来自芽孢杆菌的新型甲醇脱氢酶的制作方法
【专利摘要】本发明涉及核酸分子，其编码具有醇脱氢酶活性、特别是甲醇脱氢酶活性的多肽，其包含或具有选自下组的核苷酸序列：（i)如SEQIDNOs:1(mdh2-MGA3)、3(mdh3-MGA3)或5(mdh2-PBl)中任一项示出的核苷酸序列；（ii)与SEQIDN0s:l、3或5中任一项示出的核苷酸序列具有至少90%序列同一性，更特别是至少91、92、93、94、95、96、97、98或99%的序列同一性的核苷酸序列；（iii)与核苷酸序列SEQIDN0s:l、3或5中的任一条简并的核苷酸序列;(iv)为SEQIDN0s:l、3或5中的任一项核苷酸序列一部分的或与序列SEQIDN0s:l、3或5简并的核苷酸序列的一部分的核苷酸序列；(v)编码SEQIDN0s:2(Mdh2-MGA3)、4(Mdh3-MGA3)或6(Mdh2-PB1)中任一项示出的氨基酸序列的多肽的全部或部分的核苷酸序列；(vi)编码多肽的全部或部分的核苷酸序列，所述多肽具有与SEQIDN0s:2、4或6中任一项示出的氨基酸序列具有至少90%序列同一性，更特别是至少91、92、93、94、95、96、97、98或99%的序列同一性的氨基酸序列；或者核酸分子，其包含与（i)到（vi)中任一项核苷酸序列互补的核苷酸序列。还提供了包含这种核酸分子和由其编码的多肽的重组构建体、载体和宿主细胞。这种分子可以有利地用于宿主细胞的基因修饰，以例如引入或修饰甲醇脱氢酶活性。
【专利说明】来自芽孢杆菌的新型甲醇脱氢酶
[0001] 本发明涉及在甲基营养菌中鉴定的以前未知的甲醇脱氢酶（MDH)，特别是涉及在 甲醇芽孢杆菌（Bacillus methanolicus)MGA3和甲醇芽孢杆菌PBl中鉴定的新的MDH编码 基因。生化性质不同的这些甲醇芽孢杆菌菌株中存在多个MDH同种型，本发明基于该意料 之外的发现。编码先前未知的MDH同种型的新基因可以用在宿主微生物的基因工程化中， 例如在使用甲醇和/或其它Cl化合物作为生长底物的背景中。因此，新的基因/酶可用于 引入或修饰，如启用/增强宿主微生物中的MDH活性。
[0002] 甲基营养微生物可以利用一碳（Cl)来源，例如甲烷和甲醇作为能量和生物量生 成的唯一来源，且甲基营养菌中存在各种不同的酶和Cl代谢途径。将在温度高达60°C的甲 醇上具有生长能力的革兰氏阳性杆菌分离并归类为甲醇芽孢杆菌。甲醇芽孢杆菌是所谓的 受限甲基营养菌，这意味着它可以利用少数多碳来源用于能量和生长。这些生物体的科学 兴趣已经主要集中在它们作为在升高的温度下从甲醇工业生产氨基酸、尤其是L-赖氨酸 和L-谷氨酸盐的细胞工厂的潜能，但已经提出其作为生产其他有用产品包括维生素、细胞 色素、辅酶和重组蛋白的宿主的潜在用途。
[0003] 甲醇芽孢杆菌MGA3 (ATCC53907)最初是从Minnesota的土样分 离（Schendel，Bremmon et al. (1990)Appl Environ Microbiol (应用环境微 生物学）56 (4) :963-970)，它已被用作这种细菌的代谢工程的主要模型菌株 (Brautaset, Jakobsen et al. (2007) Appl Microbiol Biotechnol (应用环境微生物 学）74(1):22-34 ;Jakobsen，Brautaset et al. (2009)Appl Environ Microbiol(应 用环境微生物学）75(3):652-661 ;Brautaset, Jakobsen et al. (2010)Appl Microbiol Biotechnol 87(3) :951-964)。甲醇芽孢杆菌有几个独特的特点，包括 用于甲醇氧化的NAD-依赖性甲醇脱氢酶（MDH) (de Vries, Arfman et al. (1992) J Bacteriol 174(16):5346-5353 ;Arfman，Hektor et al. (1997)Eur J Biochem(欧 洲生物化学）244(2) :426-433 ;Hektor, Kloosterman et al. (2002) J Biol Chem 277(49) :46966-46973)。甲醇脱氢酶（MDH)的活性为甲基营养菌生长的关键属性，并且参 与甲醇发酵的第一步骤，即甲醇氧化为甲醛。甲醛是甲醇代谢的中间产物，因此该细胞毒 性代谢物的解毒非常重要。甲醛可以通过RuMP途径被同化。已经提出将甲醛直接转化成 CO2的另外一种线性异化途径。异化途径被认为对甲醇上生长的细胞的总能量生成是重要 的。与RuMP途径一起，异化的途径还可以在调节细胞内甲醛低于毒性水平方面发挥作用。 因此，高效的甲醇氧化和伴随的甲醛同化对于生长和能量流进初级代谢和生成所需的产物 是至关重要的。此外，所有这一切必须小心地平衡，以确保甲醇有效转化同时避免细胞内甲 醛的毒性累积。在这方面，MDH在细菌甲基营养菌中起着至关重要的作用。
[0004] 细菌的MDHs根据它们的反应机理和使用的辅因子（S)可以分为几组。研究最多 的是两个亚基的吡咯喹啉醌（PQQ)依赖性醌蛋白MDHs，其广泛存在于革兰氏阴性甲基营 养菌中。革兰氏阳性甲基营养菌通常编码NAD(P) +-依赖性甲醇脱氢酶，并且除来自以上 讨论的菌株MGA3的MDH外，已经在甲醇芽孢杆菌菌株Cl的另一菌株中鉴定出NAD +-依赖 性MDH(Vonck, Arfman et al(1991)J Biol Chem 266(6) :3949-3954 ;de Vries, Arfman et al. (1992) J Bacteriol 174 (16): 5346-5353)。甲醇芽孢杆菌MDH与含铁醇脱氢酶显示主 序列相似性，并因此被归类为NAD-依赖性醇脱氢酶的第三家族。这种酶是由10个相同的 亚基组成，每个亚基包含一个紧密的但非共价结合的NAD (H)分子，除Zn2+离子和1-2个Mg2+ 离子外。
