人工核酸分子的制作方法

人工核酸分子的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种人工核酸分子，所述人工核酸分子包含至少一个可读框和至少一个3'UTR元件，所述3'UTR元件包含源自白蛋白基因的3'UTR或源自白蛋白基因3'UTR的变体的核酸序列。本发明进一步涉及此种人工核酸分子在基因治疗和/或基因接种中的用途。此外，本发明涉及包含源自白蛋白基因的3'UTR或源自白蛋白基因3'UTR的变体的核酸序列的3'UTR元件用于稳定和/或延长包含此种3'UTR元件的核酸序列的蛋白表达的用途。
【专利说明】人工核酸分子
[0001] 本发明涉及人工核酸分子，所述人工核酸分子包含可读框，3' UTR元件和任选地 聚腺苷酸序列和/或聚腺苷酸化信号。本发明还涉及包含3' UTR元件的载体，包含人工核 酸分子的药物组合物和包含人工核酸分子的试剂盒，包含人工核酸分子的载体和/或药物 组合物，优选用于基因治疗和/或基因接种领域。
[0002] 基因治疗和基因接种属于最有希望和快速发展的现代医学方法。它们可以为种种 疾病的治疗提供高度特异和个性化选择。尤其是，不仅遗传病，而且自身免疫疾病、癌或肿 瘤相关疾病以及炎性疾病可以是此种治疗方法的对象。而且，人们设想通过这些方法预防 此类疾病的（早期）发病。
[0003] 基因治疗背后的主要构思理念为适当调节与特定疾病的病理状态相关的受损的 基因表达。病理学上改变的基因表达可以导致缺少或过量生产必要基因产物，例如，信号传 导因子诸如激素，看家因子（housekeeping factors)，代谢酶，结构蛋白等。改变的基因表 达可以不仅由于错误调节转录和/或翻译，而且还由于编码特定蛋白的ORF内的突变。病 理突变可以由例如染色体畸变，或由更特异突变，如点或移码突变引起，它们所有都导致受 限的功能和，可能完全丧失基因产物的功能。然而，转录或翻译的错误调节也可以发生，如 果突变影响编码参与细胞的转录或翻译机制的蛋白的基因。此种突变可以导致基因病理上 调或下调节，因此是功能性的。编码发挥此种调节功能的基因产物的基因，可以是例如，转 录因子、信号受体，信使蛋白等。然而，此种编码调节蛋白的基因的功能缺失，在某些情况下 可以由人工引入进一步作用于受损的基因产物下游的其它因子反转。此种基因缺陷还可以 由通过置换受影响基因本身的基因治疗补偿。
[0004] 基因接种允许引起对选择的抗原所需的免疫应答，所述选择的抗原诸如细菌表面 的特征组分、病毒粒子、肿瘤抗原等。一般而言，接种是现代医学的重要成就。然而，目前仅 对较小量的疾病有可用的有效疫苗。因此，不能由接种预防的感染每年仍然影响数百万人。
[0005] 通常，疫苗可以细分为"第一代"，"第二代"和"第三代"疫苗。"第一代"疫苗典型 地是，全生物体疫苗。它们基于活的和减毒或被杀灭的病原体，例如病毒，细菌等。活疫苗 和减毒疫苗的主要缺点是向危及生命的变体回复的风险。因此，尽管减毒，但此种病原体本 质上仍然可以带有不可预测的风险。杀灭的病原体可能不如所需要的那样有效产生特异免 疫应答。为了最小化这些风险，开发了"第二代"疫苗。这些典型地为亚单位疫苗，所述亚 单位疫苗由源自病原体的限定的抗原或重组蛋白组分组成。
[0006] 基因疫苗，即用于基因接种的疫苗，通常被理解为"第三代"疫苗。它们典型地由 遗传改造的核酸分子构成，所述遗传改造的核酸分子允许表达对于体内病原体或肿瘤抗 原为特征性的肽或蛋白（抗原）片段。在施用于患者时，基因疫苗表达并由感受态细胞 (competent cells)摄取。施用核酸的表达导致产生编码的蛋白。如果这些蛋白被患者的 免疫系统识别为外源，引发免疫应答。
[0007] 如从上文可以看出的，基因治疗和基因接种方法，基本上都基于向患者施用核酸 分子并随后转录和/或翻译编码的遗传信息。备选地，基因接种或基因治疗还可以包含以 下方法：该方法包括从要治疗的患者分离特异体细胞，随后体外转染此种细胞，并再将处理 的细胞施用于患者。
[0008] DNA以及RNA可以用作在基因治疗或基因接种范畴内施用的核酸分子。已知DNA 相对稳定并易于操作。然而，使用DNA承担施用的DNA-片段不希望的插入患者基因组中，从 而导致丧失受损基因功能的风险。作为进一步的风险，出现不希望产生的抗DNA抗体。另 一个缺点是在DNA施用和其转录/翻译后可以获得的编码肽或蛋白的有限表达水平。在其 它原因中，施用的DNA的表达水平将依赖于调节DNA转录的特定转录因子的存在。缺少此 种因子的情况下，DNA转录将不产生令人满意的RNA量。从而，获得的翻译的肽或蛋白的水 平有限。
[0009] 通过使用RNA替代DNA用于基因治疗或基因接种，不希望的基因组整合和抗DNA 抗体产生的风险被最小化或被避免。然而，RNA被认为是相当不稳定的分子种类，其可以容 易地被遍在的RNA酶降解。
[0010] 体内，RNA-降解促进调节RNA半衰期。该效果被认为和证明是精细调整真核基 因表达的调节（Friedel 等人，Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life，Nucleic Acid Research，2009,1-12)。因此， 每个天然存在的mRNA具有依赖于mRNA源自的基因的其各自的半衰期。其促进调节该基 因的表达水平。不稳定RNA对于及时在不同点实现瞬时基因表达是重要的。然而，耐久的 RNA可能与不同蛋白的积累或基因的连续表达相关。体内，mRNA的半衰期还可以依赖于 环境因素，如激素处理，如例如对胰岛素样生长因子I，肌动蛋白，和白蛋白mRNA所显示的 (Johnson等人,Newly synthesized RNA !Simultaneous measurement in intact cells of transcription rates and RNA stability of insulin-like growth factor I, actin, and albumin in growth hormone-stimulated hepatocytes, Proc. Natl. Acad. Sci?,第 88 卷，第 5287-5291 页，1991)。
[0011] 对于基因治疗和基因接种，通常需要稳定的RNA。一方面，这是由于由RNA-序列编 码的产物在体内积累的事实。另一方面，当在其储存过程中制备合适剂型时，和当施用时， RNA必须保持其结构和功能完整性。因此，对提供用于基因治疗或基因接种的稳定RNA分子 投入相当大的关注，以阻止它们经历早期降解或衰变。
[0012] 据报道，核酸分子的G/C-含量可以影响其稳定性。因此，包含增加量的鸟嘌呤（G) 和/或胞嘧啶（C)残基的核酸可以比含有大量腺嘌呤（A)和胸腺嘧啶（T)或尿嘧啶（U)核 苷酸的核酸在功能上更稳定。在这方面，W002/098443提供含有由翻译区中的序列修饰稳 定的mRNA的药物组合物。此序列修饰利用遗传密码简并性。因此，含有不太有利的核苷酸 组合（就RNA稳定性而言不太有利）的密码子可以在不改变编码的氨基酸序列的情况下被 替代的密码子置换。该RNA稳定化方法受提供不允许留下所需氨基酸序列间隔的各个单个 RNA分子的特定核苷酸序列限制。此外，该方法受限于RNA编码区。
[0013] 作为mRNA稳定化的备选方案，已经发现天然存在的真核mRNA分子含有特征稳定 元件。例如，它们可以在其5'末端（5' UTR)和/或在其3'末端（3' UTR)包含所谓非 翻译区（UTR)以及其它结构特征，如5'帽结构或3'-聚腺苷酸尾。5' UTR和3' UTR二 者都典型地从基因组DNA转录并且因此是未成熟（premature)mRNA元件。在mRNA加工过 程中，成熟mRNA的特有结构特征，如5'帽和3'-聚腺苷酸尾（也称为聚腺苷酸尾或聚腺 苷酸序列）通常被添加于转录的（未成熟）mRNA。
[0014] 3'-聚腺苷酸尾典型地是添加在转录的mRNA的3'末端的腺嘌呤核苷酸的单一 序列片段。其可以包含至多约400个腺嘌呤核苷酸。发现此种3'-聚腺苷酸尾的长度对 于个体mRNA的稳定性是可能的关键要素。
[0015] 此外，已显示a -珠蛋白mRNA的3' UTR可能是对于公知的a -珠蛋白mRNA稳定 性的重要因素（Rodgers等人，Regulated a-globin mRNA decay is a cytoplasmic event proceeding through 3 ' -t〇-5 ' exosome-dependent decapping, RNA,8,第 1526-1537 页，2002)。a-珠蛋白mRNA的3' UTR明显参与特定核蛋白-复合物（a-复合物）的形 成，其存在与mRNA体外稳定性相关（Wang等人，An mRNA stability complex functions with poly(A)-binding protein to stabilize mRNA in vitro,Molecular and Cellular biology，第 19 卷，第 7 期，1999 年 7 月，第 4552-4560 页）。
[0016] 不考虑影响mRNA稳定性的因素，由靶细胞或组织有效翻译施用的核酸分子对于 任何使用用于基因治疗或基因接种的核酸分子的方法都至关重要。与调节稳定性一起，大 多数mRNA的翻译也由结构特征如UTR、5'帽和3'-聚腺苷酸尾调节。在此种情况下，据 报道，聚腺苷酸尾的长度可以对于翻译效率也发挥重要作用。然而，稳定化3'-元件也可 能对翻译具有减弱效果。
