用于制备高葡萄糖糖浆的低温法
【专利摘要】本发明教导提供一种在低温下制备高葡萄糖糖浆的方法。在一些实施例中，糖浆含有减少的回生反应产物。该方法包括在低于淀粉糊化温度的温度下用一种酶共混物接触淀粉底物，该共混物包含高剂量的α-淀粉酶和低剂量的葡糖淀粉酶。在一些实施例中，使用两种葡糖淀粉酶的共混物。在一些实施例中，使用脱支酶，如支链淀粉酶。在一些实施例中，酶在不同的时间或在不同温度下分阶段添加。本发明教导提供回生产物较少、淀粉溶解度更高的高葡萄糖糖浆。
【专利说明】用于制备高葡萄糖糖浆的低温法
【技术领域】
[0001] 本公开针对用于由精制淀粉底物制备含高葡萄糖的糖浆的改进方法和组合物。
[0002] 发明背景
[0003] 在高葡萄糖糖浆大规模生产中，为提高质量和工艺经济性，过去多年采取了大 量工艺优化措施（T. W. Martin和Brumm，P. J 1992淀粉水解产物中的"淀粉水解产物用 商用酶"：全球技术，生产及应用，第45-77页，纽约，VCH出版有限公司（T.W. Martin and Brumm, P. J 1992 "Commercial enzymes for starch hydrolysis products，'in Starch Hydrolysis Products:Worldwide Technology, production and applications 45~77New York, VCH Publishers, Inc.) ;Luenser，S. J，1983,工业甜味剂生产用微生物酶，《微生物 学档案》第 24 卷，第 79-96 页（Luenser, S. J, 1983Microbial enzymes for Industrial sweetener production, Dev. in Ind. Microbiol. 24. 79-96))〇
[0004] 适用于酶液化工艺的另外的工业生产过程在淀粉甜味剂行业得到采用（美国专 利5, 322, 778)。一些这些流程中包括对蒸汽要求较低的低温工艺（105-1KTC下进行5-8 分钟）和高温工艺（148°C+/-5C进行8-10秒），这样就改善了由于过滤性能和液化淀粉 底物质量的提高而导致的淀粉颗粒糊化（Shetty等人，（1988)谷物食品世界第33卷，第 929-934 页（Shetty，et al·，（1988) Cereal Foods World 33:929-934))。液化工艺的进一 步改进已通过热稳定α淀粉酶的多次加入得以证明，其中预处理和后喷射蒸煮步骤使回 生淀粉在产量损失、加工成本、能耗、pH值调整，温度阈值，需钙量和等级方面均得到显著改 进。
[0005] 上世纪50年代后期，黑曲霉生产葡糖淀粉酶实现商业化生产，在pH值为4. 0-5. 0 和温度为20_65°C情况下，这些酶能显著提高溶解化/液化淀粉底物向葡萄糖的转化率。商 用葡萄糖糖浆通常由淀粉在两种不同pH条件下的两步酶解法以高产量产生，这是由于液 化和糖化的酶体系的pH值稳定性的差异。在这种"常规方法"中，水解产物的pH值降低至 pH 4. 0-4. 6,以适应于来自真菌源的葡糖淀粉酶的最佳pH值，即黑曲霉或里氏木霉（例如 OPTIDEX? L-400，G-ZYMEU 480 乙醇，来自丹尼斯克-杰能科（Danisco-Genencor) 的GC 147)将低DE底物转换为葡萄糖。葡糖淀粉酶是一种外切作用酶，从淀粉底物的非还 原末端中分步释放葡糖基残基。葡糖淀粉酶对高分子量淀粉具有较高的亲和力，这导致，随 着寡糖分子量的降低，淀粉水解速率也迅速降低。此外，代表了 80%以上淀粉的支链淀粉 包含通过α 1-6糖苷键连接线性直链淀粉的分支点。市售的葡糖淀粉酶在高分子量淀粉 底物中水解α 1-4糖苷键极快，并且随着寡糖分子量降低水解速度下降（Km增加）。这就 需要较高剂量的葡糖淀粉酶和/或更长的糖化时间用于完成水解。众所周知，支链淀粉中 α 1-6 (分支）键的水解速率相比葡糖淀粉酶的α 1-4糖苷键的水解速率要慢得多。甚至尽 管淀粉仅包含3. 5%至4. 0%的α 1-6键，通过葡糖淀粉酶对液化淀粉的水解的抗性仍然非 常显著。支链淀粉酶（脱支酶）在上世纪80年代中期引入，该酶能非常特异性地催化支链 淀粉中分支点的水解，导致葡萄糖生产效率的显著提高。例如，通过糖化过程中引入耐酸、 耐热的脱支酶（例如，来自丹尼斯克-杰能科的OPTIMAX" L-1000和来自诺维信有限 公司（Novozymes Inc.)的Promozyme 1[JDextrozymeK共混物），可实现葡萄糖生产 工艺的显著改善
[0006] 与可溶性淀粉底物的葡糖淀粉酶催化相关的另一个问题是，大多数糖化时间（超 过70%)都被用来将葡萄糖产量从85%提高到96%。这主要是由于葡糖淀粉酶难以水解 低分子量的可溶性寡糖（如DP2、DP3和DP4等等），因此就需要相对高剂量的葡糖淀粉酶 或更长的糖化时间才能最大化葡萄糖产量。
[0007] 要实现产业化生产，仍然需要提高生产率，改进质量，降低蒸发能耗。例如，通常 使用干燥固形物含量大于35 %的淀粉浆料进行液化，但是液化的淀粉底物还必须进一步 稀释，以降低溶解的固形物（例如要获得大于95. 5%的葡萄糖产量，就需要32%用于糖 化）。这种材料通过蒸发浓缩，精制并加工成高葡萄糖糖浆，结晶右旋糖或高果糖糖浆的成 品（Habeda，RE;In Kirk-Othmer化学技术百科全书"第22卷，第三版，约翰威利国际出版 公司，纽约 1983,第499-522页（Habeda，R.E;In Kirk-〇thmer Encyclopedia of Chemical Technologylol 22, Third Edition. John Wiley&Sons，Inc. New Yorkl983，pp 499-522))。 此外，产业化生产在产量损失、加工成本、降低能耗、pH值调整以及减少糖化过程中从回生 淀粉产生蓝色囊的高风险等方面仍需改进。已经建议利用颗粒淀粉水解酶组合物实现未蒸 煮过的淀粉/颗粒淀粉的直接转换。例如美国专利No. 4, 618, 579 (Dwiggins等人；1986 ;) 和美国专利No. 7, 303, 899 (Baldwin ;等人2007)公开了一种使用颗粒淀粉制备高葡萄糖 糖楽的生产工艺，用含有灰腐质霉（Humicola grisea)葡糖淀粉酶和嗜热脂肪芽孢杆菌 (Bacillus stearothermophilus)液化的α-淀粉酶的组合物，未经喷射蒸煮制备而得。
