专利名称：盐单胞菌属菌株WDG195相关α-淀粉酶及其使用方法
技术领域：
本发明公开与得自盐单胞菌属(Halomomas)菌株WDG195的α -淀粉酶以及结构上相关的淀粉酶相关的组合物和方法。
背景技术：
淀粉由直链淀粉(15-30% w/w)和支链淀粉(70-85% w/w)的混合物组成。直链淀粉由具有约60，000-约800，000分子量的α-1，4-连接的葡萄糖单位的直链组成。 支链淀粉是每24-30个葡萄糖单位包含α -1，6分支点的分支聚合物；它的丽可以高达 100，000，000。以浓缩葡萄糖糖浆形式来自淀粉的糖目前由酶促催化过程产生，涉及(1)固体淀粉由α-淀粉酶液化(或粘度减少)成具有约7-10的平均聚合度的糊精，和( 所得到的液化淀粉(即淀粉水解物)由淀粉葡糖苷酶(也称为葡糖淀粉酶或GA)进行糖化。所得到的糖浆具有高葡萄糖含量。商业上产生的许多葡萄糖糖浆随后酶促异构化为称为异糖浆 (isosyrup)的葡萄糖/果糖混合物。α -淀粉酶(EC 3. 2. 1. 1)通过随机切割内部α -1，4_糖苷键，水解淀粉、糖原和相关多糖。多年来，α-淀粉酶已用于多种不同用途，包括淀粉液化、纺织品退浆、在纸和纸浆工业中的淀粉改性、和用于酿造。这些酶还可以用于在餐具洗涤和衣物洗涤过程中去除淀粉性污渍。衣物和餐具污垢在组成上并因此在其被去除的能力上十分不同，市场上很少数淀粉酶可以用于衣物和餐具应用两者。盐单胞菌属(Halomonas)物种是革兰氏阴性、中等嗜盐细菌，其在包含3_15 % NaCl的培养基中最佳地生长，尽管大多数可以在非常广的盐度范围上生长。某些物种是嗜碱性的。唯一已经描述的来自盐单胞属物种的淀粉酶是来自南方盐单胞菌(Halomonas meridiana)DSM5425(Coronado,M. J.等人 O000)FEMS Microbiology Letters 183 :67-71) 的淀粉酶。这种α-淀粉酶(即amyH)已得到克隆，并且预测了推导的氨基酸序列(AmyH) (Coronado, M. J.等人，(2000) Microbiology 146:861-868)。amyH 基因的核苷酸序列 (AJ239061)和AmyH多肽的预测氨基酸序列(CAB9296!3)可在GenBank获得。AmyH的氨基酸序列也在SEQ ID NO :1中显示。AmyH预测为457个氨基酸的多肽，包括20个氨基酸的信号序列和437个氨基酸的成熟多肽序列。虽然AmyH看起来属于糖基水解酶家族13，但其与最接近的同源物具有低序列同
一性，如下表中所示
权利要求
1.一种分离的多肽，其与AmyWDG195具有至少80%氨基酸序列同一性，并且包括至少一个下述在相对于AmyWDG195所示的氨基酸位置上的氨基酸残基，其中所述氨基酸位置通过比对该多肽的氨基酸序列与AmyWDG195的氨基酸序列而确定在位置3上的E、在位置20 上的E、在位置25上的M、在位置沈上的N、在位置40上的L、在位置68上的D、在位置82 上的E、在位置91上的Q、在位置94上的G、在位置177上的L、在位置179上的H、在位置 181上的G、在位置224上的N、在位置267上的L、在位置278上的D、在位置280上的D、在位置281上的V、在位置294上的E、在位置297上的R、在位置298上的T、在位置307上的 L、在位置340上的D、在位置350上的V、在位置360上的S、在位置381上的L、在位置386 上的E、在位置390上的D、在位置418上的G、在位置449上的M、在位置453上的H、在位置 470上的D和在位置479上的Q。
2.权利要求1的多肽，其包括至少一个下述在相对于AmyWDG195所示的氨基酸位置上的氨基酸残基在位置3上的E、在位置20上的E、在位置25上的M、在位置沈上的N、在位置68上的D、在位置82上的E、在位置91上的Q、在位置94上的G、在位置177上的L、在位置179上的H、在位置181上的G、在位置224上的N、在位置278上的D、在位置280上的 D、在位置281上的V、在位置294上的E、在位置297上的R、在位置298上的T、在位置340 上的D、在位置350上的V、在位置360上的S、在位置386上的E、在位置390上的D、在位置 418上的G、在位置449上的M、在位置453上的H、在位置470上的D和在位置479上的Q， 如上，AmyWDG195相关多肽可以具有这些在所示位置上的氨基酸残基的任何子集，或所有这些在所示位置上的氨基酸残基。
