在针对产丁醇生物的培养基中补充乙酸盐的制作方法

在针对产丁醇生物的培养基中补充乙酸盐的制作方法
【专利摘要】本发明涉及工业微生物和醇生产领域。更具体地，本发明涉及当微生物在包含乙酸盐的发酵培养基中生长时通过重组微生物改善丁醇异构体的生产，所述重组微生物包含经工程化的丁醇途径和破坏的在发酵过程中产生副产物的途径的基因的活性。在实施例中，在包含乙酸盐作为2碳补充物的发酵培养基中，重组微生物具有提高的生长速率。
【专利说明】在针对产丁醇生物的培养基中补充乙酸盐

【技术领域】
[0001] 本发明涉及工业微生物和醇生产领域。更具体地，本发明涉及当微生物在包含乙 酸盐的发酵培养基中生长时通过重组微生物改善了丁醇异构体的发酵生产，所述重组微生 物包含经工程化的丁醇途径。
[0002] 相关申请的夺叉引用
[0003] 本申请根据35U.S.C. § 119(e)要求提交于2012年3月23日的美国临时专利申 请序列号61/615,174的优先权，并且其全文以引用方式并入本文。
[0004] 引用经由Efs-ffeb以电子方式递夺的序列表
[0005] 以电子方式递交的序列表的内容（20120315_CL5681USNP_SEQLIST_ST25 ;大小： 294, 486 ;创建日期：2013年3月14日）随同此文件提交，其全文以引用方式并入本文。

【背景技术】
[0006] 丁醇是一种具有多种应用的重要工业化学品，其中其作为燃料或燃料添加剂的潜 力尤为重要。丁醇是优选的燃料或燃料添加剂，因为它在标准内燃机中燃烧时仅生成〇)2并 且几乎不产生或根本不产生S0x*N0x。尽管丁醇是一种四碳醇，但是其具有与汽油相似的 能含量，并且可以与任何化石燃料共混。另外，丁醇的腐蚀性不及乙醇，是目前为止最优选 的燃料添加剂。
[0007] 丁醇也对燃料电池产业中的氢分配问题的具有潜在影响。如今，由于氢的运输和 分配存在安全隐患，燃料电池饱受困扰。然而，可以容易地对丁醇重整其氢含量，并且可以 通过现有的加油站以燃料电池或汽车所需的纯度进行分配。丁醇也在塑料工业中被用作化 学原料、以及在食品和风味剂工业中被用作食品级的萃取剂。每年，通过石油化学手段生产 100至120亿磅的丁醇，并且对该日用化学品的需求将来很可能还会增加。
[0008] 化学合成的异丁醇方法是已知的，如羰基合成、一氧化碳的催化氢化（Ullmann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry,第 6 版，Wiley-VCH Verlag GmbH and Co., Weinheim，Germany,第5卷，第716-719页（2003))和甲醇与正丙醇的格尔伯特缩合 (Carlini 等人，J.Molec. Catal.A. Chem.，220 :215-220(2004))。这些工艺利用衍生自石油 化学品的起始材料，通常昂贵，并且对环境不友好。由植物来源的原材料生产异丁醇能够使 化石燃料的使用最小化。
[0009] 作为酵母发酵的副产物，生物方法产生的异丁醇是微量的。它是由酵母不完全代 谢氨基酸形成的"杂醇油"的一种次要组分。异丁醇具体地讲是由L-缬氨酸的分解代谢 制得的。在L-缬氨酸的胺基作为氮源被利用后，所得的a-酮酸被酶脱羧并还原成异丁 醇，这就是所谓的 Ehrlich 途径（Dickinson 等人，J. Biol. Chem. 273 :25752-25756,1998) ("Dickinson")。发酵培养基中加入外源L-缴氨酸可提高异丁醇的收率，如Dickinson等 人所述，其中据报道通过在发酵液体培养基中提供浓度为20g/L的L-缬氨酸能获得3g/L 的异丁醇收率。然而，对于工业规模生产异丁醇使用缬氨酸为原料成本过高。
[0010] 先前在例如美国专利7, 851，188和7, 993, 889中已经描述了表达经工程化的生物 合成途径的微生物用于直接由糖类产生丁醇，包括异丁醇。此类产丁醇生物还可包括为了 使丁醇异构体收率最大化而破坏参与发酵过程中副产物形成的某些基因。这些参与副产物 形成的基因包括对于形成乙醇（参见美国专利申请公布20090305363)和形成异丁酸必需 的基因。（参见PCT专利申请公布W02012/129555)。破坏了对于形成乙醇必需的基因（例 如，PDC基因）的微生物需要外源的2碳补充物用于正常生长。通常通过在培养基中添加 少量乙醇满足对于2碳补充物的需要。例如，美国专利申请公布20090305363(以引用方式 并入本文）描述了基因敲除了 roc的酵母菌株不能在包含2%葡萄糖作为碳源的培养基中 生长，但发现在补充了少量乙醇的包含葡萄糖的培养基上生长良好。
[0011] 在一些情况下，除了破坏PDC基因，破坏对于生成异丁酸必需的基因（例如，ALD6) 的产丁醇生物可改变生长和产生丁醇的能力，即使在乙醇被用作2碳补充物时。虽然本领 域已有对此类挑战的方法的描述，例如通过工程化所述菌株以降低2碳依赖（参见，例如， 美国专利申请公布20120156735)，替换或补充此类策略的替代形式或补充的方法将代表本 领域的进展。