[0008] 葡萄糖制造商一直在坚持不懈地设法在溶解固形物含量较高条件下进行糖化，以 此减少蒸发能耗，并提高工厂生产能力。众所周知，在溶解固形物含量较高条件下进行糖化 (例如溶解固形物含量为32% DS或更高）能促进葡糖淀粉酶催化的回生反应，并使支链糖 不易因被葡糖淀粉酶水解而积累。这会降低葡萄糖产量。由葡糖淀粉酶催化的回生反应将 提高DP2糖水平，其中包含异麦芽糖、曲二糖和黑曲霉糖。以下三大因素影响这些DP2糖的 水平：干固形物含量、葡萄糖浓度和葡糖淀粉酶剂量。这些回生反应产物的形成不仅导致产 品产量降低，还会影响最终产品的质量。
[0009] 淀粉底物的低效液化通常导致糖化的淀粉底物中较高的回生淀粉。该回生淀粉在 通过常规糖化酶（例如葡糖淀粉酶或含支链淀粉酶的葡糖淀粉酶共混物）转化时是抗水解 的，从而生成碘阳性葡萄糖糖浆（通常称为"蓝囊"）。碘阳性葡萄糖糖浆因其有关加工和 功能方面的问题，在商业生产中并未广泛接受。
[0010] 总之，要满足未能满足的商业需求，就仍需对淀粉底物转化为高葡萄糖的传统方 法加以改进，其中包括：取消加入硫酸调节pH值，从而一步将颗粒淀粉转化为高葡萄糖糖 浆，其所含的回生反应产物减少；取消糖化前减除剩余液化α-淀粉酶活性的步骤，从而生 产DP3含量低的葡萄糖糖浆成品；以及，以高溶解固形物含量水解淀粉底物，从而减少葡糖 淀粉酶催化的回生反应产物的水平。
[0011] 所有专利、专利申请、出版物、文献、核苷酸和蛋白质序列数据库登录号、其参考序 列以及本文中引用的文章均以引用方式全文纳入本文。
【发明内容】
[0012] 本发明教导提供一种由精制颗粒淀粉浆料制备葡萄糖糖浆的方法，该方法包括： 以处于或低于初始淀粉糊化温度的温度，使所述精制颗粒淀粉浆液和至少8AAU/gds剂量 的α -淀粉酶以及〇. 〇5GAU/gds至不超过0. 3GAU/gds剂量的葡糖淀粉酶接触，并制得葡萄 糖糖浆。
[0013] 本发明还提供其他方法以及组合物。
[0014] 附图简述
[0015] 图1描述了本发明教导的方法（菱形）相对于常规方法（正方形）产生的较低 DP2水平。
【具体实施方式】
[0016] 本发明提供，特别是，一种由精制颗粒淀粉浆料制备葡萄糖糖浆的方法，该方法包 括：以低于淀粉糊化温度的温度，使精制颗粒淀粉浆液和至少8AAU/gds剂量的α -淀粉酶 以及0. 05GAU/gds至不超过0. 3GAU/gds剂量的葡糖淀粉酶接触，并制得葡萄糖糖浆。
[0017] 在一些实施例中，葡萄糖糖浆包括至少90%的DPI。
[0018] 在一些实施例中，至少80%的精制颗粒淀粉为溶解的。
[0019] 在一些实施例中，葡萄糖糖浆包含少于3 %的DP2。
[0020] 在一些实施例中，精制颗粒淀粉浆液包含31% -44%或33-37%的初始DS。
[0021] 在一些实施例中，葡糖淀粉酶包括葡糖淀粉酶的混合物，该混合物包含快速水解 葡糖淀粉酶和低逆转葡糖淀粉酶。
[0022] 在一些实施例中，快速水解葡糖淀粉酶为腐质霉葡糖淀粉酶和与其97 %相同的分 子，并且低逆转葡糖淀粉酶为黑曲霉（A. Niger)葡糖淀粉酶和与其97%相同的分子。
[0023] 在一些实施例中，本发明教导的方法中还包括用支链淀粉酶处理。
[0024] 在一些实施例中，支链淀粉酶，如果存在，其剂量为0. 2ASPU/gds。在一些实 施例中，支链淀粉酶剂量为〇. 15-0. 25ASPU/gds。在一些实施例中，支链淀粉酶剂量为 0.1-0. 3ASPU/gds〇
[0025] 在一些实施例中，支链淀粉酶，如果存在，其为Bacillus deramificans支链淀粉酶 和与其97%相同的分子。
[0026] 在一些实施例中，本发明教导包含分段酶解工艺。例如，在一些实施例中，第一剂 量的α-淀粉酶之后是第二剂量的α-淀粉酶，其中所述第二剂量发生在第一剂量后的 18-48小时。在一些实施例中，第一剂量的葡糖淀粉酶之后是第二剂量的葡糖淀粉酶，其中 所述第二剂量发生在第一剂量后的18-48小时。
[0027] 在一些实施例中，本发明教导包含温度分段工艺。例如，在一些实施例中，第一剂 量的α -淀粉酶在第一温度施加，并且所述第一温度在18小时至34小时之后升高2°C _8°C 到达第二温度。在一些实施例中，第一剂量的葡糖淀粉酶在第一温度施加，并且其中所述第 一温度在18小时至34小时之后升高2°C _8°C到达第二温度。
[0028] 在一些实施例中，α -淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌（B. stearothermophilus)， 解淀粉芽抱杆菌（Β· amyloliquefaciens)和地衣芽抱杆菌（Β· licheniformis)以 及与其97%相同的分子。在一些实施例中，α-淀粉酶为野生嗜热脂肪芽孢杆菌 (13.8七631'〇1:1161'1]1〇口11；[1118)，或与其97(%，98(%或99 (%相同的分子。
[0029] 在一些实施例中，葡萄糖糖浆的生产时间小于60小时。
