛾（Spodopterafrugiperda)细胞或粉纹夜蛾（Trichoplusiani)细胞（参见例 如US5,077,214)。
[010引在一些实施方案中，用于实施本发明的细胞能够在息浮培养物中生长。如本文中 所使用，能够息浮的细胞为可W息浮生长而不会形成大块、坚实凝聚物的细胞，即单分散， 或W松散凝聚物生长且每个聚集物中仅包含数个细胞的细胞。能够息浮的细胞包括但不限 于不需要适应或处理即可息浮生长的细胞（诸如例如，造血细胞或淋己样细胞）和已经通 过粘附依赖细胞（诸如例如，上皮细胞或成纤维细胞）的逐渐适应为息浮生长而变得能够 息浮的细胞。
[0109] 用于实施本发明的细胞可为粘附细胞（也被称作销定依赖细胞或粘附依赖细 胞）。如本文中所使用，粘附细胞是需要将自身粘附或销定至合适表面W繁殖和生长的细 胞。在本发明的一个实施方案中，使用的细胞为粘附细胞。在该些实施方案中，繁殖阶段和 生产阶段两者都包括使用微载体。使用的粘附细胞应当能够在一个或多个繁殖阶段过程中 迁移至载体上（如果使用大孔载体，则进入载体的内部结构）并当被转移至生产生物反应 器时迁移至新的载体。如果粘附细胞自身不足W能够迁移至新载体，则可通过将含有细胞 的微载体与蛋白水解酶类或EDTA接触将其从载体释放。使用的培养基（特别当不含动物 来源的组分时）应当进一步含有适于支持粘附细胞的组分；适用于培养粘附细胞的培养基 可从供应商获得，诸如例如，Sigma。
[0110] 细胞也可W是息浮适应的或能够息浮的细胞。如果使用此类细胞，则细胞繁殖可 在息浮液中进行，因此微载体只用于生产培养容器本身中的最终繁殖阶段和生产阶段。在 使用息浮适应的细胞的情况下，所使用的微载体通常为大孔载体，其中细胞通过物理捕获 的方式附着于载体的内部结构内。在此类实施方案中，真核细胞通常选自CH0、BHK、肥K293 和骨髓瘤细胞等。
[0111] 在其一个特别有趣的实施方案中，两个多肤通过特异性连接的方式连接，更具体 而言是通过直接连接的方式，诸如因子VII多肤和组织因子多肤之间的一个或多个二硫 键。
[0112] 在一个实施方案中，用于制备FVII(a)-TF复合物的方法涉及生产可溶性组织因 子的半脫氨酸变体，随后用异双官能试剂（其中官能团之一为半脫氨酸反应性的）标记可 溶性组织因子的半脫氨酸，最后借助该试剂的第二个官能团与因子Vila交联。用于在大肠 杆菌中克隆和表达组织因子的半脫氨酸突变体W及随后用半脫氨酸特异性试剂标记的方 法先前已描述于（Stone等人（1995) Biochem. J., 310, 605-614; Rreskgjkrd等人（1996) Protein Sci.，5，1521-1540; Owenius等人（1999) Biophys. J.，77，2237-2250; 日sterlund等人（2001) Biochemistry, 40, 9324-9328)。使用含有一个半脫氨酸特异 性和一个光可激活官能团的异双官能试剂光交联连接蛋白已描述于化ang等人（1995) Biochem. Bio地ys. Res. Commun., 217, 1177-1184。特别适合的异双官能试剂的实例包 括对-叠氮楓己醜苯胺、对-叠氮苯甲醜甲基漠化物和对-叠氮漠己醜苯胺，
【权利要求】
1. 二硫键连接的复合物，所述复合物为（i)包含用Cys取代氨基酸残基Gln64和用另 一个天然存在的氨基酸残基取代氨基酸残基Met306的SEQ ID N0:1的FVIIa变体和（ii) 包含用Cys取代氨基酸残基Glyl09的SEQ ID N0:3的可溶性组织因子（sTF)变体的复合 物。
2. 根据权利要求1的二硫键连接的复合物，其中所述Met306被天然存在的极性氨基酸 残基取代。
3. 根据权利要求2的二硫键连接的复合物，其中所述Met306被Asp取代。
4. 根据权利要求1的二硫键连接的复合物，其中所述Met306被天然存在的非极性氨基 酸残基取代。
5. 根据权利要求4的二硫键连接的复合物，其中所述Met306被Ala取代。
6. 根据权利要求1的二硫键连接的复合物，其中所述Met306被天然存在的中性氨基酸 残基取代。
7. 根据权利要求6的二硫键连接的复合物，其中所述Met306被Asn、Ser或Thr取代。
8. 根据权利要求1的二硫键连接的复合物，其中所述Met306被在中性pH为酸性的天 然存在的氨基酸残基取代。 9. FVIIa多肽可以包含用在中性pH为碱性的天然存在的氨基酸残基取代氨基酸残基 Met306〇
10. 根据权利要求1-9中任一项的二硫键连接的复合物，其进一步包含用另一个天然 存在的氨基酸残基取代氨基酸残基Asp309。
11. 根据权利要求10的二硫键连接的复合物，其中所述Asp309被Ala或Ser取代。
12. 细胞，其表达根据权利要求1-11中任一项的二硫键连接的复合物。
13. 制备根据权利要求1-11中任一项的复合物的方法， 其包括： (i) 在哺乳动物细胞中产生包含用Cys取代氨基酸残基Gln64和用另一个天然存在的 氨基酸残基取代氨基酸残基Met306的SEQ ID NO: 1的因子Vila变体； (ii) 在原核或真核细胞中产生包含用Cys取代氨基酸残基Glyl09的SEQ ID NO: 3的 可溶性组织因子变体； (iii) 用其中官能团之一是半胱氨酸反应性的异双官能试剂标记Cys ; (iv) 借助所述异双官能试剂的第二个官能团将所述可溶性组织因子变体交联至因子 Vila变体。
14. 根据权利要求1-11中任一项的二硫键连接的复合物，其用作药物。
15. 根据权利要求1-11中任一项的二硫键连接的复合物，其用于治疗凝血病。
【文档编号】C12N9/64GK104395465SQ201380016758
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2013年3月15日 优先权日:2012年3月30日
【发明者】H.奧斯特加尔德, A.L.尼伊森, O.H.奧尔森 申请人:诺和诺德保健Ag（股份有限公司）