[0017] 本发明的目的是提供可以适于应用于基因治疗和/或基因接种的核酸分子。尤其 是，本发明的目的是提供针对期限前降解或衰变稳定的而不呈现翻译效率损失的mRNA种 类。本发明的另一个目的是提供编码此种较好mRNA种类的核酸分子，其可以适于在基因治 疗和/或基因接种中使用。本发明进一步的目的是提供用于基因治疗和/或基因接种的药 物组合物。归纳起来，本发明的目的是提供改进的核酸种类，其通过节省成本和直接的途径 克服上文讨论的现有技术的缺陷。
[0018] 通过要求保护的主题解决本发明的根本目的。
[0019] 为了清楚和易读，提供以下定义。对于这些定义所提到的任何技术特征可以基于 每个本发明的实施方案读懂。可以在这些实施方案范围内具体提供其它定义和解释。
[0020] 适应件免疫应答：适应件免疫应答典型地理解为免疫系统的抗原-特异应答。抗 原特异性允许产生适应特异病原体或病原体感染的细胞的应答。发起这些适应的应答的能 力通常由"记忆细胞"保持在体内。假如病原体不止一次感染身体，这些特异记忆细胞用于 快速消除它。在此种情况下，适应性免疫应答的第一步是激活能够通过抗原呈递细胞诱导 抗原特异免疫应答的幼稚(nai've)抗原特异T细胞或不同免疫细胞。这在幼稚T细胞不断通 过的淋巴组织和器官中发生。可以用作抗原呈递细胞的三种细胞类型是树突细胞、巨噬细 胞和B细胞。这些细胞中的每个在引起免疫应答方面具有不同功能。树突细胞可以通过吞 噬作用和大胞饮摄取抗原并且可以通过与例如外来抗原相接触而被刺激，从而迁移至局部 淋巴组织，在那它们分化为成熟树突细胞。巨噬细胞摄取颗粒抗原如细菌并通过由传染剂 或其它合适的刺激物诱导以表达MHC分子。B细胞通过其受体结合和内化可溶蛋白抗原的 独特能力对于诱导T细胞也可以是重要的。MHC-分子典型地负责向T-细胞呈递抗原。其 中，将抗原呈递到MHC分子上导致T细胞的激活，其诱导其增殖和向武装的效应T细胞的分 化。效应T细胞的最重要功能是通过⑶8+细胞毒性T细胞杀灭感染的细胞和通过Thl细 胞激活巨噬细胞（二者一起构成细胞介导的免疫），和通过Th2和Thl细胞激活B细胞以产 生不同种类的抗体，从而驱动体液免疫应答。T细胞识别通过其T细胞受体抗原，其不直接 识别和结合抗原，而取而代之的是识别短肽片段例如源自病原体的蛋白抗原的片段，例如 所谓的表位，其结合其它细胞表面上的MHC分子。
[0021] 话应件免疫系统：话应件免疫系统某本h致力于消除或阳Ih病原体牛长。其典型 地通过向脊椎动物免疫系统提供识别和记忆特定病原体（以产生免疫性），并在每次遭遇 病原体时发起更强烈的攻击的能力调节适应性免疫应答。该系统是高度可适应的，因为体 细胞超变（加速的体细胞突变过程），和V(D)J重组（抗原受体基因片段的不可逆遗传重 组）。该机制允许小量基因产生大量不同抗原受体，其随后独特地表达在每个个体淋巴细胞 上。因为基因重排导致各个细胞DNA的不可逆改变，之后此种细胞的所有子代（后代）将 遗传编码相同受体特异性的基因，包括为持久的特异免疫性的关键的记忆B细胞和记忆T 细胞。
[0022] 佐剂/佐剂鉬分:佐剂或佐剂组分广义上典型地是可以改良（例如增强）其它试 剂（如药物或疫苗）的效果的药剂和/或免疫剂。将在广义上解释它并且指广谱的物质。 典型地，这些物质能够增加抗原的免疫原性。例如，佐剂可以被先天免疫系统识别并且，例 如可以引起先天免疫应答。"佐剂"典型地不引起适应性免疫应答。在这个程度，"佐剂"不 算抗原。其作用模式不同于由导致适应性免疫应答的抗原引发的效果。
[0023] 抗原：在本发明的背景下，"抗原"典型地指可以被免疫系统，优选被适应性免疫 系统识别，并能够例如通过作为适应性免疫应答的部分的抗体和/或抗原-特异T细胞的 形成引发抗原_特异免疫应答的物质。典型地，抗原可以是或可以包含可以被MHC呈递到 T-细胞的肽或蛋白。
[0024] 人工核酸分子：人工核酸分子可以典型地理解为天然不存在的核酸分子，例如 DNA或RNA。换句话说，人工核酸分子可以理解为非天然核酸分子。此种核酸分子可以由于 其个体序列（其天然不存在）和/或由于其它修饰，例如天然不存在的核苷酸的结构修饰 而是非天然的。人工核酸分子可以是DNA分子，RNA分子或包含DNA和RNA部分的杂合分 子。典型地，可以通过遗传工程方法设计和/或产生人工核酸分子以符合想要的人工核苷 酸序列（异源序列）。在此种情况下，人工序列通常是可以天然不存在的序列，即其与野生 型序列至少有一个核苷酸不同。术语'野生型'可以理解为天然存在的序列。进一步地，术 语'人工核酸分子'不限于意为'一个单个分子'，而典型地理解为包含全体相同分子。 因此，它可以涉及等分部分中含有的多个相同分子。
[0025] 双顺反子RNA，多顺反子RNA :双顺反子或多顺反子RNA典型地是典型地可以具有 两个（双顺反子）或更多个（多顺反子）可读框（ORF)的RNA，优选mRNA。在此种情况下， 可读框是可翻译为肽或蛋白的密码子序列。
[0026] 载体/聚合载体：本发明范围内的载体典型地可以是促讲另一个化合物(货物） 的转运和/或复合的化合物。聚佥载体典型地是由聚合物形成的载体。载体可以通过共价 或非共价相互作用与货物关联。载体可以将核酸，例如RNA或DNA转运至靶细胞。对于一 些实施方案，载体可以是阳离子组分。
[0027] 阳离子鉬分:术语"阳离子组分"典型地指在pH值典型地为从1至9,优选为或低 于9 (例如从5至9)，为或低于8 (例如从5至8)，为或低于7 (例如从5至7)的pH值，最 优选在生理pH，例如从7. 3至7. 4带正电荷（阳离子）的带电分子。因此，阳离子组分可以 是任何带正电荷的化合物或聚合物，优选在生理条件下，尤其是在体内生理条件下带正电 荷的阳离子肽或蛋白。'阳离子肽或蛋白'可以含有至少一个带正电荷的氨基酸，或多于 一个带正电荷的氨基酸，例如选自Arg，His, Lys或Orn。因此，'聚阳离子'组分也在给 定条件下呈现多于一个正电荷的范围内。
[0028] 5,帽=5,帽是实体，典型地是修饰的核苷酸实体，其通常'加帽（cap)'成熟 mRNA的5'末端。5'帽可以典型地由修饰的核苷酸，尤其是由鸟嘌呤核苷酸衍生物形成。 优选地，5'帽通过5' -5'-三磷酸酯键与5'-末端连接。5'帽可以是甲基化的，例如 m7GpppN，其中N是携带5'帽的核酸的末端5'核苷酸，典型地是RNA的5'末端。5'帽 结构的进一步实例包括甘油基（反转的脱氧脱碱基残基（部分））、4'，5'亚甲基核苷酸， 1-(P-D-赤呋喃糖基）核苷酸，4'-硫代核苷酸，碳环核苷酸，1，5_失水己糖醇核苷酸， L-核苷酸，a-核苷酸，修饰碱基的核苷酸，苏式-戊呋喃糖核苷酸，无环3'，4'-开环核 苷酸，无环3,4_二羟基丁基核苷酸，无环3,5二羟基戊基核苷酸，3' -3'-反向核苷酸部 分，3' -3'-反向脱碱基部分，3' -2'-反向核苷酸部分，3' -2'-反向脱碱基部分，1， 4-丁二醇磷酸酯，3'-氨基磷酸酯，己基磷酸酯，氨基己基磷酸酯，3'-磷酸酯，3'硫代磷 酸，二硫代磷酸酯，或桥接或非桥接甲基磷酸酯部分。
[0029] 细朐免疫件/细朐免疫应答：细朐免疫件典型地渉及巨噬细朐，自然杀伤细胞 (NK)，抗原特异性细胞毒性T-淋巴细胞的激活，和应答抗原时各种细胞因子的释放。更概 括地，细胞免疫性不基于抗体，而基于免疫系统细胞的激活。典型地，细胞免疫应答可以例 如特征在于激活能够在细胞（例如特定免疫细胞如树突细胞或其它细胞）中诱导凋亡的抗 原特异性细胞毒性T-淋巴细胞，将外来抗原的表位展示在其表面。此种细胞可以是病毒感 染的或细胞内细菌感染的，或展示肿瘤抗原的癌症细胞。进一步特性可以是巨噬细胞和自 然杀伤细胞的激活，使它们能够破坏病原体并刺激细胞分泌多种影响参与适应性免疫应答 和先天免疫应答的其它细胞的功能的细胞因子。
[0030] 是脱氧核糖核酸的常见缩写。其是核酸分子，即由核苷酸组成的聚合 物。这些核苷酸通常是脱氧腺苷单磷酸酯，脱氧胸苷单磷酸酯，脱氧鸟苷单磷酸酯和脱氧胞 苷单磷酸酯单体，其本身由糖部分（脱氧核糖），碱基部分和磷酸酯部分构成，并通过特征 骨架结构聚合。所述骨架结构典型地通过第一个相邻单体的核苷酸的糖部分，即脱氧核糖 和第二个相邻单体的磷酸酯部分之间的磷酸二酯键形成。单体的特定顺序，即与糖/磷酸 酯-骨架连接的碱基的顺序，被称为DNA-序列。DNA可以是单链或双链的。在双链形式中， 第一链的核苷酸典型地与第二链的核苷酸例如通过A/T-碱基配对和G/C碱基配对杂交。
[0031] 表位：表位(也称为'抗原决定簇'）可以在T细胞表位和B细胞表位相区别。本 发明范围内的蛋白的T细胞表位或蛋白部分可以包含片段，所述片段优选具有约6至约20 或甚至更多个氨基酸的长度，例如如由I类MHC分子加工和呈递的片段，优选具有约8至约 10个氨基酸，例如8,9,或10,（或甚至11，或12个氨基酸）长度，或由II类MHC分子加工 和呈递的片段，优选具有约13或更多个氨基酸，例如13,14,15,16,17,18,19, 20或甚至更 多个氨基酸的长度，其中这些片段可以选自氨基酸序列的任何部分。这些片段典型地由肽 片段和MHC分子组成的复合物形式的T细胞识别，即所述片段典型地不以其天然形式被识 另|J。B细胞表位典型地是位于如本文限定的（天然）蛋白或肽抗原的外表面的片段，优选具 有5至15个氨基酸，更优选具有5至12个氨基酸，甚至更优选具有6至9个氨基酸，其可 以即以其天然形式被抗体识别。