[0005] 已发现甲基营养菌中的甲醇芽孢杆菌是质粒依赖性并参与质粒和染色体基因的 一致募集。在甲醇芽孢杆菌MGA3中已经鉴定了携带mdh和五个RuMP途径基因的天然质粒 pBM19 ;pBM19的固化导致在甲醇上生长的能力丧失。在导致本发明的研究中，且以前没有 报道，在生理上非常不同的替代模型菌株PBl (NCMB13113)中显示一个相应的类似质粒， 其被命名为PBM20。
[0006] 已显示NAD依赖性MDH酶可由被分类为nudix水解酶家族中的激活蛋白Act催化 激活。
[0007] 甲醇氧化是试图在宿主微生物中工程化甲基营养菌的主要瓶颈。事实上，即使在 宿主生物体是天然甲基营养菌如甲醇芽孢杆菌的上下文中，MDH活性或表达的修饰对于改 善所需产物的的生长和/或产率是有益的。因此持续需求MDH酶，特别是新型mdh基因，其 可用于生物体的遗传工程化，特别是编码相对于本领域的MDH酶具有改变的或者改进的性 质的新型酶的基因，例如提高的活性或稳定性，或可以以任何方式有利于用于所需宿主的 遗传修饰。
[0008] 为更好地理解甲基营养菌宿主细胞甲醇芽孢杆菌的生理学，本发明人对MGA3和 可替代的野生型菌株PBl的基因组进行了测序。出人意料的是，在此测序的过程中，已经发 现这两种菌株具有多个同种型MDH ;在这两种菌株中鉴定出编码三种独立的NAD依赖性MDH 蛋白的三个基因。因此，在甲醇芽孢杆菌MGA3中，除了先前报道的编码质粒的mdh-MGA3基 因，还鉴定出两个新的基因，这里被称为mdh2-MGA3和mdh3-MGA3。有趣的是，这些新的mdh 基因位于染色体上。在甲醇芽孢杆菌PBl中，也已鉴定出三个新的基因，这里称为mdh-PBl、 mdhl-PBl和mdh2-PBl，第一个位于质粒（质粒pBM20)且后两个位于染色体。所有这些基 因已经被体外重组表达、纯化和进行生化表征。虽然显示一些相似之处，但很显然，这些不 同的MDH酶具有不同的特性，包括它们的活性。基于这些研究特别是序列分析，已经鉴定出 两种不同的MDH亚家族（sub-family)。
[0009] 第一亚家族包括之前描述的菌株MGA3 (mdh-MGA3)的质粒源性mdh基因，以及来 自菌株PBl的两个基因 mdh-PBl和mdhl-PBl (mdh-PBl是质粒来源的且mdhl-PBl位于染 色体），并在此确定为"mdh/mdhl型家族"。第二亚家族包括新型染色体基因 mdh2-MGA3、 mdh3-MGA3和mdh2-PBl，且在本文确定为"mdh2/mdh3型家族"。正是后一亚族构成了本发 明的主题。
[0010] 该mdh2/mdh3型家族的成员相互之间在DNA水平上（参见图1)和所编码的蛋白 质的氨基酸序列水平上具有至少90%的序列同一性（参见图2)。特别是，mdh2-MGA3(SEQ 10勵.1)和111(1113-]\^43(3￡9 10勵.3)的编码序列共享96%的0嫩序列同一1丨生，并且编码 的多肽 Mdh2-MGA3(SEQ ID NO. 2)和 Mdh3-MGA3(SEQ ID NO. 4)共享 96% 的氨基酸同一性 (参见图28)。编码的]?(1112-?81多肽（5￡〇10勵.6)与编码的]\1(1112-]\?^3多肽（5￡〇10 勵.2)91%相同，且其与编码的]\^13-]\?^3多肽（5￡〇10勵.4)92%相同的（参见图28)。
[0011] 另一方面，两个不同的亚家族成员间在60-66%的区域的序列同一'丨生非常低。例 如，111(1112-]\?^3编码序列（3￡〇10勵.1)与111(111-]\?^3编码序列（3￡〇10勵.7)65%相同，并 且编码的]^112-]\?^3多肽（3￡〇10勵.2)与编码的]\1(111-]\?^3多肽（3￡〇10勵.8)61%相 同。mdh3-MGA3 基因 （SEQ ID NO. 3)的编码序列与 mdh-MGA3(SEQ ID NO. 7)66% 相同，并且 编码的]?(1113多肽（5￡〇10勵.4)与]\1(111-]\?^3(5￡〇10勵.8)62%相同。
[0012] 如上面所指出的，生化特性的研究已经揭示了 mdh2/mdh3型家族的MDH酶和mdh/ mdhl 型家族的那些之间的差异。例如，Mdh3-MGA3(SEQ ID NO. 4)和Mdh2-PB1(SEQ ID NO. 6) 具有改善的热稳定性。也观察了底物特异性和不同醇底物活性水平的差异。这开辟了在不 同的醇（例如，乙醇或丙醇）而不只是甲醇的氧化中使用这些酶的可能性。
[0013] 还进行研究以在不同的非甲基营养菌宿主中异源表达基因。这些研究建立了本 发明的新mdh2/mdh3型家族序列在大量不同的宿主细胞遗传工程化中的效用，以引入MDH 活性，从而使甲醇得到利用。在涉及不同宿主的情况下，建议本发明具有广泛的适用性，并 在本文所述的研究中，使用了两种在生物技术表征和生理表征方面非常不同的细菌宿主菌 株，即革兰阴性大肠埃希氏菌和革兰氏阳性枯草芽孢杆菌，并且当修饰以表达本发明的新 的MDH酶时，特别是来自甲醇芽孢杆菌MGA3和甲醇芽孢杆菌PB 1的mdh2/mdh3型家族的酶， 每一种菌株都表现出提高的MDH活性。