[0030] 在一些实施例中，本发明教导提供一种组合物。例如，在一些实施例中，本发明教 导提供一种组合物，包含至少8AAU/gds的α -淀粉酶，和〇. 〇5GAU/gds至不超过0. 3GAU/ gds的葡糖淀粉酶。在一些实施例中，所述组合物进一步包含精制颗粒淀粉。在一些实施例 中，所述组合物包括支链淀粉酶。在一些实施例中，〇. 〇5GAU/gds至不超过0. 3GAU/gds的葡 糖淀粉酶包括第一葡糖淀粉酶和第二淀粉酶。
[0031] 在一些实施例中，α -淀粉酶的剂量为至少9AAU/gds.在一些实施例中，α -淀粉 酶的剂量为至少 10,11，12,13,14,15,16,17,18,19, 20, 21，22, 23, 24, 25, 30, 35,40,45, 50， 60,70,80,90，*100AAU/gds。
[0032] 在一些实施例中，葡糖淀粉酶的剂量低于0. 5GAU/gds。在一些实施例中，葡糖淀粉 酶的剂量低于 〇· 45, 0· 4, 0· 35, 0· 3, 0· 25, 2, 0· 15, 0· 1，0· 05, 0· 025,或 0· 01GAU/gds。
[0033] 在一些实施例中，葡萄糖糖浆包括至少90%的DPI。在一些实施例中，葡萄糖糖浆 包括至少 91%，92%，93%，94%，或 95% 的 DPI。
[0034] 在一些实施例中，至少80 %的精制颗粒淀粉为溶解的。
[0035] 在一些实施例中，至少 81%，82%，83%，84%，85%，86%，87%，88%，89%，或 90 %为溶解的。
[0036] 在一些实施例中，葡萄糖糖浆包括少于3 %的DP2。在一些实施例中，葡萄糖糖 浆包括少于 2. 9, 2. 8, 2. 7, 2. 6, 2. 5, 2. 4, 2. 3, 2. 2, 2. 1，2. 0,1. 9,1. 8,1. 7,1. 6,或 1. 5% 的 DP2。
[0037] 在一些实施例中，精制颗粒淀粉浆液的初始DS为31% -44%。在一些实施例中， 精制颗粒淀粉浆液的初始DS为33 % -37 %。在一些实施例中，精制颗粒淀粉浆液的初始DS 为 34% -36%。
[0038] 在一些实施例中，葡糖淀粉酶包括腐质霉属（Humicola)葡糖淀粉酶和黑曲霉 (A. Niger)葡糖淀粉酶的混合物。
[0039] 在一些实施例中，所述方法进一步包括用支链淀粉酶处理。
[0040] 在一些实施例中，支链淀粉酶为Bacillus deramificans支链淀粉酶。
[0041] 在一些实施例中，所述方法进一步包括用第一剂量的α -淀粉酶处理后用第二剂 量的淀粉酶处理，其中所述第二剂量发生在第一剂量之后的18-48小时。在一些实施 例中，第二剂量发生在 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38,40,42,44,46,或 48 小时之后。 [0042] 在一些实施例中，所述方法还包括用第一剂量的葡糖淀粉酶处理后用第二剂量的 葡糖淀粉酶处理，其中所述第二剂量发生在第一剂量后的18-48小时。在一些实施例中，第 二剂量发生在 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38,40,42,44,46,或 48 小时之后。
[0043] 在一些实施例中，不需要α -淀粉酶的热失活。
[0044] 在一些实施例中，α -淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌（B. stearothermophilus)， 解淀粉芽抱杆菌（B. amyloliquefaciens)和地衣芽抱杆菌（B. licheniformis)。在一些实 施例中，α -淀粉酶是SPEZYMEX XTRA。
[0045] 在一些实施例中，葡萄糖糖浆的生产时间小于80小时。在一些实施例中，葡萄糖 糖浆的生产时间少于75, 70,65,60, 55, 50,45,40, 35,或30小时。
[0046] 在本发明教导的一些实施例中，该反应可在高于给定淀粉起始糊化温度的温度下 进行。例如，在一些实施例中，反应在比初始糊化温度高1，2, 3, 3,4, 5,6, 7,8,9,10,11，12， 13.14.15.16.17.18.19, 或20度的温度下进行。在一些实施例中，该反应可在比初始糊化 温度高1-5,1-10, 5-10,1-15, 5-15,或1-20度的温度下进行。
[0047] 在本发明教导的一些实施例中，该反应可在低于给定淀粉起始糊化温度的温度下 进行。例如，在一些实施例中，反应是在比初始糊化温度低1，2, 3, 3,4, 5,6, 7,8,9,10,11， 12.13.14.15.16.17.18.19, 或20度的温度下进行。在一些实施例中，该反应可在比初始糊 化温度低1-5,1-10, 5-10,1-15, 5-15,或1-20度的温度下进行。
[0048] 在一些实施例中，本发明方法的精制淀粉或组合物来自玉米、小麦、大麦、黑麦、黑 小麦、高粱、稻、燕麦、豆类、香蕉、马铃薯、甘薯或木薯。在一些实施例中，本发明方法的精制 淀粉或组合物来自玉米。
[0049] 在一些实施例中，按照用根据本发明教导的酶处理，任何残留的未溶解淀粉可随 后用作发酵原料。例如未溶解淀粉可以经受常规液化形成液化物，该液化物能经微生物发 酵形成多种生化制品，包括例如乙醇、乳酸，琥珀酸、柠檬酸、谷氨酸单钠、1-3丙二醇等。在 一些实施例中，未溶解淀粉可以被低温第一处理中使用的相同的酶重新处理，以生成糖浆 和/或可发酵底物。