【发明内容】

[0012] 本文提供了生产丁醇的方法，其包括：
[0013] a.提供重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含：
[0014] i.经工程化的丁醇生物合成途径；以及
[0015] b.使a)的宿主细胞与发酵培养基接触，所述发酵培养基包含：
[0016] i?可发酵的碳底物；和
[0017] ii乙酸盐；
[0018] 其中所述重组宿主细胞已经经工程化以降低或消除丙酮酸脱羧酶（roc)活性以 及任选地醛脱氢酶活性；并且由此经由所述经工程化的丁醇生物合成途径来直接由可发酵 的碳底物产生丁醇。在实施例中，将乙酸盐加入到发酵培养基。在实施例中，乙酸盐以足以 使所述宿主细胞生长的量存在。在实施例中，乙酸盐以足以改善丁醇产生的量存在。在实 施例中，将乙酸盐加入到发酵培养基。在实施例中，乙酸盐来自可再生的原料源。
[0019] 本发明的一个实施例涉及生产丁醇的方法，其包括：
[0020] a.提供重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含：
[0021] i.经工程化的丁醇生物合成途径；以及
[0022] b.使a)的宿主细胞与发酵培养基接触，所述发酵培养基包含：
[0023] i.可发酵的碳底物；和
[0024] ii对于a)的宿主细胞的生长以及对于丁醇产生足够量的作为2碳补充物的乙酸 盐，其中将所述乙酸盐加入到所述发酵培养基；
[0025] 其中所述重组宿主细胞已经经工程化以降低或消除丙酮酸脱羧酶（roc)活性和 醛脱氢酶活性；并且由此经由所述经工程化的丁醇生物合成途径来直接由可发酵的碳底物 产生丁醇。
[0026] 本发明的一个实施例涉及生产异丁醇的方法，其包括下列底物至产物的转化：
[0027] a)丙酮酸至乙酰乳酸（途径步骤a);
[0028] b)来自a)的乙酰乳酸至2, 3-二羟基异戊酸（途径步骤b);
[0029] c)来自b)的2, 3-二羟基异戊酸至a _酮异戊酸（途径步骤c);
[0030] d)来自c)的a _酮异戊酸至异丁醛（途径步骤d);以及
[0031] e)来自d)的异丁醛至异丁醇（途径步骤e);
[0032] 并且其中
[0033] i)步骤a)的底物至产物的转化是通过乙酰乳酸合酶进行的；
[0034] ii)步骤b)的底物至产物的转化是通过乙酰羟酸异构还原酶进行的；
[0035] iii)步骤c)的底物至产物的转化是通过二羟酸脱水酶进行的；
[0036] iv)步骤d)的底物至产物的转化是通过a _酮酸脱羧酶进行的；并且
[0037] V)步骤e)的底物至产物的转化是通过醇脱氢酶进行的；
[0038] 由此经由所述工程化的生物合成途径来直接由丙酮酸产生异丁醇。
[0039] 本发明的一个实施例涉及生产异丁醇的方法，其包括下列底物至产物的转化：
[0040] a)丙酮酸至乙酰乳酸（途径步骤a);
[0041] b)来自a)的乙酰乳酸至2, 3-二羟基异戊酸（途径步骤b);
[0042] c)来自b)的2, 3-二羟基异戊酸至a _酮异戊酸（途径步骤c);
[0043] d)来自c)的a -酮异戊酸至异丁酰-CoA (途径步骤f);以及
[0044] e)来自d)的异丁酰-CoA至异丁醛（途径步骤g);