[0014] 值得注意的是，本文中所呈现的结果表明，不同的特定的酶在不同的宿主中 可以呈现提高的活性。例如，为了在宿主大肠杆菌中表达MDH活性，甲醇芽孢杆菌 Mdh2-MGA3(SEQ ID NO. 1)给出了最好的结果。MDH酶的选择还可以依赖于表达的环境和宿 主细胞的确切性质和/或培养条件，例如，哪一个特定的act基因共表达。因此，本发明的新 型酶及其编码序列有利地提供了 MDH酶和编码的核酸分子的新的和扩大的集合，用于醇包 括甲醇的氧化，特别是用于宿主细胞的遗传修饰（例如，用于生产重组宿主细胞），例如在 宿主细胞中引入或修饰醇脱氢酶活性，特别是MDH的活性，或将甲基营养菌引入宿主细胞。 如下面进一步描述的，编码本发明的新酶的核酸分子可以单独使用或组合使用。
[0015] 因此，在第一方面，本发明提供了核酸分子，特别是分离的核酸分子，其编码具有 醇脱氢酶活性、特别是甲醇脱氢酶活性的多肽（或蛋白质），其包含或具有（例如由以下组 成）选自下组的核苷酸序列：
[0016] (i)如 SEQ ID N0s:l(mdh2-MGA3)、3(mdh3-MGA3)或 5(mdh2-PBl)中任一项所示的 核苷酸序列；
[0017] (ii)与如SEQ ID NOs: 1、3或5中任一项所示的核苷酸序列具有至少90%序列同 一性，更特别是至少91、92、93、94、95、96、97、98或99%的序列同一性的核苷酸序列；
[0018] (iii)与核苷酸序列SEQ ID NOs: 1、3或5中的任一条简并的核苷酸序列；
[0019] (iv)为SEQ ID NOs: 1、3或5中任一项核苷酸序列的一部分或与SEQ ID NOs: 1、3 或5的序列简并的核苷酸序列的一部分的核苷酸序列；
[0020] (V)编码所有或部分多肽的核苷酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NOs: 2 (Mdh2-MGA3)、4 (Mdh3-MGA3)或 6 (Mdh2-PB1)所示；以及
[0021] (vi)编码多肽的全部或部分的核苷酸序列，所述多肽具有与SEQ ID N0s:2、4或 6中任一项示出的氨基酸序列具有至少90%序列同一性，更特别是至少91、92、93、94、95、 96、97、98或99 %的序列同一性的氨基酸序列；
[0022] 或者核酸分子，其包含与（i)到（vi)中任一项核苷酸序列互补的核苷酸序列。
[0023] 在另一方面，本发明提供了具有醇脱氢酶活性、特别是甲醇脱氢酶的活性的多肽， 其包含或具有（例如由以下组成）选自下组中的氨基酸序列：
[0024] ⑴如SEQ ID NOs :2,4或6中任一项所述的氨基酸序列的全部或部分；以及
[0025] (ii)与SEQ ID NOs :2、4或6中任一项所示的氨基酸序列具有至少90%序列同一 性，优选至少91、92、93、94、95、96、97、98或99%序列同一性的氨基酸序列的全部或部分。
[0026] 本发明的核酸分子有利地允许在宿主生物体引入醇脱氢酶特别是MDH活性或对 其进行修饰。这可以通过修饰生物体来实现，以表达本发明的一种或多种核酸分子。如上 面所指出的，所述核酸分子可以由甲醇芽孢杆菌菌株、特别是MGA3和PBl菌株的mdh基因 获得或者衍生。在一个具体的实施方案中，编码不同的MDH酶（例如，不同的同工酶或来自 不同菌株的酶，或不同的多肽变体等）的核酸分子或由编码不同的MDH酶的核酸分子衍生 的核酸分子可以组合使用。因此可以共表达两种或以上不同的核酸分子。
[0027] 因此，本发明提供了通过在所述生物体中表达本发明的一个或多个核酸分子用于 在宿主生物体中引入或修饰MDH活性的方法。特别的是，所述核酸分子可以是与宿主生物 体异源的或者非天然的。它可以在天然或非天然启动子的控制下表达。
[0028] 因此，在又一个方面，本发明提供了用于在宿主生物体中引入或修饰醇脱氢酶活 性特别是MDH活性的方法，所述方法包括向所述生物体引入如上文所定义的本发明的核酸 分子，以及在表达所述核酸分子的条件下生长（或培养）所述生物体。
[0029] 从这个方面可知，本发明也可以看作提供了用于产生具有醇脱氢酶活性、特别是 MDH活性的多肽的方法，所述方法包括向宿主生物体中引入如上定义的本发明的核酸分子； 以及在产生所述多肽的条件下生长（或培养）所述生物体。宿主生物体可以是天然（例如， 野生型）不具有MDH活性的有机体（即没有或不具有内源性MDH)，并因此在这样一个实施 方案中，本发明提供了向宿主中引入MDH活性。或者，在这样一个实施方案中，可以修饰宿 主以引入将甲醇转化为甲醛的能力，或者，换句话说，修饰宿主以允许利用Cl-碳源、特别 是利用甲醇的初始步骤。
[0030] 在一个可选的实施方案中，宿主生物体可以具有或拥有内源性MDH酶，因此，本发 明的方法可以涉及通过引入编码另外或其他的MDH酶的核酸分子以在宿主中修饰MDH活 性，MDH酶例如可以与宿主是异源的。还包括通过在所述生物体（即，其中引入的核酸分子 编码内源性MDH酶）中引入编码天然MDH酶的核酸分子来过表达MDH活性。
[0031] 可以使用任何期望的碳源作为底物培养或生长经修饰的宿主生物体，底物包括但 不限于甲醇或高级醇。因此在一个实施方案中，本发明的方法可以包括培养或生长含有编 码如本文所定义的外源引入的MDH的一个或多个核酸分子的宿主生物体。
[0032] 在另一个方面，本发明提供经过修饰以引入如上文所定义的本发明的核酸分子的 宿主生物体。
[0033] 特别是，在本发明的这一方面，引入的核酸分子包含与宿主有机体异源的核苷酸 序列。异源序列可以是编码醇脱氢酶（例如MDH)多肽的核苷酸序列，或者它可以是异源表 达调控序列或一些其它序列（例如载体或标记序列）。在内源性表达醇脱氢酶的宿主生物 体的情况下，通过含有编码醇脱氢酶多肽的核酸分子的另一副本可以将经修饰的宿主与未 修饰的宿主生物体区分。换句话说，它可以比未修饰的宿主包含编码核苷酸序列的更多个 拷贝。