[0050] 在一些实施例中，本发明教导提供了一种由来自玉米的精制颗粒淀粉浆液 制备葡萄糖糖浆的方法，包括；使33-37 %初始DS的精制颗粒淀粉浆液在温度等于或 低于初始淀粉糊化温度条件下与至少8AAU/gds剂量的嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus)的α -淀粉酶，〇· 〇5GAU/gds至不超过0· 3GAU/gds的葡糖淀粉酶接 触，其中葡糖淀粉酶包括来自灰腐质霉（Humicola grisea)的第一葡糖淀粉酶和来自黑曲 霉（A. Niger)的第二葡糖淀粉酶，以及 0· 15-0. 25ASPU/gds 剂量的 Bacillus deramificans 支链淀粉；以及，制备葡萄糖糖浆，其中所述葡萄糖糖浆包含少于3%的DP2。
[0051] 在一些实施例中，本发明教导提供一种组合物，所述组合物包含来自玉 米的精制颗粒淀粉楽液的组合物，至少8AAU/gds的嗜热脂肪芽孢杆菌（Baci 1 lus stearothermophilus) α -淀粉酶，〇. 〇5GAU/gds至不多于0. 3GAU/gds的葡糖淀粉酶，其中 所述葡糖淀粉酶包括相等GAU/gds的来自热变异灰腐质霉（Humicola grisea thermoida) 的第一葡糖淀粉酶和来自黑曲霉（A. Niger)的第二葡糖淀粉酶，以及0. 15-0. 25ASPU/gds 的 Bacillus deramificans 支链淀粉
[0052] 诵用抟术
[0053] 除非另外指明，否则对本发明的实施将采用分子生物学（包括重组技术）、微生物 学、细胞生物学、生物化学和免疫学领域的常规技术，这些技术均为本领域的现有技术。这 些技术在以下文献中有完整解释："Molecular Cloning:A Laboratory Manual"，second edition(Sambrook et al.，1989)(《分子克隆实验指南》，第二版，Sambrook等人，1989年）； "Oligonucleotide Synthesis (《寡核苷酸合成》Gait 编辑，1984) ;"Animal Cell Culture"（R. I. Freshney, ed.，1987)(《动物细胞培养》，R. I. Freshney 编辑，1987 年）； "Methods in Enzymology(《酶学方法》）"（美国学术出版社（Academic Press, Inc·)); "Current Protocols in Molecular Biology"（F.M.Ausubel 等人编辑，1987，以及定 期更新版本）；"PCR:The Polymerase Chain Reaction，'，（Mullis et al.，eds·，1994) (《PCR:聚合酶链反应》，Mullis等人编辑，1994年）。Singleton等人，"Dictionary of Microbiology and Molecular Biology"（《微生物学和分子生物学词典》），第二版， J.Wiley&Sons(NewYork，N.Y. 1994)和 Baltz 等人，"Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology"（《工业微生物与生物技术手册》），第3'华盛顿特区：美国微生物学 会出版社，2010 (Washington, DC:ASM Press, 2010)，为本领域技术人员提供了本专利申请 使用的多个术语的一般指导。
[0054] 1)运用高压液相色谱（HPLC)法的碳水化合物组合物。寡糖反应产物的组合物， 由使用如下所示（a)或（b)任一种方法描述的高压液相色谱（HPLC)测得。对于给定的样 品使用方法（a)或方法（b)得到类似的结果。浆料样品的样品制备包括在转速13000转/ 分钟下离心5分钟，稀释糖浆至3%的溶液，以及煮沸10分钟使酶变性。样品冷却后，在进 行HPLC分析前，使用0. 22 μ m的盘式过滤器（聚四氟乙烯泰坦针筒过滤器（Titan Syringe Filter PTFE)，0. 45 μ m 30mm)过滤。两种方法中均使用HPLC柱通过分子量分离糖类。例 如，标识DPI为单糖，例如葡萄糖；标识DP2为二糖，例如麦芽糖；标识DP3为三糖，例如麦芽 三糖，以及标识"DP3+"是聚合度（DP)为4或更高的寡糖。不同糖类（DP3+，DP3，DP2，DP1) 的面积百分比是由每种单个糖的面积除以所有糖类的总面积计算得到。
[0055] a.使用HPLC系统（贝克曼系统金32卡拉特富勒顿，美国加利福尼亚州（Beckman System Gold 32Karat Fullerton, California, USA))，其配备有 HPLC 柱（Rezex RCM-单 糖），保持在80°C条件下，并装有一个折射指数（RI)检测器。用流速为每分钟0.6毫升的 去离子水作为流动相。将20微升3. 0%溶液注射到色谱柱中。
[0056] b.使用HPLC系统（岛津公司快速模块化高效液相色谱仪；日本京都（Prominence modular HPLC from Shimadzu Corporations ;Kyoto, Japan)),其配备有 HPLC 柱（Rezex RHM-单糖的H+ (8 % )购自菲罗门公司；美国加利福尼亚州托兰斯（Phenomenex, Inc.; Torrance, CA，USA))保持在85°C。用流速为每分钟0.6毫升的超纯软化水（MilliQ)作为 流动相。对于每个样品，将5微升10%糖浆溶液注射到色谱柱中。
[0057] 2) -个AAU的细菌α -淀粉酶活性为在60°C和用30mM乙酸钠缓冲的pH 6. 0下， 每分钟从包含31. 2mM氯化|丐的5%干固形物可溶性里氏淀粉（Lintner starch)溶液水解 10mg淀粉所需的酶量。
[0058] 3) -个葡糖淀粉酶单位（GAU)为在60°C和用20mM乙酸钠缓冲的pH 4. 3下，每小 时从2. 5%干固形物可溶性林特纳（Lintner)淀粉底物释放一克以葡萄糖计算的还原糖的 酶量。