[0032] 此外蛋白或肽的此种表位可以选自任何本文提到的此种蛋白或肽的变体。在此种 情况下抗原决定簇可以是由如本文限定的蛋白或肽氨基酸序列不连续的，但在三维结构中 汇集在一起的蛋白或肽片段构成的构象或不连续表位或由单一多肽链构成的连续或线性 表位。
[0033] 序列片段：序列片段可以典型地是例如核酸分子或氨基酸序列的全长序列的较短 部分。因此，典型地，片段由与全长序列内相应一段相同的序列组成。本发明范围内优选的 序列片段，由与所述片段源自的分子中连续段实体对应的连续段的实体，如核苷酸或氨基 酸组成，其代表所述片段源自的总（即全长）分子的至少20 %，优选至少30 %，更优选至少 40 %，更优选至少50 %，甚至更优选至少60 %，甚至更优选至少70 %，和最优选至少80 %。
[0034] G/C修饰的：G/C_修饰的核酸可以典型地是核酸，优选如本文限定的人工核酸分 子，其基于优选包含与野生型序列相比增加的鸟苷和/或胞嘧啶核苷酸数量的修饰的野生 型序列。此种增加的数量可以通过用含有鸟苷或胞嘧啶核苷酸的密码子置换含有腺苷或胸 苷核苷酸的密码子产生。如果富集的G/C含量发生在DNA或RNA的编码区，其使用遗传密 码的简并性。因此，所述密码子置换优选不改变编码的氨基酸残基，但仅增加核酸分子的G/ C含量。
[0035] 基因治疗：基因治疗可以典型地理解为通过编码肽或蛋白的核酸治疗患者的身体 或患者身体的分离的组成部分，例如分离的组织/细胞。其典型地可以包括至少一个以下 步骤：a)直接将核酸，优选如本文限定的人工核酸分子通过任何施用途径施用于患者或体 外施用于患者的分离的细胞/组织，其导致体内/离体或体外转染患者的细胞；b)转录和 /或翻译引入的核酸分子；和任选地c)如果核酸未直接施用于患者，将分离、转染的细胞再 施用于患者。
[0036] 基因接种：基因接种可以典型地理解为通过施用编码抗原或免疫原或其片段的核 酸分子接种疫苗。核酸分子可以施用于受试者的身体或施用于受试者的分离的细胞。当转 染身体的某些细胞或当转染分离的细胞时，抗原或免疫原可以由那些细胞表达并随后呈递 到免疫系统，引起适应性，即抗原特异性免疫应答。因此，基因接种典型地包含至少一个以 下步骤：a)将核酸，优选如本文限定的人工核酸分子施用受试者，优选患者，或施用于受试 者，优选患者的分离的细胞，其通常导致体内或体外转染受试者的细胞；b)转录和/或翻译 引入的核酸分子；并且任选地c)如果核酸未直接施用于患者，将分离、转染的细胞再施用 于受试者，优选患者。
[0037] 异源序列：如果它们不源于相同基因，则两条序列典型地被理解为'异源的'。 艮P，尽管异源序列可以源自相同生物体，但它们天然（在自然界中）不存在于相同的核酸分 子中，如不存在于相同的mRNA中。
[0038] 体液免疫/体液免疫应答:体液免疫典型地指抗体产生和任选地指伴随抗体产生 的附加过程。体液免疫应答可以典型地特征在于，例如Th2激活和细胞因子产生、生发中心 形成和同种型转换、亲和力成熟和记忆细胞产生。体液免疫性典型地还可以指抗体的效应 功能，其包括病原体和毒素中和、经典补体激活、和吞噬作用的调理素促进和病原体清除。
[0039] 免疫原：在本发明范围内，免疫原可以典型地理解为能够刺激免疫应答的化合物。 优选地，免疫原是肽、多肽、或蛋白。在特别优选的实施方案中，从本发明的意义上说，免疫 原提供核酸分子，优选如本文限定的人工核酸分子的翻译产物。典型地，免疫原至少引起适 应性免疫应答。
[0040] 免疫刺激鉬合物：本发明范闱内，免疫刺激鉬合物可以典型地理解为含有至小一 个能够诱导免疫应答的组分或能够诱导免疫应答的组分源自的组分的组合物。此种免疫 应答可以优选为先天免疫应答或适应性和先天免疫应答的组合。优选地，本发明范围内免 疫刺激组合物含有至少一种人工核酸分子，更优选RNA，例如mRNA分子。免疫刺激组分，如 mRNA可以与合适的载体复合物。因此，所述免疫刺激组合物可以包含mRNA/载体-复合物。 此外，所述免疫刺激组合物可以包含用于免疫刺激组分，如mRNA的佐剂和/或合适的载体。
[0041] 免疫应答:免疫应答可以典型地是对特定抗原的适应性免疫系统的特异反应（所 谓特异或适应性免疫应答）或先天免疫系统的非特异反应（所谓非特异或先天免疫应答）， 或其组合。
[0042] 免疫系统：免疫系统可以保护牛物体免受感染。如果病原体成功通过生物体的物 理屏障并进入该生物体，先天免疫系统提供立即、但非特异的应答。如果病原体避开了该先 天应答，脊椎动物拥有第二层保护，适应性免疫系统。这里，免疫系统在感染过程中适应其 应答以改善其对病原体的识别。病原体被消除之后，此种改善的应答随后以免疫记忆的形 式保留，并且允许适应性免疫系统每次遭遇病原体时发起更快速和更强烈的攻击。据此，免 疫系统包含先天和适应性免疫系统。这些两部分的每个典型地含有所谓体液和细胞组分。
[0043] 免疫刺激RNA :本发明范闱内，免疫刺激RNA(isRNA)可以典型地是能够诱导先天 免疫应答的RNA。其通常不具有可读框并且因此不提供肽-抗原或免疫原，但例如通过结合 特定类型的Toll样受体（TLR)或其它合适的受体引起免疫应答。然而，当然具有可读框并 编码肽/蛋白的mRNA也可以诱导先天免疫应答并且，因此可以是免疫刺激RNA。
[0044] 先天免疫系统：先天免疫系统，也被称为非特异(non-specific)(或非特异 (unspecific))免疫系统，典型地包含以非特异的方式保护宿主免受其它生物体感染细胞和 机制。这意味着先天系统的细胞可以以一般的方式识别和响应于病原体，但不像适应性免 疫系统，它不赋予宿主持久或保护性免疫。先天免疫系统可以例如被以下各项激活=Toll 样受体（TLRs)的配体或其它辅助物质如脂多糖，TNF-a，CD40配体，或细胞因子，单核因 子，淋巴因子，白细胞介素或趋化因子，IL-1，IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8， IL-9,IL-10,IL-11，IL-12,IL-13,IL-14,IL-15,IL-16,IL-17,IL-18,IL-19,IL-20,IL-21， IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31， IL-32, IL-33， IFN-a，IFN-P，IFN-Y，GM-CSF，G-CSF，M-CSF，LT-P，TNF-a，生长因子，和 hGH，人 Toll 样 受体 TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLRlO 的配体，鼠 Toll 样受体 TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12 或 TLR13 的配体， NOD样受体的配体，RIG-I样受体的配体，免疫刺激核酸，免疫刺激RNA (isRNA)，CpG-DNA，抗 细菌剂，或抗病毒剂。根据本发明的药物组合物可以包含一种以上此种物质。典型地，先天 免疫系统的应答包括：通过产生化学因子招募免疫细胞到感染位点，所述化学因子包括专 用的化学介质，称为细胞因子；激活补体级联；通过专门的白细胞鉴别和去除器官、组织、 血液和淋巴中的外来物质；激活适应性免疫系统；和/或用作针对传染剂的物理和化学屏 障。
[0045] 克降位点：克降位点典型地理解为适于插入核酸序列，例如包含可读框的核酸序 列的核酸分子片段。插入可以通过任何本领域技术人员已知的分子生物学方法进行，例如 通过限制酶切和连接。克隆位点典型地包含一个以上限制性酶识别位点（限制性位点）。 这些一个以上限制性位点可以被在这些位点切割DNA的限制性酶识别。包含一个以上限制 性位点的克隆位点也可以称为多克隆位点（MCS)或多聚接头。
[0046] 核酸分子：核酸分子是包含核酸组分，优诜由核酸组分组成的分子。术语核酸分 子优选指DNA或RNA分子。其优选与术语"多核苷酸"同义使用。优选地，核酸分子是聚合 物包含通过糖/磷酸酯-骨架的磷酸二酯键彼此共价连接的核苷酸单体或由通过糖/磷酸 酯-骨架的磷酸二酯键彼此共价连接的核苷酸单体组成。术语"核酸分子"还包括修饰的 核酸分子，如碱基修饰的，糖修饰的或骨架修饰的等DNA或RNA分子。
[0047] 可读框：本发明范围内可读框(ORF)可以典型地是一些核苷酸三联体的序列，其 可以翻译为肽或蛋白。可读框优选在其5'末端含有起始密码子，即通常编码氨基酸甲硫氨 酸的三个连续的核苷酸的组合（ATG)，和通常呈现多个3核苷酸长度的紧接的区域。ORF优 选由终止密码子（例如，TAA，TAG，TGA)终止。典型地，这是可读框仅有的终止密码子。因 此，本发明范围内可读框优选为核苷酸序列，由可以以三个核苷酸划分的很多核苷酸组成， 其以起始密码子（例如ATG)起始并且其优选以终止密码子（例如，分别为TAA，TGA，或TAG) 终止。可读框可以是分离的或其可以被整合入更长的核酸序列，例如载体或mRNA中。可读 框还可以被称为'蛋白编码区'。
[0048] 或多肽典型地是通过肽键连接的氨基酸单体的聚合物。其典型地含有少于 50个单体单位。尽管如此，术语肽不否认为具有多于50个单体单位的分子。长肽也称为多 肽，典型地具有50到600个单体单位。
[0049] 药学有效量:本发明范围内药学有效量典型地理解为例如在病理状况下足以诱导 药学效应，如免疫应答、改变表达的肽或蛋白的病理水平、或替代缺少的基因产物的量。
[0050] 蛋白：蛋白典型地包含一个以上肽或多肽。蛋白典型地折叠为3-维形式，其可以 是蛋白发挥其生物学功能所需的。