[0034] 如上面提到的，可以从甲醇芽孢杆菌、特别是MGA3和PBl的菌株获得（例如分离 或克隆）编码本发明的新型MDH酶的核酸分子。因此，MDH酶可以是来自MGA3的Mdh2或 Mdh3(分别是SEQ ID N0s:2或4)，或来自PBl的Mdh2(SEQ ID N0:6)。然而，除了如上所 示的特定的天然（"野生型"）序列之外，还包括这些序列的变体，其与天然序列具有至少 90%的核苷酸序列同一性且其保留醇脱氢酶活性、特别是MDH活性。此类变体可包括天然 变体，例如自然环境中菌株天然产生的或获自甲醇芽孢杆菌菌株的不同变体，并且其编码 与SEQ ID NOs. 2、4或6的MDH多肽功能上等同的MDH多肽。可选地，变体可以是合成的或 人工变体，例如通过修饰（如突变）SEQ ID NOs. 2、4或6的氨基酸序列或SEQ ID NOs. 1、3 或5的氨基酸序列而获得或衍生。可以使用如上所述本发明的两种或以上不同的核酸分子 的组合。本发明的核酸分子可选地包括两个或以上不同的核苷酸序列，如本文所定义，其编 码具有醇脱氢酶活性的多肽或其补体。修饰可以基于相应变体的提高的甲醇脱氢酶活性来 选择，或者使用分子结构或模型基于蛋白质设计算法预测提高的酶活性来构建。
[0035] 本发明的MDH多肽还可以包括由SEQ ID NOs. 1、3或5的核苷酸序列的片段（部 分）编码的多肽，或可以包含SEQ ID NOs. 2、4或6的氨基酸序列的片段（或部分）或由其 组成。本发明的核苷酸或氨基酸序列的"部分"可以包括或包含至少50、55、60、65、70、75、 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%或更多个序列的 连续核苷酸或氨基酸。
[0036] 宿主生物体可以是任何合适的宿主生物体，但特别是微生物宿主生物体（即微 生物）。它可以是任何原核有机体，但特别是细菌。可以使用任何革兰氏阳性或革兰氏阴 性细菌，但特别提及可以由下列类或属组成的细菌：埃希氏菌属（Escherichia)、棒状杆 菌属（Corynebacterium)和芽孢杆菌属。代表性的宿主生物体包括大肠杆菌（E.coli)、 枯草芽孢杆菌（B. subtilis)和谷氨酸棒杆菌（C. glutamicum)。如上所述，也可使用 甲醇芽孢杆菌或其它甲基营养宿主生物体，例如，甲基单胞菌（Methylomonas)、甲基菌 (Methylobacillus)、甲基杆菌（Methylobacterium)、噬甲基菌（Methylophilus)或甲基球 菌（Methylococcus)。然而，本发明并不限于这些生物体并延及任何微生物宿主。
[0037] 谷氨酸棒杆菌是杆状、非致病性革兰氏阳性土壤细菌。它在需氧和厌氧条件下生 长，且其是生物素营养缺陷型。谷氨酸棒杆菌能够在作为碳和能量的单一或组合来源的各 种底物上生长。其中代谢的底物是糖类如葡萄糖、果糖或蔗糖，和有机酸如L-乳酸和醋酸。 此外，谷氨酸棒杆菌能够在作为唯一碳源的乙醇上生长。它被广泛用于大规模工业生产氨 基酸L-谷氨酸和L-赖氨酸。最近代谢工程的研究表明，谷氨酸棒杆菌也能生产各种其它商 业上关注的化合物，例如其他L-氨基酸、D-氨基酸、二胺如尸胺或腐胺、有机酸如琥珀酸， 和生物燃料如乙醇或异丁醇。
[0038] 根据本发明，本发明的一个或多个核酸分子可以在宿主生物体表达，特别是包括 至少一个异源核酸分子（即包含与宿主异源的核苷酸序列的核酸分子），并且特别是包含 编码MDH多肽的异源序列。因此，可以修饰宿主生物体以表达核酸分子的一个或多个拷贝， 或者可修饰其以表达本发明的许多不同核酸分子的一个或多个拷贝。
[0039] 因此，经修饰（或"工程化"）而表达本发明的MDH的微生物会包含如本文定义的外 源引入的编码MDH的核酸分子。换句话说，该生物体可以用此种编码MDH的核酸分子转化， 并可以被认为是转基因的或重组的有机体。如上所述，所述核酸分子可以编码与宿主同源 的或异源的（即天然或非天然的）MDH酶。因此，可以引入与宿主是天然的基因的其他（或 更多）拷贝。引入的核酸分子可以包括从天然基因或从不同的来源衍生的核苷酸序列。
[0040] MDH可以与其他酶联合表达以允许生物体的新功能。
[0041] 本文所用的"表达"是指核苷酸序列转录为mRNA以及随后所述mRNA翻译成多肽 产物。
[0042] 如本文所指，"过表达"是指核苷酸序列的表达相比或相对于其中没有被根据本发 明的未修饰的生物体中产生的表达水平提高的表达。表达可以在多肽产物（例如MDH酶） 产生的量方面予以考虑，其可以由本领域已知的任何常规方法来确定。例如，可以通过测定 蛋白质活性（即表达的MDH多肽的活性）来确定表达。可选地，可以测定所产生的蛋白质 的量以确定表达水平，例如蛋白质印迹或其他抗体检测系统，或者实际上通过评估或定量 蛋白的任何方法来确定。也可以使用实时PCR。该测定可以是体内或体外测定。
[0043] 可以通过本领域已知的和文献中描述的步骤通过测定醇脱氢酶活性来确定活性， 例如，如下面的实施例中所述。编码的蛋白质的MDH活性例如可以催化甲醇转化为甲醛， 并且在本文中所述活性被定义为每分钟生产1微摩尔的NADH所需的酶的量，各种醇类可 以用作基质，例如乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、异丙醇和1，3_丙二醇。如Hektor et al. (2002 ;Chem277 (49) :46966-46973)先前所描述的，可以用分光光度法测定乙醇脱氢酶 活性。