[0059] 4)颗粒淀粉的溶解化百分比。溶解化测试通过从搅拌浆料中取样到两个2. 5毫 升微量离心管中进行。一号管以13, 000转/分钟的转速旋转约4分钟，并在30°C (RISUP) 测定上清液的折射率。总干物质通过从一次性微移液管里加入1滴SPEZYMEK FRED到 二号管中，然后煮沸10分钟来确定。将管冷却，并在30°C时（RItJ测定干物质。使用适 当的DE表格确定上清液的和完整样品（总计）的干物质。用于转换RISUP至DS的表为来 自玉米精炼协会有限公司关键数据表格（Critical Data Tables of the Corn Refiners Association, Inc.)的％DE，表1，为将RIt(rt转换为DS，可使用多于一个表，也可使用32DE 和95DE表之间的插值。首先，溶解化的估算值通过上清液中的DS除以初始DS*1. 1而得。 初始DS是制备过程中的目标干物质淀粉浆料并且通常由波美（Baume) /DS表格或通过由原 有的浆料干燥失重（红外平衡）测定的干物质来确定。此估算的溶解化被用于经由95DE 和32DE表得到的DS之间的插值。溶解化被定义为上清液的干燥物质除以总干物质再乘以 100。然后将这个值校正，以补偿剩余的颗粒淀粉的影响。这种校正补偿了局部溶胀的水吸 收和从上清液中测定DS时残留在旋管的淀粉颗粒的水解。
[0060] 5) -个耐酸支链淀粉酶单位（ASPU)为在pH 4. 5和温度60°C下，每分钟从支链淀 粉释放一当量以葡萄糖计的还原力的酶量。
[0061] 6)如本文中所使用的，"Liquefon单元"（LU)是指用碘溶液产生颜色变化所需要 的消化时间，表明淀粉底物在标准测定条件下糊精化的一个明确的阶段。简言之，底物可以 是5克/升的在磷酸盐缓冲液中的pH 6. 2 (42. 5克/升磷酸二氢钾，3. 16克/升氢氧化钠） 的可溶林特纳淀粉。样品中加入25mM氯化钙，并且用在30°C温育时负碘试验所用时间来测 定活性。记录根据下式计算出的每克或毫升淀粉酶活性单位（LU)形式的活性：
[0062] LUimLmLU/g=-xD V xt
[0063] 式中LU =淀粉酶活性单位；V =样品体积（5毫升）；t =糊精化时间（分钟）；D =稀释因子=稀释体积/加入酶的毫升或克。
[0064] 7) -个"改良的伍格母单位"（MWU)是指酶例如FuelzymeK\-LF的能够在标准反 应条件下在30分钟内将lmg可溶淀粉水解为特定糊精的量。
[0065] 定义
[0066] 如本文中所用，术语"淀粉"指由植物的复杂多糖碳水化合物构成的任何材料，由 具有式（C 6H1(l05)x(其中X可以是任何数字）的直链淀粉和/或支链淀粉构成。具体而言，该 术语指任何基于植物的材料，包括但不限于谷物、草、块茎和根，更具体地，是指玉米、小麦、 大麦、黑麦、黑小麦、高粱、稻、燕麦、豆类、香蕉、马铃薯、甘薯或木薯。在从其他植物分子纯 化复杂多糖碳水化合物的处理后，其被称为"精制淀粉"
[0067] 术语"颗粒淀粉"指未蒸煮的（生的）淀粉，其未进行糊化。
[0068] 术语"淀粉糊化"意指使淀粉分子溶解化以形成粘性悬浮液。
[0069] 术语"初始糊化温度"指淀粉底物开始糊化时的最低温度。确切的温度可由本领 域技术人员轻易确定，它取决于具体的淀粉底物，进一步可取决于淀粉来源的特定植物品 种和生长条件。根据本发明教导，给定淀粉的起始糊化温度是用采用Gorinstein S.和 Lii. C1.，《淀粉与淀粉糖》，卷 44(12),第 461-466 页（1992) (Gorinstein. S. and Lii. Cl.，Starch/Stark，V〇144 (12) ρρ· 461-466 (1992))记载的方法使淀粉颗粒的双折射失 去5%时的温度。多种可用于根据本文的工艺中的颗粒淀粉的初始淀粉糊化温度范围包 括大麦（52-59°C )、小麦（58-64°C )、裸麦（57-70°C )、玉米（62-72°C )、高直链淀粉玉米 (67-80°C )、稻（68-77°C )、高粱（68-77°C )、马铃薯（58-68°C )、木薯粉（59-69°C )和甘 薯（58-72°C)(Swinkels，pg.32-38in STARCH CONVERSION TECHNOLOGY，Eds Van Beynum et al·，（1985)Marcel Dekker Inc. New York (Swinkels，第 32-38 页，《淀粉转化技术》，Van Beynum等人编辑，1985年，马塞尔?德克尔公司，纽约）和The Alcohol Textbook 3. sup. rd ED. A Reference for the Beverage, Fuel and Industrial Alcohollndustries, Eds Jacquesetal·，（1999) Nottingham University Press, UK (《醇教科书：饮料、燃料和工业酒 精行业参考》，第3版增补，Jacques等人编辑，1999年，诺丁汉大学出版社，英国））。糊化涉 及结晶区的熔化、分子的水合以及颗粒的不可逆溶胀。对于给定的颗粒，糊化温度发生在一 定范围内，因为结晶区的大小和/或分子有序性或晶格完整程度不同。STARC HHYDROLYSIS PRODUCTS Worldwide Technology, Production, and Applications(eds/Shenck and Hebed a, VCHPublishers，Inc，NewYork，1992)at p. 26(《淀粉水解产物：世界技术、生产和应用》， Shenck和Hebeda编辑，VCH出版公司，纽约，1992年，第26页）。
[0070] 术语"DE"或"右旋糖当量"是测量总还原糖浓度的行业标准，并且以按干重计的 D-葡萄糖计算。非水解的颗粒淀粉的DE几乎为0,而D-葡萄糖的DE为100。