[0045] f)来自e)的异丁醛至异丁醇（途径步骤e);
[0046] 并且其中
[0047] i)步骤a)的底物至产物的转化是通过乙酰乳酸合酶进行的；
[0048] ii)步骤b)的底物至产物的转化是通过乙酰羟酸异构还原酶进行的；
[0049] iii)步骤c)的底物至产物的转化是通过二羟酸脱水酶进行的；
[0050] iv)步骤d)的底物至产物的转化是通过支链酮酸脱氢酶进行的；
[0051] v)步骤e)的底物至产物的转化是通过乙酰化醛脱氢酶进行的；并且
[0052] vi)步骤f)的底物至产物的转化是通过醇脱氢酶进行的；
[0053] 由此经由所述经工程化的生物合成途径来直接由丙酮酸产生异丁醇。
[0054] 本发明的一个实施例涉及组合物，其包含：
[0055] a)重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含：
[0056] i)经工程化的丁醇生物合成途径；和
[0057] b)发酵培养基，所述发酵培养基包含：
[0058] i)可发酵的碳底物；和
[0059] ii)对于a)的宿主细胞的生长以及对于丁醇产生足够量的乙酸盐；
[0060] 其中所述重组宿主细胞已经经工程化以降低或消除丙酮酸脱羧酶（roc)活性和 醛脱氢酶活性。
[0061] 在实施例中，将乙酸盐加入到发酵培养基。在实施例中，乙酸盐是来自可再生的原 料源。在实施例中，乙酸盐和碳底物均来自可再生的原料源。
[0062] 本发明的一个实施例涉及组合物，其中所述发酵培养基还包含丁醇。
[0063] 本发明的一个实施例涉及生产丁醇的方法，其包括将所述组合物保持在通过工程 化的丁醇生物合成途径直接由可发酵的碳底物产生丁醇的条件下。
[0064] 本发明的一个实施例涉及由本文所公开的方法而产生的丁醇。
[0065] 在一些实施例中，所述具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽是roci、PDC5、PDC6、或它们 的组合。在一些实施例中，所述具有醛脱氢酶活性的多肽是ALD2、ALD3、ALD4、ALD5、ALD6、 或它们的组合。
[0066] 在一些实施例中，所述宿主细胞已经经工程化或进化以降低或消除对于用于它们 生长的外源二碳底物补充物的需求。
[0067] 在一些实施例中，所述宿主细胞包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源多核 苷酸、编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源多核苷酸、或两者。
[0068] 在一些实施例中，所述宿主细胞是细菌或酵母。
[0069] 在一些实施例中，所述宿主细胞是经受异丁醇产生条件的全细胞催化剂。
[0070] 在一些实施例中，所产生的丁醇是异丁醇。在一些实施例中，所产生的丁醇是 1-丁醇。
[0071] 在一些实施例中，所述方法还包括回收所述丁醇。在一些实施例中，所述回收是通 过蒸馏、液-液萃取、吸附、滗析、全蒸发、或它们的组合进行的。在一些实施例中，所述方法 还包括从所述发酵培养基除去固体。在一些实施例中，所述除去步骤发生在回收步骤之前。 在一些实施例中，所述除去是通过离心、过滤或滗析进行的。