[0044] 通过本领域已知的任何方法例如从相对于天然基因更强的或未调节的启动子表 达或过表达醇脱氢酶多肽，如通过引入包含编码MDH多肽的核酸序列的核酸分子，例如，天 然基因的拷贝，和/或通过引入编码MDH的核酸分子的多个拷贝。
[0045] 也可工程化生物体以引入额外的或可替代的调控要素。
[0046] 在一个具体的实施方案中，编码MDH的核酸分子可以从非天然的或异源的启动子 表达（即启动子与编码MDH的核苷酸序列是异源的，即不是天然MDH基因的启动子），特别 是非天然或异源的强启动子。因此，在具体实施方案中，编码MDH的基因中不使用其天然启 动子。可以在非天然启动子的控制下引入编码MDH的基因。如本文所指，强启动子是指其表 达的基因在较高水平，或至少高于其天然启动子影响的水平。术语"强启动子"是本领域众 所周知的并广泛使用的术语，许多强启动子是本领域已知的，或者可以通过常规实验来鉴 定。可选地，启动子是甲醇芽孢杆菌的mdh启动子。然而，对启动子的选择没有特别限定。
[0047] 另外，可以使用天然启动子表达MDH基因。本发明包括使用可内源性表达mdh基 因或不内源性表达的微生物。在前者的情况下，可以引入天然基因或其变体或另一 MDH的 天然基因或编码核酸分子的一个或多个额外的拷贝，并且它们可以在天然或非天然启动子 的控制下引入。例如可以使用具有天然启动子的多拷贝载体。在后者的情况下，引入与宿 主是异源的MDH(或编码其的核酸分子），但它可以在与衍生核酸分子的MDH基因是天然或 非天然的启动子的控制下。
[0048] 用于引入基因或核酸分子的方法是本领域已知的并且在文献中有广泛描述，并且 可以使用任何所需的方法。因此可以使用载体引入基因（核酸分子），它可以是自主复制型 载体或允许基因（核酸分子）整合到宿主基因组（如染色体组）的载体。因此可将表达的 基因（核酸分子）引入到表达载体，然后将表达载体引入到宿主细胞中。用于构建表达载 体并将其引入宿主细胞的方法是本领域公知的。方便的是，可以用质粒载体引入编码MDH 的基因并可以用该质粒载体如通过电穿孔转化宿主微生物。方法的选择取决于所使用的微 生物。用于将核酸和载体引入微生物的方法是众所周知的并在文献中有广泛描述。
[0049] 该核酸分子优选编码MDH或其具有MDH活性的部分的多肽或蛋白。
[0050] 优选地，如上述（i)至（vi)部分定义的核酸分子编码多肽或蛋白质，其具有或保 持由SEQ ID N0s:2、4或6中任一项的氨基酸序列限定的MDH多肽的功能或活性。
[0051] 术语"多肽"和"蛋白质"在本文中可互换使用，并且包括任何长度的氨基酸链（即 氨基酸的任何聚合物或低聚物）。
[0052] 如上所指，本发明延及如上文所定义的核苷酸序列的部分或功能片段，其中是指 编码与上述定义的全长蛋白具有相同或基本相同的活性的蛋白质或多肽的部分或片段。确 定由这样的部分或片段编码的蛋白质/多肽是否具有与如上定义的全长多肽/蛋白相同或 基本相同的活性（例如催化或酶促活性）的测试包括上面讨论的那些。通常核酸分子的部 分或功能性片段相对于全长核酸分子会仅具有小的删除，例如，小于50、40、30、20或10个 核苷酸的删除，例如在编码蛋白质的N-末端的5'端、编码蛋白质C末端的3'端或在编码区 域内部，但是如果该片段与如上定义的全长蛋白具有相同或基本相同的活性（例如催化或 酶促活性），也可以进行较大的删除，例如至少60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、 600 或 700 个核苷酸，或小于 60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600 或 700 个核苷酸 的删除。可以容易地测试所编码的多肽或蛋白质的活性，以确定它是否具有与全长多肽或 蛋白相同的活性，例如，如上所述。
[0053] 代表性部分或片段可以包含如SEQ ID NOs: 1、3或5所示的核酸序列的至少50%， 优选至少60、70、75、80、85、90或95 %的连续核苷酸。示例性的部分或片段的大小包括至少 620、700、800、850、900、950、1000、1050、1100 和 1150 个核苷酸。
[0054] 本发明的核酸分子的较短片段可用作探针，例如用于PCR或杂交方案。较短的片 段可以是例如10-30、20-25个核苷酸的长度。这样的探针可用于鉴定与本发明的核酸分子 具有同源性的其他核酸分子的方案。
[0055] 本文所用的术语"核酸分子"指单链或双链的RNA或DNA的聚合物，其任选地包含 合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。这样的多核苷酸的实例包括cDNA、基因组DNA和双 链RNA等。优选地，所述核酸分子是DNA。
[0056] 虽然本文提到的核酸序列包括胸腺嘧啶（"t"）的核苷酸，但可以理解，本发明还 涉及其中胸苷被尿苷取代（"u"）的相应序列。
[0057] 如上所述，本发明包括为SEQ ID NOs: 1、3或5核酸分子的变体的核酸分子，尤其 是功能性等同变体。相比于SEQ ID NOs: 1、3或5的核酸分子，"变体"的核酸分子由此可以 有一个或多个核苷酸的改变。例如，该变体可能具有1、2、3、4或5个或更多个核苷酸的添 力口、取代、插入或删除。
[0058] 在其他方面，本发明提供了具有醇脱氢酶活性、特别是MDH活性的蛋白质（或多 肽），如上文所定义。
[0059] 蛋白质或多肽优选是MDH或其具有MDH活性的部分。更特别的是，该部分保留衍 生其的MDH的特性的功能或活性（参照氨基酸序列SEQ ID NOs. 2、4或6所定义的）。