[0051] 聚腺苷酸序列：聚腺苷酸序列，也称为聚腺苷酸尾或3'-聚腺苷酸尾，典型地理 解为例如多达约400个腺嘌呤核苷酸，例如从约20至约400,优选从约50至约400,更优选 从约50至约300,甚至更优选从约50至约250,最优选从约60至约250个腺嘌呤核苷酸的 腺嘌呤核苷酸序列。聚腺苷酸序列典型地位于mRNA的3'末端。本发明范围内，聚腺苷酸 序列可以例如通过载体的转录位于mRNA内或位于任何其它核酸分子，诸如例如，载体，例 如用作产生RNA的模板的载体，优选mRNA中。
[0052] 聚腺苷酸化:聚腺苷酸化典型地理解为向核酸分子，如RNA分子，例如未成熟mRNA 添加聚腺苷酸序列。聚腺苷酸化可以由所谓聚腺苷酸化信号诱导。该信号优选位于要被聚 腺苷酸化的核酸分子，如RNA分子，的3'末端的一段核苷酸内。聚腺苷酸化信号典型地包 含由腺嘌呤和尿嘧啶/胸腺嘧啶核苷酸组成的六聚体，优选为六聚体序列AAUAAA。其它序 列，优选六聚体序列，也是可能的。聚腺苷酸化典型地发生在前mRNA (也称为未成熟-mRNA) 的加工过程中。典型地，RNA成熟（从前mRNA到成熟mRNA)包含聚腺苷酸化的步骤。
[0053] 限制件位点：限制件位点，也称为'限制性酶识别位点'，为由限制性酶识别的核 苷酸序列。限制性位点典型地是短的，优选回文核苷酸序列，例如包含4至8个核苷酸的序 列。限制性位点优选由限制性酶特异识别。限制性酶典型地切割在此位点包含限制性位点 核苷酸序列。在双链核苷酸序列，如双链DNA序列中，限制性酶典型地切割核苷酸序列的两 条链。
[0054] RNA，mRNA :RNA是核糖核酸的常见缩写。其是核酸分子，即由核苷酸组成聚合物。 这些核苷酸通常是沿所谓骨架连接的腺苷-单磷酸酯，尿苷-单磷酸酯，鸟苷-单磷酸酯和 胞苷-单磷酸酯单体。所述骨架由第一相邻单体的糖，即核糖和第二相邻单体的磷酸酯部 分之间的磷酸二酯键形成。单体的特定连续被称为RNA-序列。通常RNA是可以通过例如 在细胞内DNA-序列的转录可获得的。真核细胞中，转录典型地在细胞核或线粒体中进行。 在体内，DNA的转录通常产生所谓的未成熟RNA，其必须被加工为所谓的信使-RNA，通常简 写为mRNA。例如在真核生物体中，未成熟RNA的加工包含多种不同转录后修饰如剪接、5' 加帽、聚腺苷酸化、从细胞核或线粒体输出等。这些过程的总和也称为RNA的成熟。成熟信 使RNA通常提供可以被翻译为特定肽或蛋白氨基酸序列的核苷酸序列。典型地，成熟mRNA 包含5'帽、5' UTR、可读框、3' UTR和聚腺苷酸序列。除了信使RNA外，一些非编码RNA 类型存在，其可以参与调节转录和/或翻译。
[0055] 核酸分子序列：核酸分子序列典型地理解为特定和独特顺序，即其核苷酸的连续。 蛋白或肽序列典型地理解为该顺序，即其氨基酸的连续。
[0056] 序列同一性：如果它们呈现相同长度和顺序的核苷酸或氨基酸，则两条以上序列 相同。同一性百分数典型地描述两条序列相同的程度，即其典型地描述与参考序列的相同 核苷酸在其序列位置上对应的核苷酸的百分数。为了确定同一性程度，要比较的序列被认 为是呈现相同长度，即要比较的序列的最长序列长度。这意为由8个核苷酸组成的第一序 列与包含第一序列的由10个核苷酸组成的第二序列80%相同。换句话说，本发明范围内， 序列同一性优选指具有相同长度的两条以上序列中具有相同位置的序列核苷酸的百分数。 通常将缺口认为是不相同的位置，而不考虑其在比对中的真正位置。
[0057] 稳定的核酸分子：稳定的核酸分子是被修饰从而其对例如由环境因素或酶消化, 如由核酸外切酶或核酸内切酶降解导致的分解或降解比无修饰的核酸分子更稳定的核酸 分子，优选DNA或RNA分子。优选地，本发明范围内，稳定的核酸分子在细胞，如原核或真核 细胞中，优选在哺乳动物细胞，如人细胞中稳定。稳定效应也可以在细胞外，例如在缓冲溶 液等中，例如在包含所述稳定的核酸分子的药物组合物的制造过程中发挥。
[0058] 转染：术语,转染'指将核酸分子，如DNA或RNA (例如mRNA)分子引入细胞，优选 引入真核细胞。在本发明范围内，术语'转染'包括本领域技术人员已知的用于将核酸分 子引入细胞，优选引入真核细胞，如引入哺乳动物细胞的任何方法。此种方法包括例如，电 穿孔、例如基于阳离子脂质和/或脂质体的脂转染、磷酸钙沉淀、基于纳米粒子的转染、基 于病毒的转染、或基于阳离子聚合物（如DEAE-葡聚糖或聚乙烯亚胺）的转染等。优选，所 述引入是非病毒的。
[0059] 疫苗：疫苗典型地理解为提供至少一种抗原，优选免疫原的预防或治疗材料。所述 抗原或免疫原可以源自任何适于接种的材料。例如，所述抗原或免疫原可以源自病原体，如 源自细菌或病毒粒子等，或源自肿瘤或癌症组织。所述抗原或免疫原刺激身体的适应性免 疫系统以提供适应性免疫应答。
[0060] 载体：术语'载体'指核酸分子，优选指人工核酸分子。在本发明范围内，载体适 于整合或包含所需核酸序列，如包含可读框的核酸序列。此种载体可以是储存载体、表达载 体、克隆载体、转移载体等。储存载体是允许方便储存核酸分子（例如mRNA分子）的载体。 因此，所述载体可以包含对应于例如所需mRNA序列或其部分的序列，如对应于mRNA的可读 框和3' UTR的序列。表达载体可以用于生产表达产物诸如RNA(例如mRNA)、或肽、多肽 或蛋白。例如，表达载体可以包含载体的一段序列，如启动子序列（例如RNA启动子序列） 的转录所需的序列。克隆载体典型地是含有可以用于将核酸序列并入载体的克隆位点的载 体。克隆载体可以是，例如质粒载体或噬菌体载体。转移载体可以是适于将核酸分子转移入 细胞或生物体的载体，例如，病毒载体。在本发明范围内，载体可以是，例如RNA载体或DNA 载体。优选地，载体是DNA分子。优选地，在本申请的意义中的载体包含克隆位点、选择标 记（如抗生素抗性因子）、和适于载体倍增的序列，如复制起点。优选地，本申请范围内的载 体是质粒载体。
[0061] 赋形剂（vehicle):赋形剂典型地理解为话于储存、转运、和/或施用化合物，如药 学活性化合物的材料。例如，其可以是生理学可接受的适于储存、转运、和/或施用药学活 性化合物的液体。
[0062] 3'-非翻译区（3' UTR) :3' UTR典型地是mRNA的部分，其位于mRNA的蛋白编 码区（可读框（ORF)或编码序列（CDS))和聚腺苷酸序列之间。mRNA的3' UTR不翻译为 氨基酸序列。3' UTR序列通常由在基因表达过程中被转录为各自的mRNA的基因编码。基 因组序列首先转录为包含任选内含子的未成熟mRNA。未成熟mRNA随后在成熟过程中进一 步被加工为成熟mRNA。该成熟过程包含以下步骤：5'加帽、剪接未成熟mRNA以切除任选 内含子和3'末端修饰（如未成熟II1RNA3'末端的聚腺苷酸化和任选的核酸内切酶或核酸 外切酶切割等）。在本发明范围内，3' UTR对应于成熟mRNA中位于蛋白编码区的终止密码 子的3'的序列，优选紧接着蛋白编码区的终止密码子的3'，并且其延伸至聚腺苷酸序列的 5'-端侧，优选至紧接着聚腺苷酸序列的5'的核苷酸。术语"对应于"意为3' UTR序列可 以是如用于限定3' UTR序列的mRNA序列中的RNA序列，或对应于此RNA序列的DNA序列 中。在本发明范围内，术语"基因的3' UTR"，如"白蛋白基因的3' UTR"，为对应于源自该 基因的成熟mRNA的3' UTR的序列，所述成熟mRNA即通过基因转录和未成熟mRNA的成熟 获得的mRNA。术语"基因的3' UTR"包括3' UTR的DNA序列和RNA序列。
[0063] 在第一个方面，本发明涉及一种人工核酸分子，所述人工核酸分子包含
[0064] a?至少一个可读框（ORF);和
[0065] b.至少一个3'-非翻译区元件（3' UTR元件），所述3'-非翻译区元件包含 以下或由以下组成：源自白蛋白基因的3' UTR或源自白蛋白基因3' UTR的变体的核酸序 列。
[0066] 术语"3' UTR元件"指包含以下或由以下组成的核酸序列：源自3' UTR或3' UTR 变体的核酸序列。'3' -UTR元件'优选指表示人工核酸序列，比如人工mRNA的3' UTR， 或编码人工核酸分子的3' UTR的核酸序列。因此，从本发明的意义上，优选地，3' UTR元 件可以是mRNA，优选人工mRNA的3' UTR，或其可以是mRNA 3' UTR的转录模板。因此， 3' UTR元件优选为对应于mRNA的3' UTR，优选对应于人工mRNA，比如通过转录遗传工程 载体构建体获得的mRNA的3' UTR的核酸序列。优选地，从本发明的意义上3' UTR元件 作为3' UTR行使功能或编码执行3' UTR功能的核苷酸序列。