[0071] 术语"葡萄糖糖浆"指含有葡萄糖固形物的含水组合物。在一个实施例中，葡萄 糖糖浆可包含至少90 %的D-葡萄糖，在另一个实施例中，葡萄糖糖浆可包含至少95 %的 D-葡萄糖。在一些实施例中，术语葡萄糖和葡萄糖糖浆可互换使用。
[0072] 术语"总糖量"指淀粉组合物中存在的总糖量。
[0073] 术语"干固形物含量（DS)"是指按干重计的浆液（以％表示）的总固形物（溶解 和不溶解的）。在一开始，"初始DS"是指在时间为零时浆液中的干燥固形物。随着水解反 应的进行，DS被溶解的部分可以被称为"糖浆DS""以及"上清液DS"。
[0074] 术语"浆料"是含有未溶解淀粉颗粒的含水混合物。
[0075] 术语"干物质淀粉"或"干固形物淀粉"是指按干重计的浆液（以％表示）的总淀 粉固形物，减去来自其他显著大分子（如蛋白质）的部分。
[0076] 术语" α -淀粉酶"(EC 3. 2. 1. 1类）是指催化α -1，4糖苷键水解的酶。这些酶也 被描述成在含有1，4- α -连接的D-葡萄糖单元的多糖中实现1，4- a -D-糖苷键的外切水 解或内切水解的酶。用于描述这些酶的另一术语是糖原酶。示例性的酶包括α-1，4-葡聚 糖 4-葡聚糖水化酶葡聚糖水解酶（α -1，4-glucan4_glucanohydraseglucanohydrolase)。 在一些本发明的实施例中，α -淀粉酶是具有EC编号E. C. 3. 2. 1. 1-3的微生物酶，尤其是 E. C. 3. 2. 1. 1.在一些实施例中，α -淀粉酶是耐热细菌α -淀粉酶。合适的α淀粉酶可以 是天然存在的、以及重组的和突变的α淀粉酶。在特别优选的实施例中，α-淀粉酶来源于 芽孢杆菌属。优选的芽孢杆菌属菌种包括枯草芽孢杆菌（B.subtilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌 (B. stearothermophilus)、迟缓芽抱杆菌（B. lentus)、地衣芽抱杆菌（B. licheniformis)、 凝结芽抱杆菌（Β· coagulans)和解淀粉芽抱杆菌（Β· amyloliquefaciens)(USP 5, 763, 385、USP 5, 824, 532、USP 5, 958, 739、USP 6, 008, 026 和 USP 6, 361，809)。特 别优选的ct淀粉酶来源于嗜热脂肪芽孢杆菌（B. stearothermophilus)、解淀粉芽孢 杆菌（B. stearothermophilus)和地衣芽抱杆菌（B. licheniformis)的芽抱杆菌菌株。 同时参考具有以下标识特征的菌株：ATCC 39709 ;ATCC11945、ATCC 6598、ATCC 6634、 ATCC 8480、ATCC 9945A和NCIB8059。预期用于本发明的方法中的市售的α-淀粉酶 包括 SPEZYME? ΑΑ ; SPEZYME? FRED ; G-ZYME? G997 (杰能科国际有限公 司（Genencor International Inc·))和 TERMAMYL? 120-L，TERMAMYL? LC，TERMAMYLK SC 以及 Liquozyme SUPRA(诺维信（Novozymes))。
[0077] 术语"葡糖淀粉酶"指淀粉葡糖苷酶类别的酶（EC. 3. 2. 1.3,葡糖淀粉酶， α -1，4-D-葡聚糖葡萄糖水解酶）。这些酶是外切作用酶，其从直链淀粉和支链淀粉分子的 非还原端释放葡糖基残基。该酶还水解α-1，6和α-1,3-键，但速率比水解α-1,4-键 慢得多。葡糖淀粉酶（E.C. 3. 2. 1.3)是从淀粉的非还原端相继去除葡萄糖单元的酶。该 酶可同时水解淀粉的直链和支链键，即可同时水解直链淀粉和支链淀粉。尽管葡糖淀粉酶 可以来自细菌、植物和真菌，但是本发明所涵盖的优选葡糖淀粉酶源自真菌菌株。分泌自 曲霉属（Aspergillus)、根霉属（Rhizopus)、腐质霉属（Humicola)和毛霉属（Mucor)的真 菌的葡糖淀粉酶已从包括以下的真菌菌株衍生得到：黑曲霉（Aspergillus niger)、泡盛 曲霉（Aspergillus awamori)、得氏根霉（Rhizopus niveus)、米根霉（Rhizopus oryzae)、 米黑毛霉（Mucor miehe)、灰腐质霉(Humicola grisea) > Aspergillus shirousami 和 柔毛腐质霉（嗜热真菌属）（Humicola(Thermomyces) laniginosa)((参见Boel等人， (1984)，EMB0J (《欧洲分子生物学组织杂志》），第3卷：第1097-1102页；W0 92/00381 ;W0 00/04136 ;Chen 等人，（1996) Prot. Eng,第 9 卷：第 499-505 页；Taylor 等人，（1978)《碳水 化合物参考》（Carbohydrate Res.)第 61 卷：第 301 - 308 页和 Jensen 等人，（1988) Can. J. Microbiol.(《加拿大微生物学杂志》），34:218 - 223)。具有葡糖淀粉酶活性的商业用 酶使用如下方法生产，例如，从黑曲霉（Aspergillus niger)(商品名〇PTIDEXK' L-400 和G-ZYMEU G9904X来自杰能科国际有限公司，本文中表示为A-GA和An-GA)或根霉属 (Rhizopus)物种（商品名：CUCONCR''来自新日本化学工业（Shin Nihon Chemicals), 日本和商品名GLUCZYME?来自天野制药公司（Amano Pharmaceuticals)，日本）。使 用的重组表达的腐质霉GA(H-GA)是来自木霉（Trichoderma)宿主，如美国专利7,303,899 中所述。其它实施例中木霉（Trichoderma)宿主表达异源多核苷酸，其编码灰腐质霉 (Humicola grisea)菌株，特别是灰腐质酶（Humicola grisea)变种 thermoidea·)菌株。 在一些实施例中，木霉（Trichoderma)的CS4变种可以被使用（例如在美国专利8, 058, 033 中的教导），同时其他变种包括Brew 1和Brew 11也可使用（例如在W02011/020852和 W02012/001139 中的教导）。