[0060] 蛋白质或多肽可替代地参照编码其的核酸序列所定义的，并且由此，如上所述，本 发明的蛋白质或多肽可以通过任何本发明的核酸分子编码。
[0061] 本发明延及全长蛋白质分子的功能部分或片段，其中是指与如上所定义的全长蛋 白质具有相同或基本相同的活性的部分或片段，即它们应被认为是功能等同变体。如本文 其他地方所指出的，可以以简单的方式用不同的方法测试该特性。通常，这些功能性片段 相对于全长蛋白质分子会仅具有小的删除，例如小于50、40、30、20或10个氨基酸，虽然如 上所述，但是核酸分子的较大删除也可能是适合的，例如如高达60、70、80、90、100、150、200 个氨基酸，或至少60、70、80、90、100、150、200个氨基酸。在所有情况下，片段应与如上述所 定义的全长蛋白质具有相同或基本相同的活性，即它们应被认为是功能上等同的变体。这 些删除可以在N末端、C末端，或者它们可以是内部删除。
[0062] 代表性部分或片段可以包含如SEQ ID N0s:2、4或6所示的氨基酸序列的至少 50%，优选至少60、70、75、80、85、90或95 %的连续氨基酸。
[0063] 如上定义的本发明的多肽因此包括SEQ ID N0s:2、4或6的变体，例如与所记载的 序列具有序列一定水平同一性的序列。这样的变体可以是天然存在的变体，如在其他物种 中发现的可比蛋白质或同源物，或者更具体的是其他微生物内发现的变体（其具有如本文 其他地方所定义的编码的蛋白质的功能特性）。
[0064] 也可以例如通过使用本领域已知的标准分子生物学技术合成地生成如本文所定 义的天然存在的多肽的变体，例如标准诱变技术，如定点突变或随机突变（例如使用基因 改组或易错PCR)。这样的诱变技术可以用于开发具有改进的或不同的催化性质的酶。 [0065] 也可使用如本文所定义的多肽的衍生物。衍生物是指代替天然存在的氨基酸的上 述多肽或其变体，其含有氨基酸的结构类似物。也可以发生衍生或修饰（例如，蛋白质中的 氨基酸的标签化、糖基化、甲基化），只要该蛋白质的功能没有受到不利的影响。
[0066] "结构类似物"是指非标准氨基酸。可使用的这种非标准或结构类似物的氨基酸 的实例是D氨基酸、酰胺等排物（如N-甲基酰胺，逆酰胺（retro-inverse amide)、硫代酰 胺、硫酯、磷酸酯、酮亚甲基、羟基亚甲基、氟乙烯基、（E)-乙烯基、亚甲基氨基、硫代亚甲基 (methylenethio)或烷烃）、L-N甲基氨基酸、D- a甲基氨基酸、D-N-甲基氨基酸。
[0067] 可以通过任何方便的方法评估序列同一性。然而，为了确定序列之间的序列同 一'I"生程度，进行序列的多重比对的计算机程序是有用的，例如Clustal W(Thompson et al.，（1994)Nucleic Acids Res?(核酸研究），22:4673-4680)。比较和比对序列对的程 序，如 ALIGN(Myers et al.，（1988)CABI0S, 4:11-17)、FASTA(Pearson et al.，（1988) PNAS, 85:2444-2448 ;Pearson (1990)，Methods Enzymol?(酶学方法），183:63-98)和有缺 陷的 BLAST (Altschul et al.，（1997) Nucleic Acids Res?(核酸研究），25:3389-3402),也 可用于该目的。此外，在欧洲生物信息研究所的大理服务器（Dali server)提供了基于结 构的蛋白质序列比对出〇1111(1993)了.]\1〇1.81〇1.，233:123-38 ;11〇1111(1995)1'代11(18 81〇(*6111. Sci. , 20:478-480 ；Holm(1998)Nucleic Acid Res. , 26:316-9)〇
[0068] 可以使用标准的BLAST参数来确定多重序列比对和同一性百分比计算（使用来自 可用的所有生物的序列、矩阵Blosum 62、成本差距：存在11，延长1)。或者，可使用下列程 序和参数：程序：Align Plus 4,4. 10 版（Sci Ed Central Clone Manager Professional Suite)。DNA比较：全局比较，标准线性评分矩阵，错配罚分=2,开放空位罚分=4,延长空 位罚分=1。氨基酸比较：全局比较，BL0SUM62评分矩阵。
[0069] 本发明的另一实施方案提供了构建体，例如重组构建体，其包含可操作地连接于 异源表达调控序列的本文所定义的本发明的核酸分子。在上下文中，应当理解的是，表达调 控序列与核酸分子会是异源的（即非天然的），更具体为与编码醇脱氢酶多肽的核苷酸序 列是异源的。在这点上，当编码核苷酸序列不是天然存在的序列时，表达调控序列将与衍生 其的核苷酸序列是异源的。如上所述，可使用不同核酸分子的组合。
[0070] 这种表达调控序列通常会是启动子。因此，构建体将优选包括非天然启动子，特别 是非天然强启动子。任选地，所述构建体还可以含有另外的一个或多个基因和/或一个或 多个合适的调控序列。可选的另外的一个或多个基因可以在与本发明的编码MDH的核酸分 子相同的启动子的控制下。任选的一个或多个调控序列可以是非天然调控序列（即相对于 编码核苷酸序列或核苷酸序列是非天然的）。
[0071] 在本发明的上下文中，术语"可操作地连接"是指单个核酸片段上的两个或多个核 酸分子的连接，从而其中一个的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码序列 的表达（即编码序列在启动子的转录控制下）时，启动子可操作地与编码序列连接。编码 序列可以可操作地连接有义或反义方向的调控序列。