[0067] 优选地，所述至少一个可读框和所述至少一个3' UTR元件是异源的。在该情况 下，术语"异源的"意为所述可读框和所述3' UTR元件不以该组合天然存在（自然界中）。 优选地，所述3' UTR元件源自除所述可读框外的不同基因。例如，所述ORF可以源自除 3' UTR元件外的不同基因，所述基因例如编码不同蛋白或相同蛋白但是为不同物种的等。 优选地，所述可读框不编码人白蛋白，优选所述可读框不编码白蛋白。优选所述可读框不编 码报道蛋白，所述报道蛋白例如，选自由珠蛋白（特别是￠-珠蛋白），荧光素酶蛋白，GFP 蛋白或其变体（例如，与珠蛋白，荧光素酶蛋白，或GFP蛋白呈现至少70%序列同一性的变 体）组成的组。特别是，在一个特定实施方案中，优选地，尤其在所述3' UTR元件源自大 鼠白蛋白3' UTR或其变体的情况下，所述可读框不编码￠-珠蛋白，或，更具体地，不编码 兔￠-珠蛋白，或其变体。此外，在一个特定实施方案中，本发明的人工核酸分子不编码信 号序列（并且因此不包含编码此信号序列的片段），其同样也指定为信号或靶向信号。此种 信号序列典型地被提供在编码的氨基酸序列的5'末端。特别是，本发明的人工核酸不编码 (人工地或天然）包含"信号氨基酸序列"的蛋白，尤其不编码引导编码的蛋白到结合于内 质网膜的多核糖体和/或将由本发明的核酸编码的研究蛋白移位跨过内质网膜的信号序 列。尤其，本发明的核酸分子的编码蛋白不包含白蛋白信号序列，更具体地不包含大鼠白蛋 白信号序列。典型地，尤其如果编码区编码珠蛋白，更具体地编码￠-珠蛋白，甚至更具体 地编码兔3 -珠蛋白，由本发明的人工核酸分子编码的蛋白也不包含乳蛋白或生长激素信 号序列。在另一个实施方案中，尤其如果编码区编码珠蛋白序列，更具体地编码￠-珠蛋白 或其变体，则本发明的人工核酸序列不含有珠蛋白5' -UTR序列，尤其不含有￠-珠蛋白 的5' -UTR序列或，更特别地，不含有兔珠蛋白5' -UTR序列。如果所述人工核酸分子含 有5' -UTR序列，可以选择这样的5' -UTR序列，其不是白蛋白基因的，尤其不是大鼠白蛋 白基因5' -UTR-序列。在本发明的人工核酸分子含有多于一个3' -UTR的情况下，其它 的3' -UTR优选不选自由珠蛋白3' -UTR和c-myc 3' -UTR组成的组。在另一个实施方 案中，尤其如果所述编码区编码珠蛋白，更具体地编码P -珠蛋白，则本发明的核酸分子的 3' UTR不对应于大鼠白蛋白3' -UTR。
[0068] 此外，特别优选所述可读框不编码人因子IX或其变体，例如，与人因子IX呈现至 少70%序列同一性的变体。尤其如果本发明的核酸分子的编码区编码人因子IX或如上文 描述的其变体，则所述核酸分子不包含白蛋白启动子，尤其具有点突变，更具体地具有G52A 点突变的白蛋白启动子。
[0069] 在另一个实施方案中，尤其如果所述编码区编码抗性基因，尤其新霉素抗性基因， 则本发明的人工核酸分子不对应于转座子元件，例如转座子质粒，或不包含转座子（尤其 不包含Tn5转座子或不包含TN5嵌合元件）。在此种条件下，本发明的核酸分子不能与转座 酶，尤其不能与Tn5转座酶功能性相互作用。从功能上说，本发明的核酸分子将典型地不在 核酸（因为本发明的人工核酸不包含转座子）和特异于任何转座子的转座酶之间形成复合 物。尤其如果本发明的核酸分子功能性地与转座酶相互作用，则本发明的核酸分子的编码 区（ORF)不编码siRNA。
[0070] 在此情况下，在一个特定实施方案中，特别是假如所述可读框编码人因子IX或其 变体，特别优选所述可读框不包含内含子。
[0071 ] 此外，在此情况下，在一个特定实施方案中，尤其假如所述3' UTR元件源自人白 蛋白3' UTR或其变体，则优选所述可读框不编码人因子IX或其变体。
[0072] 作为本发明的特定实施方案，本发明的人工核酸分子不是表达盒。因此，本发明的 核酸分子例如不包含3'启动子或启动子3'端。根据该实施方案，因为其不包含信号序 列，并且优选的，不包含3'启动子，本发明的核酸分子也不是"分泌盒"。尤其本发明的核 酸分子由单个包含ORF和3' UTR区和任选地5' UTR区的核酸分子构成。因此，本发明 的核酸分子不对应于由多于一个分离的遗传元件构成的分泌盒，尤其不对应于代表编码区 (ORF)上游区域的第一遗传元件和分离的代表ORF下游区域的第二遗传元件，所述遗传原 件其各自例如作为试剂盒的部件被提供。
[0073] 优选地，所述至少一个3' UTR元件功能上连接于所述0RF。这优选意为所述 3' UTR元件与ORF相关联，从而其可以发挥功能，比如对ORF表达的稳定功能或对人工核 酸分子的稳定功能。优选地，所述ORF和所述3' UTR元件在5' -3'方向上相关联。因 此，优选地，所述人工核酸分子包含结构5' -ORF-(任选的）接头-3' UTR元件-3'，其中 所述接头可以存在或缺失。例如，所述接头可以是一个以上核苷酸，比如例如，包含一种以 上限制性酶识别位点（限制位点）或由一种以上限制性酶识别位点（限制位点）组成的一 段1-50或1-20的核苷酸。
[0074] 优选，所述至少一个3' UTR元件包含以下或由以下组成：源自脊椎动物白蛋白基 因的3' UTR或源自其变体，优选选自哺乳动物白蛋白基因的3' UTR比如例如小鼠白蛋白 基因，绿狒狒（Olive baboon)白蛋白基因或人白蛋白基因的3' UTR或源自其变体的核酸 序列。更优选所述至少一个3' UTR元件包含以下或由以下组成：源自灵长类白蛋白基因， 特别是人白蛋白基因或绿狒狒（Olive baboon)白蛋白基因的3' UTR或源自其变体，甚至 更优选源自根据GenBank登录号NM_000477. 5的人白蛋白基因的3' UTR或源自其变体的 核酸序列。在一个优选的实施方案中，所述3' UTR元件不源自非洲爪蟾（Xenopus)白蛋白 基因的3' UTR。优选地，所述3' UTR元件不包含非洲爪蟾（Xenopus)白蛋白基因3' UTR 的聚腺苷酸限制元件B (PLEB)。优选地，所述3' UTR元件不由非洲爪蟾（Xenopus)白蛋白 基因3' UTR的PLEB组成。
[0075] 术语"源自[…]白蛋白基因3' UTR的核酸序列"优选指基于白蛋白基因的 3' UTR序列或基于其片段或部分的核酸序列。该术语包括对应于白蛋白基因的完整 3' UTR序列，即全长3' UTR序列的序列，和对应于白蛋白基因3' UTR序列片段的序列。 优选地，白蛋白基因3' UTR的片段由与白蛋白基因的全长3' UTR中一段连续的核苷酸对 应的一段连续核苷酸组成，其代表白蛋白基因的全长3' UTR的至少20%，优选至少30%， 更优选至少40 %，更优选至少50 %，甚至更优选至少60 %，甚至更优选至少70 %，甚至更优 选至少80 %，和最优选至少90 %。从本发明的意义上，此种片段，优选为如本文描述的功能 性片段。术语"白蛋白基因的3' UTR"优选指天然存在的白蛋白基因的3' UTR。
[0076] 在白蛋白基因的3' UTR的范畴内，术语"白蛋白基因3' UTR的变体"和"其变体" 指天然存在的白蛋白基因3' UTR的变体，优选指脊椎动物白蛋白基因3' UTR的变体，更 优选指哺乳动物白蛋白基因的3' UTR比如小鼠白蛋白基因的3' UTR的变体，甚至更优选 指如上文描述的灵长类白蛋白基因，尤其是人白蛋白基因或绿狒狒（Olive baboon)白蛋白 基因的3' UTR的变体。此种变体可以是修饰的白蛋白基因3' UTR。例如，与变体源自的 天然存在的3' UTR相比，变体3' UTR可以呈现一个以上核苷酸缺失、插入、添加和/或置 换。优选地，白蛋白基因3' UTR的变体与所述变体源自的天然存在的3' UTR至少40%， 优选至少50 %，更优选至少60 %，更优选至少70 %，甚至更优选至少80 %，甚至更优选至少 90%，最优选至少95%相同。优选地，所述变体是如本文描述的功能性变体。
[0077] 术语"源自白蛋白基因3' UTR的变体的核酸序列"优选指基于如上文描述的白 蛋白基因3' UTR序列的变体或基于其片段或部分的核酸序列。该术语包括对应于白蛋白 基因3' UTR的变体的完整序列，即白蛋白基因的全长变体3' UTR序列的序列，和对应于 白蛋白基因的变体3' UTR序列片段的序列。优选地，白蛋白基因3' UTR的变体片段由 与全长白蛋白基因3' UTR的变体中一段连续核苷酸对应的一段连续核苷酸组成，其代表 全长白蛋白基因3 ' UTR的变体的至少20 %，优选至少30 %，更优选至少40 %，更优选至 少50 %，甚至更优选至少60 %，甚至更优选至少70 %，甚至更优选至少80 %，和最优选至少 90%。从本发明的意义上，此种变体片段，优选为如本文描述的变体的功能性片段。
[0078] 在本发明范围内，术语'功能性变体功能性片段'，和'变体的功能性片 段'（也称为'功能性变体片段'），意为白蛋白基因的3' UTR的片段，3' UTR的变体， 或3' UTR的变体的片段执行变体、片段、或变体的片段源自的白蛋白基因的天然存在的 3' UTR的至少一个，优选多于一个功能。此种功能可以是优选在哺乳动物细胞，如人细胞 中，例如，稳定mRNA和/或稳定和/或延长mRNA蛋白生产和/或增加mRNA的单白表达或 总蛋白生产。尤其优选本发明范围内的变体、片段、和变体片段与包含参考3' UTR或缺少 3' UTR的mRNA相比优选在哺乳动物细胞（如人细胞）中执行稳定mRNA功能，和/或与包 含参考3' UTR或缺少3' UTR的mRNA相比优选在哺乳动物细胞，如人细胞中执行稳定和/ 或延长mRNA的蛋白生产的功能，和/或与包含参考或参考3' UTR或缺少3' UTR的mRNA 相比优选在哺乳动物细胞，如人细胞中执行增加来自mRNA的蛋白生产的功能。参考3' UTR 可以是例如，天然与ORF组合存在的3' UTR。此外，与所述变体，所述片段，或所述变体片 段源自的野生型3' UTR相比，白蛋白基因3' UTR的功能性变体，功能性片段，或功能性变 体片段优选不具有对包含3' UTR的此种变体、片段，或变体片段的mRNA的翻译效率显著减 弱的效应。在本发明范围内，白蛋白基因的3' UTR的"功能性片段"、"功能性变体"或"变 体的功能性片段"的尤其优选的功能是通过表达携带如上文描述的功能性片段、功能性变 体或变体的功能性片段的mRNA来稳定和/或延长蛋白生产。