[0078] 如本文中所使用的，术语"支链淀粉酶"（也叫脱支酶（E. C. 3. 2. 1. 41，支链淀粉 6_葡聚糖水解酶））是能够水解支链淀粉分子中α 1-6糖苷键的酶。这些酶通常由芽孢 杆菌菌种分泌；例如，Bacillus deramificans (美国专利No. 5, 817, 498 ;1998年）、嗜酸普 鲁兰芽胞杆菌（Bacillus acidopullulyticus)(欧洲专利No. 0063909)和长野芽抱杆菌 (Bacillus naganoensis)(美国专利No. 5, 055, 403)。具有支链淀粉酶活性的商用酶生成 自，例如，芽孢杆菌属物种（Bacillus species)(商品名〇PTIMAX'K) L-1000来自丹尼斯 克-杰能科和Prom〇zymeK:来自诺维信）或来自巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium) 淀粉酶/转移酶（BMA)。巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium)淀粉酶具有一种将支链糖类 转换为容易被葡糖淀粉酶水解形式的能力（Habeda RE，Styrlund CR和Teague M;1988《淀 粉与淀粉糖》(Starch/Starke)，40, 33-36)。酶在pH值5· 5、温度75°C时活性最大（David, ΜΗ, Gunther Η 和 Vilvoorde， H. R ;1987, 《淀粉与淀粉糖》，第 39 卷，第 436-440 页 ） 。 该酶被 克隆到基因工程的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)中，并且在其中表达，以商业规模 制备（Brumm, P. J, Habeda R. E,和 Teague W. M, 1991《淀粉与淀粉糖》，第 43 卷，第 315-329 页）.该酶以Megadex为商品名销售，用于增强使用黑曲霉（Aspergillus niger)葡糖淀 粉酶酶解液化淀粉的糖化过程中的葡萄糖得率。其它实施例中木霉（Trichoderma)宿主 表达异源多核苷酸，其编码灰腐质霉（Humicola grisea)菌株，特别是灰腐质酶（Humicola grisea)变种 thermoidea。
[0079] 术语"淀粉的水解"指加入水分子切割糖苷键。
[0080] 术语"聚合度"(DP)指给定糖类中无水吡喃葡萄糖单元的数目（n)。DPI的实例是 单糖，如葡萄糖和果糖。DP2的实例是二糖，如麦芽糖和蔗糖。DP3+ODP3)表示聚合度大于 3的聚合物。
[0081] 术语"接触"是指将相应的酶设置成与相应的底物充分靠近，使得该酶能够将该底 物转化为最终产品。本领域技术人员将认识到将酶溶液与相应底物混合可实现接触。
[0082] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域普 通技术人员所一般理解的含义相同的含义。
[0083] 如本文所用，除非上下文另有明确说明，否则单数"一个"、"一种"和"该"包括复 数指代。
[0084] 在本说明书通篇中给出的每一个上限值旨在包括每一更低数值限度，就如同此类 更低数值限度在本文中明确地写出一样。在本说明书通篇中给出的每一个下限值将包括每 一更高数值限度，就如同此类更高数值限度在本文中明确地写出一样。在本说明书通篇中 给出的每一个数值范围将包括落入此类较宽数值范围内的每一个较窄数值范围，就如同此 类较窄数值范围在本文中全部明确地写出一样。
[0085] 通过参照以下实例能进一步理解本发明，这些实例以举例说明的方式提供而非旨 在进行限制。
[0086] 实魁
[0087] 实例 1
[0088] 在实例1的一个典型实验中，进行淀粉水解的常规方法来说明淀粉加工行业的典 型结果。在此，淀粉的液化使用35%的干固形物含量和pH调节至pH 5.6的CargillGel? 3240未改性干玉米淀粉的水性浆料来进行。随后在lOLU/gds的淀粉中加入热稳定的α -淀 粉酶，SPEZYMEv) SPEZYME (丹尼斯克-杰能科），淀粉浆液泵入通过直接蒸汽喷射加热器 (喷射蒸煮器），使温度升高到l〇5±2°C。离开喷射蒸煮器，糊化的淀粉被排放到加压初级 液化反应器中，并保温5分钟（105°C )至完全糊化和溶解淀粉以降低粘度。从初级液化反 应器中，可溶性糊精溶液排入闪蒸冷却器到二次液化温度（95°C )并泵送到次级液化反应 器中。再继续水解90分钟和/或直至获得理想的DE(10-12DE)。来自液化步骤的残留的 α -淀粉酶活性由于在95°C降低液化物的pH值到pH为4. 5而失活（保温10分钟），并用 于糖化研究。该液化物的DS调节至32% DS，35% DS和38% DS (通过真空蒸发浓缩得到更 高的DS)，使用葡糖淀粉酶〇PTIDEX'K) L-400 (杰能科-丹尼斯克）在淀粉用量0. 20GAU/ gds、pH 4. 2-4. 5及60°C时进行糖化作用。在不同的时间间隔对糖组成进行抽样和分析。 表1示出了葡糖淀粉酶在pH 4. 2至pH4. 5,温度60°C下对高温液化的淀粉底物进行水解过 程中的初始DS对DP2含量的作用。对于三个DS组中的每一组，最高的葡萄糖水平的数据 (以粗体显示）示于图1中的顶线（正方形图例）。