[0072] 术语"调控序列"指位于编码序列上游（5'非编码序列）、内部或下游（3'非编码 序列）的核苷酸序列，并且其影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。调控 序列可包括启动子、操纵基因、增强子和翻译前导序列。本文所用的术语"启动子"指能够 控制编码序列或RNA的表达的核苷酸序列。一般而言，编码序列位于启动子序列的3'端。 启动子可以整个源于天然基因，或者由源于自然界中发现的不同启动子的不同要素组成， 或甚至包括合成的核苷酸区段。还应当进一步认识到，由于在大多数情况下，尚未完全确定 调控序列的确切边界，因此不同长度的核酸片段可以具有相同的启动子活性。
[0073] 本发明的另一个实施方案提供了包含如本文所定义的核酸分子或构建体的载体。
[0074] 更具体地，可以构建包含本发明的编码MDH的一种或多种核酸分子（或本发明的 构建体）的载体。载体的选择可取决于宿主微生物、将要用于转化宿主细胞的方法、用于蛋 白质表达的方法，或者载体的另一目的用途。本领域技术人员清楚地知道，遗传因子必须存 在于载体中以便成功地转化、筛选并增殖含有本发明的编码MDH的核酸分子或构建体的宿 主细胞。本领域技术人员也将认识到不同的独立转化事件将导致不同的表达水平和模式， 因而可能需要筛选多个事件以获得显示期望的表达水平和模式的细胞。这种筛选可以尤其 通过DNA的Southern分析法、mRNA表达的Northern分析法、蛋白质表达的Western分析 法来完成。
[0075] 本发明还提供了微生物或宿主，其可以是如上讨论的任何宿主生物体，如大肠杆 菌、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌，其含有本发明的一种或多种的核酸分子、构建体或载 体。可以从遗传上对宿主进行操作从而引入或改变MDH的表达。这可通过在非天然、优选 强启动子的控制下引入本发明的编码MDH的核酸的一个或多个拷贝来实现。因而遗传物质 存在于宿主生物体（即存在外源遗传物质）中而不存在于天然存在的生物体中。
[0076] -般情况下，使用转化方法引入外源遗传物质。转化通常会涉及还包含能够鉴定 成功转化的微生物的基因质粒或其它载体，如用于抗生素耐药性的基因（例如针对氨苄青 霉素）或一些其它标记物。用于筛选转化体的其他方法是本领域技术人员已知的，并且其 包括使用光敏感载体即勒克斯基因，这会导致阳性集落在黑暗背景中突出。用于细菌转化 的其他合适的媒介包括粘粒和噬菌体分子。
[0077] 现参照以下非限制性实施例进一步描述本发明。但是应当理解，这些实施例虽然 说明本发明的实施方案，但仅是以示例性的方式给出。从上面的讨论和这些实施例，本领域 技术人员可以确定本发明的必要特征，并且在不背离其精神和范围的情况下，可以对本发 明进行各种变化或修改，以使其适应各种用途和条件。因此，除了那些本文示出和描述的， 从前面的描述可知，本发明的各种修改对本领域技术人员而言将是显而易见的。这些修改 也意图落入所附权利要求书的范围内。本文所引用的所有文件都通过引用并入本文。
[0078] 在实施例中，参考了下述附图：
[0079] 胤1 :对甲醇芽孢杆菌 mdh-MGA3、mdh2-MGA3、mdh3-MGA3、mdh-PBl、mdhl-PBl 和 mdh2-PBl的核苷酸序列比对；
[0080] Ml: (A)对编码的甲醇芽孢杆菌MGA3Mdh、Mdh2和Mdh3以及PBlMdKMdhl和Mdh2 蛋白质的基本序列比对。（B)对mdh2/mdh3亚家族（即甲醇芽孢杆菌MGA3 Mdh2和Mdh3以 及PBl Mdh2蛋白）的基本序列比对。
[0081] M3 :体外测试纯化的Mdh (黑色）、Mdh2 (暗灰色）和Mdh3 (浅灰色）对各种醇 (200mM)的催化活性。（A)体外分析来自甲醇芽孢杆菌MGA3的MDHs的底物特异性。除了 戊醇（300mM)和己醇（50mM)之外，使用的醇底物的浓度为500mM。根据以一式三份进行的 两个实验的平均值来计算数据。（B)体外分析来自甲醇芽孢杆菌PBl的MDH的底物特异性。 除了戊醇（300mM)和己醇（50mM)之外，使用的醇底物的浓度为500mM。根据以一式三份进 行的两个实验的平均值来计算数据。
[0082] Mi:⑷体外测定用于Mdh、Mdh2和Mdh3催化活性的最适温度。（B)在体外进行 对来自甲醇芽孢杆菌PBl的MDH蛋白催化的最适温度条件的测定：计算对于500mM乙醇的 比活性；以一式三份进行测定。
[0083] M5 : (A)体外测试MGA3 Mdh、Mdh2和Mdh3的温度稳定性。酶测定前，在45°C或 60°C时孵育酶。（B)体外测试PBl Mdh、Mdhl和Mdh2的温度稳定性。酶测定前，在45°C或 60°C时孵育酶。
[0084] M_6 :在Act的存在下测试Mdh、Mdh2和Mdh3的催化活性，并与Act不存在时测定 的活性水平进行比较。（A)体外测试来自甲醇芽孢杆菌MGA3的MDHs的活化。用500mM酒 精和5 ii g/ml的MDH和Act蛋白质以一式三份进行测试。（B)体外测试来自甲醇芽孢杆菌 PBl的MDH的活化。用500mM酒精和5 ii g/ml的MDH和Act蛋白质以一式三份进行测试。
[0085] Ml = (A)克隆策略。（B)act_pHCMC04质粒的物理图谱。
[0086] S8 :使用乙醇和甲醇作为底物进行体外测试时重组枯草芽孢杆菌菌株的活性。