[0079] 优选地，由功能性变体，功能性片段，或功能性变体片段发挥的一个以上功能的效 率，如mRNA和/或蛋白生产稳定效率和/或蛋白生产增加效率，为由所述变体，片段或变体 片段源自的天然存在的白蛋白基因3' UTR呈现的mRNA和/或蛋白生产稳定效率和/或蛋 白生产增加效率的至少40 %，更优选至少50 %，更优选至少60 %，甚至更优选至少70 %，甚 至更优选至少80 %，最优选至少90 %。
[0080] 在本发明的情况下，白蛋白基因的3' UTR或白蛋白基因3' UTR的变体的片段 优选呈现至少约50个核苷酸，优选至少约75个核苷酸，更优选至少约100个核苷酸，甚至 更优选至少约125个核苷酸，最优选至少约150个核苷酸的长度。优选地，白蛋白基因的 3' UTR或白蛋白基因3' UTR的变体的此种片段是如上文描述的功能性片段。
[0081] 优选地，根据本发明的人工核酸分子的至少一个3' UTR元件包含以下或由以下 组成：白蛋白基因的3' UTR的"功能性片段"，"功能性变体"或"变体的功能性片段"。
[0082] 优选地，与各自的缺少3' UTR或包含参考3' UTR(如天然与ORF组合存在的 3' UTR)的相应mRNA(参考mRNA)相比，根据本发明的人工核酸分子的至少一个3' UTR 元件增加人工核酸分子的稳定性，例如增加根据本发明的mRNA的稳定性。优选地，与缺少 3' UTR或包含参考3' UTR(如天然与ORF组合存在的3' UTR)的相应mRNA相比，根据本 发明的人工核酸分子的至少一个3' UTR元件增加来自根据本发明的人工核酸分子，例如 来自本发明的mRNA的蛋白生产的稳定性。优选地，与缺少3' UTR或包含参考3' UTRjB 天然与ORF组合存在的3' UTR的各自mRNA相比，根据本发明的人工核酸分子的至少一个 3' UTR元件延长根据本发明的人工核酸分子，例如根据本发明的mRNA的蛋白生产。优选 地，与缺少3' UTR或包含参考3' UTR，如天然与ORF组合存在的3' UTR的各自mRNA相 t匕，根据本发明的人工核酸分子的至少一个3' UTR元件增加根据本发明的人工核酸分子， 例如根据本发明的mRNA的蛋白生产。优选地，与缺少3' UTR或包含参考3' UTR，如天然 与ORF组合存在的3' UTR的各自mRNA的翻译效率相比，根据本发明的人工核酸分子的至 少一个3' UTR元件不负面影响mRNA的翻译效率。在此种情况下，术语"各自的mRNA"意 为除了不同3' UTR之外，参考mRNA是与包含本发明的3' UTR元件的mRNA可比的，优选 相同的。
[0083] 术语"稳定和/或延长"人工核酸分子比如人工mRNA的"蛋白生产"优选意为优选 在哺乳动物表达系统，比如HeLa或HDF细胞中，与例如包含参考3' UTR或缺少3' UTR的 参考核酸分子比如参考mRNA的蛋白生产相比，人工核酸分子比如人工mRNA的蛋白生产被 稳定和/或延长。因此，与对于从参考核酸分子生产的蛋白可以看到的相比，可以更长时期 观测到从人工核酸分子比如人工mRNA生产的蛋白。换句话说，随时间测量的从所述人工核 酸分子比如所述人工mRNA生产的蛋白量比随时间测量的从参考核酸分子比如参考mRNA生 产的蛋白量在更晚的时间降到（undercut)阈值以下。此阈值可以是例如，在表达的初始阶 段，比如表达起始后，比如转染核酸分子后1，2, 3,4, 5,或6小时中测量的蛋白量（图17)。
[0084] 例如，在哺乳动物表达系统，比如哺乳动物细胞，例如HeLa或HDF细胞中，与参 考核酸分子，比如参考mRNA的蛋白生产相比，所述人工核酸分子比如人工mRNA的蛋白生 产-以至少在表达起始阶段，比如表达起始后，比如转染核酸分子后1，2, 3,4, 5,或6小时中 观察到的量-以至少约5小时，优选至少约10小时，更优选至少约24小时延长。因此，根 据本发明的人工核酸分子优选允许与缺少3' UTR或包含参考3' UTR的参考核酸分子相 比，以至少在表达的起始阶段，比如表达起始后，比如转染后1，2, 3,4, 5,或6小时中观察到 的量，以至少约5小时，优选至少约10小时，更优选至少约24小时的延长的蛋白生产。
[0085] 在优选的实施方案中，与缺少3' UTR或包含参考3' UTR的参考核酸分子的蛋白 生产相比，根据本发明的人工核酸分子的蛋白生产被延长至少1. 5倍，优选至少2倍，更优 选至少2. 5倍。
[0086] 可以通过以下各项确定该延长蛋白生产的效果（i)随时间优选在哺乳动物表达 系统比如HeLa或HDF细胞中测量例如通过表达编码报道蛋白比如荧光素酶的ORF获得的 蛋白量，（ii)确定蛋白量降低到（undercut)例如在表达起始后1，2, 3,4, 5,或6小时，例如 转染所述人工核酸分子后1，2,3,4,5，或6小时观察到的蛋白量以下的时间点，和（1^)将 蛋白量降低到（undercut)表达起始后1,2, 3,4, 5,或6小时观察到的蛋白量以下的时间点 与对缺少3' UTR或包含参考3' UTR的核酸分子确定的所述时间点向比较（图17)。 [0087] 优选地，在例如在48或72小时的时间间隔内，从根据本发明的人工核酸分子生产 的蛋白总量至少是从缺少3' UTR或包含参考3' UTR(比如天然与人工核酸分子的ORF存 在的3' UTR)的参考核酸分子生产的蛋白量的同时，获得对蛋白生产的该稳定和/或延长 效果。因此，本发明提供一种人工核酸分子，如上文具体说明的，在哺乳动物表达系统，比如 哺乳动物细胞，例如HeLa或HDF细胞中，所述人工核酸分子允许延长的和/或稳定的蛋白 生产，其中，例如在48或72小时的时间间隔内从所述人工核酸分子生产的蛋白总量，至少 是例如在所述时间间隔内，从缺少3' UTR或包含参考3' UTR(比如天然与人工核酸分子 存在的ORF的3' UTR)的参考核酸分子生产的蛋白总量。
[0088] 因此，"稳定的蛋白表达"优选意为在预定的时间段内，如24小时，更优选48小时， 甚至更优选72小时，与参考核酸分子，例如包含参考3' UTR或缺少3' UTR的mRNA相比， 存在根据本发明的人工核酸分子的更均一的蛋白生产。因此，例如在哺乳动物系统中，根据 本发明的包含3' UTR元件的人工核酸分子，例如根据本发明的mRNA的蛋白生产的水平，优 选不降低到对于参考核酸分子，诸如如上文描述的参考mRNA所观察到的程度。例如，表达 起始后6小时，例如将根据本发明的人工核酸分子转染入细胞，如哺乳动物细胞后6小时观 察到的蛋白量（由ORF编码），可以是与表达起始后48小时，例如转染后48小时观察到的 蛋白量可比的。因此，表达起始后48小时，例如转染后48小时观察到的由ORF编码的蛋白， 如报道蛋白，例如，荧光素酶的量，与表达起始后6小时，例如转染后6小时观察到的蛋白量 的比例，优选至少约0. 4,更优选至少约0. 5,更优选至少约0. 6,甚至更优选至少约0. 7。优 选地，对于根据本发明的核酸分子，所述比例在约0. 4和约4之间，优选在约0. 65和约3之 间，更优选在约〇. 7和约2之间。对于各自的参考核酸分子，例如包含参考3' UTR或缺少 3' UTR的mRNA，所述比例可以，例如在约0. 05和约0. 3之间。
[0089] 因此，本发明提供一种人工核酸分子，所述人工核酸分子包含如上文描述的ORF 和3' UTR元件，其中，优选在哺乳动物表达系统，比如哺乳动物细胞，例如HeLa细胞中，表 达起始后48小时观察到的（报道）蛋白量，例如荧光素酶量，与表达起始后6小时观察到 的（报道）蛋白量的比例优选高于约0.4,更优选高于约0.5,更优选高于约0.6,甚至更优 选高于约〇. 7,例如在约0. 4和约4之间，优选在约0. 65和约3之间，更优选在约0. 7和2 之间，其中优选例如在48小时的时间间隔内，从所述人工核酸分子生产的蛋白总量，至少 是例如在所述时间间隔内，从缺少3' UTR或包含参考3' UTR(比如天然与所述人工核酸 分子的ORF存在的3' UTR)的参考核酸分子生产的蛋白总量。在一个优选的实施方案中， 本发明提供一种人工核酸分子，所述人工核酸分子包含如上文描述的ORF和3' UTR元件， 其中，优选在哺乳动物表达系统，比如哺乳动物细胞，例如HeLa细胞中，表达起始后72小时 观察到的（报道）蛋白量，例如荧光素酶量与表达起始后6小时观察到的（报道）蛋白量 的比例，优选为高于约0. 4,更优选高于约0. 5,更优选高于约0. 6,甚至更优选高于约0. 7， 例如在约0. 4和1. 5之间，优选约0. 65和约1. 15之间，更优选约0. 7和I. 0之间，其中优 选例如在72小时的时间间隔内，从所述人工核酸分子生产的蛋白总量，至少是，例如在所 述时间间隔内，从缺少3' UTR或包含参考3' UTR(比如天然与人工核酸分子的ORF存在 的3' UTR)的参考核酸分子生产的蛋白总量。
[0090] 在本发明的情况下，"增加的蛋白表达"优选意为与参考分子相比在表达起始后的 一个时间点增加的蛋白表达。因此，在表达起始后，例如转染根据本发明的人工核酸分子 后，例如转染根据本发明的mRNA后的某时间点，例如转染后48或72小时观察到的蛋白水 平优选高于在表达起始后，例如转染参考核酸分子，比如包含参考3' UTR或缺少3' UTR 的参考mRNA后相同时间点观察到的蛋白水平。