[0089] 表 1
[0090]
【权利要求】
1. 一种由精制颗粒淀粉浆料制备葡萄糖糖浆的方法，其包括： 使所述精制颗粒淀粉浆液在处于或低于初始淀粉糊化温度的温度下，和至少8AAU/gds 剂量的α -淀粉酶以及〇. 〇5GAU/gds至不超过0. 3GAU/gds剂量的葡糖淀粉酶接触，并 制得葡萄糖糖浆。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述葡萄糖糖浆包含至少90%的DPI。
3. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中至少80%的所述精制颗粒淀粉为溶 解的。
4. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述葡萄糖糖浆包含少于3%的DP2。
5. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述精制颗粒淀粉浆液包含 31% -44%或33-37%的初始干固形物含量（DS)。
6. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中葡糖淀粉酶包含葡糖淀粉酶的混合 物，其中所述混合物包含快速水解葡糖淀粉酶和低逆转葡糖淀粉酶。
7. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶包含葡糖淀粉酶的混 合物，所述葡糖淀粉酶的混合物包含一种快速水解葡糖淀粉酶和一种低逆转葡糖淀粉酶， 其中所述快速水解葡糖淀粉酶是腐质酶（Humicola)葡糖淀粉酶和与其97%相同的分子， 并且所述低逆转葡糖淀粉酶是黑曲霉（A. Niger)葡糖淀粉酶和与其97%相同的分子。
8. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包含用支链淀粉酶处理。
9. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中当支链淀粉酶存在时，其为Bacillus (^以11^1^3118支链淀粉酶和与其97%相同的分子。
10. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中加入第一剂量的α-淀粉酶之后加 入第二剂量的α-淀粉酶，其中所述第二剂量发生在第一剂量加入后的18至48小时之间。
11. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中加入第一剂量的葡糖淀粉酶之后加 入第二剂量的葡糖淀粉酶，其中所述第二剂量发生在第一剂量加入后的18至48小时之间。
12. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中第一剂量的α-淀粉酶于第一温度 施加，并且其中第一温度随后在18小时至34小时之间升高2°C -8°C至第二温度。
13. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中第一剂量的葡糖淀粉酶于第一温度 施加，并且其中第一温度随后在18小时至34小时之间升高2°C -8°C至第二温度。
14. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽 抱（B. stearothermophilus)，解淀粉芽抱杆菌（B. amyloliquefaciens)和地衣芽抱杆菌 (B. licheniformis)以及与其97%相同的分子。
15. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述α-淀粉酶为野生型嗜热脂肪 芽孢（13.8七631'〇1：1161'1]1(^11；[1118)，或与其97 (%相同的分子。
16. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中葡萄糖糖浆的制备少于60小时。
17. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中精制淀粉来自玉米、小麦、大麦、黑 麦、黑小麦、稻、燕麦、豆类、香蕉、马铃薯、甘薯或木薯。
18. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中精制淀粉来自玉米。
19. 一种组合物，其包含至少8AAU/gds的α -淀粉酶，和〇. 〇5GAU/gds至不超过 0. 3GAU/gds的葡糖淀粉酶。
20. 根据权利要求19所述的组合物，其还包含精制颗粒淀粉。
21. 根据权利要求19或20所述的组合物，其还包含支链淀粉酶。
22. 根据权利要求19-21中任一项所述的组合物，其中所述0. 05GAU/gds至不超过 0. 3GAU/gds的葡糖淀粉酶包含第一葡糖淀粉酶和第二葡糖淀粉酶。
23. 根据权利要求19-22中任一项所述的组合物，其中精制淀粉来自玉米、小麦、大麦、 黑麦、黑小麦、稻、燕麦、豆类、香蕉、马铃薯、甘薯或木薯。
24. 根据权利要求19-23中任一项所述的组合物，其中精制淀粉来自玉米。
【文档编号】C12P19/02GK104204214SQ201380016251
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2013年3月26日 优先权日:2012年3月28日
【发明者】B·C·库普斯, F·K·库伊, S·H·李, J·K·舍蒂, B·A·斯托姆, A·H·范图伊尔 申请人:丹尼斯科美国公司