[0087] M9 =13C-甲醇的加入前（S卩零时间点）和加入后（S卩30和90分钟的时间点）不 同代谢产物的质量同位素分数Ml的％。三条线表示来自三个独立生物学重复的结果。A : 谷氨酸棒杆菌 A aid pEKEX3 ;B :表达 Mdh2 (pVWExl-Mdh2)、Hps 和 Phi (pEKEX3 - Hps+Phi) 的谷氨酸棒杆菌A aid菌株。PEP :磷酸烯醇丙酮酸盐；2/3P :2-和3-磷酸甘油酸盐；FBP : 果糖二磷酸盐；R5P :核糖-5-磷酸盐。
[0088] ai〇 :用13C甲醇或13C甲醛作为底物的代谢标记。（A)表达mdh2和hps phi的 A frmA细胞且13C甲醇作为碳源。（B)表达hps和phi的A frmA细胞且13C甲醒作为碳源。
[0089] Mli :合成操纵子的装配。将每个连续基因引入Swal/Bgl II限制性位点中。该操 纵子中最后一个基因含有His6标签。在13C-标记的试验（见实施例18)中使用AMhxlB-和 AMABGFTPrpe-pHCMC04质粒。RBS :核糖体结合位点。
[0090] ^12 :在枯草芽胞杆菌168中表达SDS-PAGE纯化的蛋白。使用的枯草芽孢杆菌 菌株中包含图11所示的任一项构建体。用HisTrap柱纯化蛋白并使用Vivaspin柱浓缩。 用框形表示蛋白条带。M :分子量标记。
[0091] 图13 =13C-甲醇加入前（即零时间点）和加入后（即30和90分钟的时间点）不 同代谢产物的质量同位素分数Ml的％。两条线表示来自两个独立的生物学重复的结果。 (A):枯草芽孢杆菌168pHCMC04 ; (B):枯草芽孢杆菌168AM3AhxlB-pHCMC04 ; (C):枯草芽孢 杆菌168AM3ABGFTPrpe-pHCMC04。PEP :磷酸烯醇丙酮酸盐；2/3PG :2_和3-磷酸甘油酸盐； FBP :果糖二磷酸盐。 实施例
[0092] 表1 :本研究中使用的细菌菌株和质粒
[0093]
【权利要求】
1. 核酸分子，其编码具有醇脱氢酶活性、特别是甲醇脱氢酶活性的多肽，其包含或具有 选自下组的核苷酸序列： (1)如3￡〇10勵8:1〇11(1112-]\?^3)、3(111(1113-]\?^3)或5(111(1112-?81)中任一项示出的核苷 酸序列； (ii) 与SEQ ID N0s:l、3或5中任一项示出的核苷酸序列具有至少90%序列同一性， 更特别是至少91、92、93、94、95、96、97、98或99%的序列同一性的核苷酸序列； (iii) 与核苷酸序列SEQ ID NOs: 1、3或5中任一序列简并的核苷酸序列； (iv) 为SEQ ID NOs: 1、3或5中任一条核苷酸序列的一部分或与SEQ ID NOs: 1、3或5 的序列简并的核苷酸序列的一部分的核苷酸序列； (V)编码 SEQ ID N0s:2(mdh2-MGA3)、4(mdh3-MGA3)或 6(mdh2-PBl)中任一个示出的氨 基酸序列的多肽的全部或部分的核苷酸序列； (vi)编码多肽的全部或部分的核苷酸序列，所述多肽具有与SEQ ID N0s:2、4或6中任 一个示出的氨基酸序列具有至少90%序列同一性，更特别是至少91、92、93、94、95、96、97、 98或99%的序列同一性的氨基酸序列； 或者核酸分子，其包含与（i)到（vi)中任一项的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
2. 多肽，其具有醇脱氢酶活性、特别是甲醇脱氢酶的活性，并且其包含或具有选自下组 的氨基酸序列： ⑴如SEQ ID NOs: 2、4或6中任一项示出的氨基酸序列的全部或部分；以及 (ii)与SEQ ID N0s:2、4或6中任一项示出的氨基酸序列具有至少90%序列同一性， 更特别是至少91、92、93、94、95、96、97、98或99%的序列同一性的氨基酸序列的多肽的全 部或部分。
3. 包含权利要求1中所定义的核酸分子的构建体。
4. 如权利要求3所述的构建体，其中所述核酸分子可操作地连接于异源表达调控序 列。
5. 包含权利要求1或3中任一项所定义的核酸分子或构建体的载体。
6. 宿主微生物，已经向其中引入了权利要求1、3或4中任一项所述的核酸分子、构建体 或载体。
7. 如权利要求5所述的宿主微生物，其中所述宿主微生物是选自埃希氏菌属 (Escherichia)、棒状杆菌属（Corynebacterium)或芽抱杆菌属（Bacillus)的细菌。
8. 如权利要求5或6所述的宿主生物体，其中所述宿主生物体是大肠杆菌 (E. coli)、谷氨酸棒杆菌（C. glutamicum)、枯草芽孢杆菌（B. subtilis)或甲醇芽孢杆菌 (B. methanolicus)〇
9. 用于在宿主生物体中引入或修饰醇脱氢酶活性、特别是MDH活性的方法，所述方法 包括向所述生物体引入权利要求1中所定义的本发明的核酸分子，以及在表达所述核酸分 子的条件下，生长（或培养）所述生物体。
【文档编号】C12N9/00GK104220591SQ201380016124
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年1月25日 优先权日:2012年1月25日
【发明者】特吕格弗·布朗特赛特, 唐杰·玛丽特·杰克坎·海格斯特, 安妮·克罗格, 威海姆·约翰内斯·曲克斯, 马克·贾恩·雅克布·伯恩哈德·斯, 巴德, 茱莉亚·沃浩特乔纳斯·米勒, 帕特里克·基弗伊娃·珀特赫夫, 沃克尔·F·文德斯彻, 伦纳特·莱斯梅尔, 史蒂芬妮·海克斯, 珍·查尔斯·珀尔泰斯 申请人:森文特公司, 格罗宁根大学, 苏黎世联邦理工学院