[0091] 人工核酸分子的"增加的总蛋白生产"指在时间间隔中增加的蛋白生产，其中优选 在哺乳动物表达系统，比如哺乳动物细胞，例如HeLa或HDF细胞中，从人工核酸分子生产蛋 白。因此，"总蛋白生产"优选指表示随时间的蛋白生产的曲线下面积（AUC)。
[0092] 优选通过与各自的缺少3' UTR的参考核酸分子，例如缺少3' UTR的mRNA，或包 含参考3' UTR，比如天然与入上文描述的ORF存在的3' UTR的参考核酸分子相比较确定 所述人工核酸分子稳定性的增加，所述蛋白生产稳定性的增加，所述蛋白生产的延长和/ 或所述蛋白表达和/或总蛋白生产的增加。
[0093] 可以通过技术人员已知的适于此目的的任何方法确定白蛋白基因3' UTR的变 体、片段和/或变体片段的所述mRNA和/或蛋白生产稳定效应和效率和/或蛋白生产增加 效应和效率以及根据本发明的人工核酸分子的至少一个3' UTR元件的mRNA和/或蛋白 生产稳定效应和效率和/或蛋白生产增加效应和效率。例如，可以产生包含报道蛋白，比如 荧光素酶的编码序列，且不包含3' UTR，源自天然存在的白蛋白基因的3' UTR，源自参考 基因的3' UTR(S卩，参考3' UTR，比如天然与ORF存在的3' UTR)的人工mRNA分子，为白 蛋白基因3' UTR变体的3' UTR，为天然存在的白蛋白基因片段的3' UTR，或为白蛋白基 因3' UTR变体片段的3' UTR。可以例如通过体外转录各自的载体诸如例如包含17启动 子和编码各自的mRNA序列的序列的质粒载体产生此种mRNA。可以通过适于转染mRNA的 任何转染方法将产生的mRNA分子转染入细胞，例如可以将它们电穿孔入哺乳动物细胞，如 HELA细胞，并且可以在转染后某时间点，例如，转染后6小时、24小时、48小时、和72小时分 析样品。可以通过技术人员公知的方法分析所述样品的mRNA数量和/或蛋白数量。例如， 可以通过定量PCR方法确定在样品时间点细胞中存在的报道子mRNA的数量。可以例如通 过ELISA测定或依赖于使用的报道蛋白的报道子测定如荧光素酶测定，确定由各自的mRNA 编码的报道蛋白的数量。例如可以通过确定转染后48小时观察到的蛋白水平和转染后6 小时观察到的蛋白水平分析稳定蛋白表达和/或延长蛋白表达的效应。所述值越接近1， 在该时期内蛋白表达越稳定。此种测量当然也可以在72小时以上进行并且可以确定转染 后72小时观察到的蛋白水平和转染后6小时观察到的蛋白水平的比例以确定蛋白表达的 稳定性。
[0094] 优选地，根据本发明的人工核酸分子的至少一个3' UTR元件包含以下或由以下 组成：与白蛋白基因3' UTR的核酸序列，比如与如以下显示的根据SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 34 或 SEQ ID No. 35 的核酸序列具有至少 约40%，优选至少约50%，优选至少约60%，优选至少约70%，更优选至少约80%，更优选 至少约90 %，甚至更优选至少约95 %，甚至更优选至少约99 %，最优选100 %同一'丨生的核酸 序列，其中所述序列的变体（例如至少40%相同）优选为如上文描述的功能性变体：
[0095]
【权利要求】
1. 一种人工核酸分子，所述人工核酸分子包含 a. 至少一个可读框（ORF);和 b. 至少一个3'-非翻译区元件（3' UTR元件），所述3'-非翻译区元件包含源自白 蛋白基因的3' UTR或源自白蛋白基因3' UTR的变体的核酸序列， 其中，尤其在所述3' UTR元件源自大鼠白蛋白基因的3' UTR的情况下，所述可读框 优选不编码￠-珠蛋白，和 其中，尤其在所述3' UTR元件源自人白蛋白基因的3' UTR的情况下，所述可读框优 选不编码人因子IX。
2. 根据权利要求1所述的人工核酸分子，其中所述至少一个3' UTR元件稳定/延长 所述人工核酸分子的蛋白生产。
3. 根据权利要求1或2所述的人工核酸分子，其中所述至少一个3' UTR元件包含核酸 序列，所述核酸序列源自脊椎动物白蛋白基因的3' UTR或源自其变体，优选源自哺乳动物 白蛋白基因例如小鼠白蛋白基因的3' UTR或源自其变体，更优选源自灵长类白蛋白基因， 特别是人白蛋白基因或绿狒狒（Olive baboon)的白蛋白基因的3' UTR，或源自其变体，甚 至更优选源自根据GenBank登录号NM_000477. 5的人白蛋白基因的3' UTR或源自其变体。
4. 根据权利要求1-3任一项所述的人工核酸分子，其中所述至少一个3' UTR元件包 含以下或由以下组成：与根据 SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 32, SEQ ID NO. 33， SEQ ID No. 34,或SEQ ID No. 35的核酸序列具有至少约40%，优选至少约50%，优选至少约 60%，优选至少约70%，更优选至少约80%，更优选至少约90%，甚至更优选至少约95%, 甚至更优选至少约99%同一性的核酸序列，或其中所述至少一个3 ' UTR元件包含以下 或由以下组成：与根据 SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 32, SEQ ID NO. 33, SEQ ID No. 34,或SEQ ID No. 35的核酸序列具有至少约40%，优选至少约50%，优选至少约60%， 优选至少约70 %，更优选至少约80 %，更优选至少约90 %，甚至更优选至少约95 %，甚至更 优选至少约99%同一性的核酸序列的片段。
5. 根据权利要求4所述的人工核酸分子，其中所述片段呈现至少约50个核苷酸，优选 至少约75个核苷酸，更优选至少约100个核苷酸，甚至更优选至少约125个核苷酸，最优选 至少约150个核苷酸的长度。
6. 根据权利要求1-5任一项所述的人工核酸分子，其中所述至少一个3' UTR元件呈 现至少约50个核苷酸，优选至少约75个核苷酸，更优选至少约100个核苷酸，甚至更优选 至少约125个核苷酸，最优选至少约150个核苷酸的长度。
7. 根据权利要求1-6任一项所述的人工核酸分子，所述人工核酸分子进一步包含 c. 聚腺苷酸序列和/或聚腺苷酸化信号。
8. 根据权利要求7所述的人工核酸分子，其中所述聚腺苷酸化信号位于所述3' UTR 元件内。
9. 根据权利要求7或8所述的人工核酸分子，其中所述聚腺苷酸化信号包含共有序列 NN(U/T) ANA，其中 N = A 或 U，优选 AA (U/T) AAA 或 A (U/T) (U/T) AAA。
10. 根据权利要求7-9任一项所述的人工核酸分子，其中所述聚腺苷酸化信号，优选所 述共有序列NNUANA，位于3' UTR的3'端上游小于约50个核苷酸处。
11. 根据权利要求7-10任一项所述的人工核酸分子，其中所述聚腺苷酸序列具有约20 至约300个腺嘌呤核苷酸，优选约40至约200个腺嘌呤核苷酸，更优选约50至约100个腺 嘌呤核苷酸，甚至更优选约60至约70个腺嘌呤核苷酸的长度。
12. 根据权利要求1-11任一项所述的人工核酸分子，其中所述可读框不编码白蛋白， 优选不编码人白蛋白。
13. 根据权利要求1-12任一项所述的人工核酸分子，所述人工核酸分子进一步包含 5'帽结构，聚胞嘧啶序列，组蛋白茎环，和/或IRES-基序。
14. 根据权利要求1-13任一项所述的人工核酸分子，其中所述核酸包含另外的 5'-元件，优选5' UTR，启动子，或含5' UTR和启动子的序列。
15. 根据权利要求1-14任一项所述的人工核酸分子，其中所述人工核酸分子，优选所 述可读框为至少部分G/C修饰的，优选其中与野生型可读框相比，所述可读框的G/C含量增 加。
16. 根据权利要求1-15任一项所述的人工核酸分子，其中所述可读框包含密码子优化 区，优选其中所述可读框是密码子优化的。
17. 根据权利要求1-16任一项所述的人工核酸分子，所述人工核酸分子是RNA，优选为 mRNA分子。
18. -种载体，所述载体包含 a. 可读框和/或克隆位点；和 b. 至少一个3'-非翻译区元件（3' UTR元件），所述3'-非翻译区元件包含源自白 蛋白基因的3' UTR或源自白蛋白基因3' UTR的变体的核酸序列， 其中，尤其在所述3' UTR元件源自大鼠白蛋白基因的3' UTR的情况下，所述可读框 优选不编码￠-珠蛋白，并且 其中，尤其在所述3' UTR元件源自人白蛋白基因的3' UTR的情况下，所述可读框优 选不编码人因子IX。
19. 根据权利要求18所述的载体，其中所述至少一个3' UTR元件包含核酸序列或由 核酸序列组成：所述核酸序列源自脊椎动物白蛋白基因的3' UTR或源自其变体，优选源自 哺乳动物白蛋白基因例如小鼠白蛋白基因的3' UTR或源自其变体，更优选源自灵长类白 蛋白基因，特别是人白蛋白基因或绿狒狒（Olive baboon)的白蛋白基因的3' UTR，或源自 其变体，甚至更优选源自根据GenBank登录号NM_000477. 5的人白蛋白基因的3' UTR或源 自其变体。