3.权利要求1的多肽，其包括至少一个下述在相对于AmyWDG195所示的氨基酸位置上的氨基酸残基在位置25上的M、在位置沈上的N、在位置177上的L、在位置179上的H、 在位置294上的E、在位置298上的T和在位置449上的M。
4.权利要求1的多肽，其包括至少一个下述在相对于AmyWDG195所示的氨基酸位置上的氨基酸残基组合在位置25上的M和在位置沈上的N，任选地连同在位置20上的E ；在位置91上的Q和在位置94上的G ；在位置177上的L、在位置179上的H和在位置181上的G ；在位置280上的D和在位置281上的V，任选地连同在位置278上的D ；在位置297上的R和在位置298上的T，任选地连同在位置294上的E ；在位置386上的E和在位置390 上的D，任选地连同在位置381上的L ；以及在位置449上的M和在位置453上的H。
5.权利要求1的多肽，其具有至少30个谷氨酸残基。
6.权利要求1的多肽，其包括至少一个下述在相对于AmyWDG195的所示氨基酸位置上的氨基酸残基在位置104上的N、在位置194上的D、在位置200上的N和在位置2；35上的 H0
7.权利要求1的多肽，其包括至少一个下述在相对于AmyWDG195所示的氨基酸位置上的氨基酸残基在位置302上的Y、在位置300上的G、在位置427上的N、在位置404上的D 和在位置403上的W。
8.权利要求1的多肽，其包括至少一个下述在相对于AmyWDG195所示的氨基酸位置上的氨基酸残基在位置289上的N、在位置3M上的V、在位置325上的D和在位置337上的 S。
9.权利要求1的多肽，其包括下述在相对于AmyWDG195所示的氨基酸位置上的氨基酸残基在位置197上的L。
10.权利要求1的多肽，其中AmyWDG195具有SEQID NO 12的氨基酸序列。
11.权利要求1的多肽，其与SEQID NO 12的氨基酸序列具有至少90%氨基酸序列同一性。
12.权利要求1的多肽，其与SEQID NO: 12的氨基酸序列具有至少95%氨基酸序列同一性。
13.权利要求1的多肽，其具有SEQID NO 12的氨基酸序列(AmyffDG195)。
14.权利要求1的多肽，其具有SEQID NO 23的氨基酸序列(AmyS腫2)。
15.权利要求1的多肽，其中所述多肽具有α-淀粉酶活性。
16.权利要求15的多肽，其中所述活性不依赖于钙。
17.一种培养的细胞物质，其包括权利要求1-17中任一项的多肽。
18.—种组合物，其包括权利要求1-17中任一项的多肽。
19.权利要求18的组合物，其中所述组合物是清洁组合物。
20.权利要求19的组合物，其中所述组合物对于去除衣物、餐具或纺织品上的淀粉性污渍有效。
21.一种用于从表面上去除淀粉性污渍的方法，其包括在包括有效量的权利要求1多肽的水性组合物的存在下孵育所述表面， 允许所述多肽水解淀粉性污渍中存在的淀粉组分，以产生溶解于水性组合物中的较小淀粉衍生分子，从而从所述表面去除所述淀粉性污渍。
22.权利要求21的方法，其中所述孵育在不存在钙的情况下进行。
23.权利要求21的方法，其中所述孵育在钙螯合剂存在下进行。
24.权利要求21的方法，其中所述表面是纺织品表面。
25.一种用于表达具有淀粉酶活性的多肽的方法，其包括构建包括与编码信号序列的多核苷酸连接的编码权利要求1多肽的多核苷酸的表达载体；将所述表达载体弓丨入宿主细胞内， 在至少约NaCl的存在下表达所述多肽， 回收所表达的多肽。
26.
27.权利要求25的方法，其中在至少约2%NaCl的存在下执行所述多肽的表达。
28.权利要求25的方法，其中在至少约3%NaCl的存在下执行所述多肽的表达。
29.权利要求25的方法，其中在NaCl存在下表达的多肽量是在未添加NaCl的基础培养基中表达的量的至少5倍。
30.权利要求沈的方法，其中在2%NaCl存在下表达的多肽量是在未添加NaCl的基础培养基中表达的量的至少20倍。
31.权利要求27的方法，其中在NaCl存在下表达的多肽量是在未添加NaCl的基础培养基中表达的量的至少20倍。
全文摘要
本发明描述了涉及得自变异盐单胞菌WDG195的α-淀粉酶的组合物和方法。
文档编号C12N9/28GK102388131SQ201080014766
公开日2012年3月21日 申请日期2010年2月25日 优先权日2009年4月8日
发明者B·E·琼斯, C·莱夫朗, L·P·M·范马雷维杰克, M·埃斯塔布鲁克, M·科尔克曼 申请人:丹尼斯科美国公司