20. 根据权利要求18或19所述的载体，其中所述至少一个3' UTR元件包含以下或由 以下组成：与根据 SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 32, SEQ ID NO. 33, SEQ ID No. 34， 或SEQ ID No. 35的核酸序列具有至少约40%，优选至少约50%，优选至少约60%，优选至 少约70 %，更优选至少约80 %，更优选至少约90 %，甚至更优选至少约95 %，甚至更优选至 少约99%同一性的核酸序列，或其中所述至少一个3' UTR元件包含以下或由以下组成：与 根据 SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 32, SEQ ID NO. 33, SEQ ID No. 34,或 SEQ ID No. 35的核酸序列具有至少约40%，优选至少约50%，优选至少约60%，优选至少约70%, 更优选至少约80 %，更优选至少约90 %，甚至更优选至少约95 %，甚至更优选至少约99 % 同一性的核酸序列的片段。
21. 根据权利要求20所述的载体，其中所述片段呈现至少约50个核苷酸，优选至少约 75个核苷酸，更优选至少约100个核苷酸，甚至更优选至少约125个核苷酸，最优选至少约 150个核苷酸的长度。
22. 根据权利要求18-21任一项所述的载体，其中所述至少一个3' UTR元件呈现至少 约50个核苷酸，优选至少约75个核苷酸，更优选至少约100个核苷酸，甚至更优选至少约 125个核苷酸，最优选至少约150个核苷酸的长度。
23. 根据权利要求18-22任一项所述的载体，所述载体进一步包含 c.聚腺苷酸序列和/或聚腺苷酸化信号。
24. 根据权利要求23所述的载体，其中所述聚腺苷酸化信号位于所述3' UTR元件内。
25. 根据权利要求23或24所述的载体，其中所述聚腺苷酸化信号包含共有序列NN (U/ T) ANA，其中 N = A 或 U，优选 AA (U/T) AAA 或 A (U/T) (U/T) AAA。
26. 根据权利要求23-25任一项所述的载体，其中所述聚腺苷酸化信号，优选所述共有 序列NNUANA，位于所述3' UTR元件的3'端上游小于约50个核苷酸处。
27. 根据权利要求23-26任一项所述的载体，其中所述聚腺苷酸序列具有约20至约 300个腺嘌呤核苷酸，优选约40至约200个腺嘌呤核苷酸，更优选约50至约100个腺嘌呤 核苷酸，更优选约60至约70个腺嘌呤核苷酸的长度。
28. 根据权利要求18-27任一项所述的载体，其中所述可读框不编码人白蛋白，优选不 编码白蛋白。
29. 根据权利要求18-28任一项所述的载体，其中所述可读框不编码人因子IX或报道 蛋白，优选不编码GFP蛋白，荧光素酶蛋白或珠蛋白，或其变体。
30. 根据权利要求18-29任一项所述的载体，所述载体进一步包含聚胞嘧啶序列，组蛋 白茎环，和/或IRES-基序。
31. 根据权利要求18-30任一项所述的载体，所述载体进一步包含5'-元件，优选 5' UTR，启动子，或含5' UTR和启动子的序列。
32. 根据权利要求18-31任一项所述的载体，所述载体是至少部分G/C修饰的，优选其 中所述可读框是至少部分G/C修饰的，优选其中与野生型可读框相比，所述可读框的G/C含 量增加。
33. 根据权利要求18-32任一项所述的载体，其中所述可读框包含密码子优化区，优选 其中所述可读框是密码子优化的。
34. 根据权利要求18-33任一项所述的载体，所述载体是DNA载体。
35. 根据权利要求18-34任一项所述的载体，所述载体是质粒载体或病毒载体，优选质 粒载体。
36. 根据权利要求18-35任一项所述的载体，所述载体包含根据权利要求1-17任一项 所述的人工核酸分子。
37. 根据权利要求18-36任一项所述的载体，所述载体是环状分子。
38. 根据权利要求37所述的载体，其中编码链的聚腺苷酸序列或3' UTR元件在 5' -3'方向上随后是用于线性化所述环状载体分子的限制位点。
39. -种细胞，所述细胞包含根据权利要求1-17任一项所述的人工核酸分子或根据权 利要求18-38任一项所述的载体。
40. 根据权利要求39所述的细胞，所述细胞是哺乳动物细胞。
41. 根据权利要求39或40所述的细胞，所述细胞是哺乳动物受试者的细胞，优选哺乳 动物受试者，优选人受试者的分离的细胞。
42. -种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-17任一项所述的人工核酸 分子，根据权利要求18-38任一项所述的载体，或根据权利要求39-41任一项所述的细胞。
43. 根据权利要求42所述的药物组合物，所述药物组合物进一步包含一种或更多药学 上可接受的稀释剂和/或赋形剂和/或一种或更多佐剂。
44. 根据权利要求1-17任一项所述的人工核酸分子，根据权利要求18-38任一项所述 的载体，根据权利要求39-41任一项所述的细胞，或根据权利要求42或43所述的药物组合 物，用作药物。
45. 根据权利要求1-17任一项所述的人工核酸分子，根据权利要求18-38任一项所述 的载体，根据权利要求39-41任一项所述的细胞，或根据权利要求42或43所述的药物组合 物，用作疫苗或用于基因治疗。
46. -种治疗或预防疾病的方法，所述方法包括将根据权利要求1-17任一项所述的人 工核酸分子，根据权利要求18-38任一项所述的载体，根据权利要求39-41任一项所述的细 胞，或根据权利要求42或43所述的药物组合物施用于需要其的受试者。
47. -种治疗或预防疾病的方法，所述方法包括用根据权利要求1-17任一项所述的人 工核酸分子或用根据权利要求18-38任一项所述的载体转染细胞。
48. 根据权利要求47所述的方法，其中在体外/离体进行细胞转染并且将转染的细胞 施用于需要其的受试者，优选施用于人患者。
49. 根据权利要求48所述的方法，其中要体外转染的细胞是所述受试者，优选所述人 患者的分离的细胞。
50. 根据权利要求46-49任一项所述的方法，所述方法是接种疫苗方法或基因治疗方 法。
51. -种稳定和/或延长核酸分子，优选mRNA分子或载体的蛋白生产的方法，所述方 法包括将所述核酸分子，优选所述mRNA分子或所述载体与3' UTR元件相关联的步骤，其 中所述3' UTR元件包含以下或由以下组成：源自白蛋白基因的3' UTR或源自白蛋白基因 3' UTR的变体的核酸序列。 52. 3' UTR元件用于稳定和/或延长核酸分子，优选mRNA分子或载体的蛋白生产的用 途，其中所述3' UTR元件包含以下或由以下组成：源自白蛋白基因的3' UTR或源自白蛋 白基因3' UTR的变体的核酸序列。
53. 根据权利要求51所述的方法或根据权利要求52所述的用途，其中所述3' UTR元 件包含核酸序列或由核酸序列组成：所述核酸序列源自脊椎动物白蛋白基因的3' UTR或 源自其变体，优选源自哺乳动物白蛋白基因例如小鼠白蛋白基因的3' UTR或源自其变体， 更优选源自灵长类白蛋白基因，尤其是人白蛋白基因或绿狒狒（Olive baboon)的白蛋白基 因的3' UTR，或源自其变体，甚至更优选源自根据GenBank登录号NM_000477. 5的人白蛋 白基因的3' UTR或源自其变体。
54. 根据权利要求51-53任一项所述的方法或用途，其中所述3' UTR元件包含以下 或由以下组成：与根据 SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 32, SEQ ID NO. 33, SEQ ID No. 34,或SEQ ID No. 35的核酸序列具有至少约40%，优选至少约50%，优选至少约60%， 优选至少约70 %，更优选至少约80 %，更优选至少约90 %，甚至更优选至少约95 %，甚至更 优选至少约99%同一性的核酸序列，或其中所述3' UTR元件包含以下或由以下组成：与 根据 SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 32, SEQ ID NO. 33, SEQ ID No. 34,或 SEQ ID No. 35的核酸序列具有至少约40%，优选至少约50%，优选至少约60%，优选至少约70%, 更优选至少约80 %，更优选至少约90 %，甚至更优选至少约95 %，甚至更优选至少约99 % 同一性的核酸序列的片段。
55. 根据权利要求54所述的方法或用途，其中所述片段呈现至少约50个核苷酸，优选 至少约75个核苷酸，更优选至少约100个核苷酸，甚至更优选至少约125个核苷酸，最优选 至少约150个核苷酸的长度。
56. 根据权利要求51-55任一项所述的方法或用途，其中所述3' UTR元件呈现至少约 50个核苷酸，优选至少约75个核苷酸，更优选至少约100个核苷酸，甚至更优选至少约125 个核苷酸，最优选至少约150个核苷酸的长度。
57. -种试剂盒或多部件的试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1-17任一项所述的 人工核酸分子，根据权利要求18-38任一项所述的载体，根据权利要求39-41任一项所述的 细胞，和/或根据权利要求42或43所述的药物组合物。
58. 根据权利要求57所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含使用说明书，转染用细胞， 佐剂，施用药物组合物的工具，药学上可接受的载体和/或用于溶解或稀释所述人工核酸 分子，所述DNA-载体或所述药物组合物的药学上可接受的溶液。
【文档编号】C12N15/67GK104220599SQ201380016594
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年3月27日 优先权日:2012年3月27日
【发明者】安德烈亚斯·特斯, 卡尔-约瑟夫·卡伦 申请人:库瑞瓦格有限责任公司