【专利附图】

【附图说明】
[0072] 图1描绘了不同的异丁醇生物合成途径。标记为"a"、"b"、"c"、"d"、"e"、"flP "g"的步骤代表下述底物至产物的转化。步骤"a"可由例如乙酰乳酸合酶催化。步骤"b" 可由例如乙酰羟酸还原异构酶催化。步骤"c"可由例如二羟酸脱水酶催化。步骤"d"可由 例如支链酮酸脱羧酶催化。步骤"e"可由例如支链醇脱氢酶催化。步骤"f"可由例如支链 酮酸脱氢酶催化。步骤"g"可由例如乙酰醛脱氢酶催化。
[0073] 图2描绘了 1- 丁醇生物合成途径。标记为"&"、％"、"(："、"(1"、"6"、和"广的步骤 代表下述底物至产物的转化。步骤"a"可由例如乙酰-CoA乙酰转移酶催化。步骤"b"可 由例如3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶催化。步骤"c"可由例如巴豆酸酶催化。步骤"d"可由 例如丁酰基-CoA脱氢酶催化。步骤"e"可由例如丁醛脱氢酶催化。步骤"f"可由例如丁 醇脱氢酶催化。

【具体实施方式】
[0074] 本文引用的所有文件，包括期刊文章或摘要、已发表的或对应于美国或外国专利 申请的、公布的或外国专利的、或任何其他文件，每一份整体以引用方式并入本文，包括被 引用文件中存在的所有数据、表格、图片和文字。
[0075] 本领域的那些技术人员将认识到，或能够使用不超出常规的实验探知本文所述发 明的具体实施例的多个当量。此类当量旨在由权利要求书所涵盖。
[0076] 本文提供的是使用表达经工程化的丁醇生物合成途径并且破坏了一个或多个参 与发酵过程中副产物形成的基因的重组微生物发酵生产丁醇异构体的方法，其中将乙酸盐 加入到所述发酵培养基。
[0077] 如本文所公开，申请者已经发现当缺失了 PDC基因（并且任选地缺失ALD6基因） 的产丁醇生物在带有乙酸盐（作为外源2碳补充物）的发酵培养基中生长时，改善了生长 速率或丁醇异构体产生。由于乙酸盐比乙醇便宜，使用乙酸盐作为2碳补充物降低了丁醇 异构体的生产成本。
[0078] 在实施例中，具有roc-K〇表型的宿主细胞可包含降低或消除了对用于它们生长 的外源二碳底物补充物的需求。例如，具有roc-K〇表型的宿主细胞可经工程化（包括但不 限于例如包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源多核苷酸和/或编码具有磷酸转乙 酰酶活性的多肽的异源多核苷酸）或进化以降低或消除对用于生长的2碳补充物的需求。 虽然在此类实施例中，至少在理论上，乙酸盐对于满足2碳营养缺陷型可能不是绝对必需 的，如例子中所述，本文提供的方法能改善使用此类宿主细胞的丁醇产生。
[0079] 除非另行定义，否则本文所用的所有科技术语的含义与本发明所属领域的普通技 术人员通常理解的一样。如发生矛盾，以本专利申请（包括其定义）为准。此外，除非上下 文另有所需，单数术语将包括复数并且复数术语将包括单数。为所有目的，所有的出版物、 专利、以及本文提及的其它参考资料均全文以引用方式并入本文。
[0080] 下文公开了合适的方法和材料，虽然在本发明的实施或试验过程中也可以使用与 本文所公开的那些类似或等同的方法和材料。材料、方法和例子仅是例示性的并且不旨在 进行限制。根据【具体实施方式】和权利要求，本发明的其他特点和优点将显而易见。为了进 一步限定本发明，本文提供了以下术语和定义。
[0081] 如本文所用，术语"包含 / 包括（comprises、comprising、includes、including) "、 "具有（has、having) "、"含有（contains、containing) "或它们的任何其它变型将被理解为 是指包括指定的整数或整数组但不排除任何其它整数或整数组。例如，包含一系列元素的 组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而能够包括其它未明确列出 的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非明确指明相 反，"或"是指包含性的"或"，并且不指排他性的"或"。例如，以下中任一者均满足条件A或 B :A是真的（或存在的）且B是假的（或不存在的）、A是假的（或不存在的）且B是真的 (或存在的）、以及A和B都是真的（或存在的）。
[0082] 如本文所用，如整个说明书和权利要求中所使用的，术语"由...组成"或诸如 "由...组成"的不同时态的变型表明包括任何列举的整数或整数组，但是无附加整数或整 数组可加入到指定的方法、结构或组合物中。
[0083] 如本文所用，如整个说明书和权利要求中所使用的，术语"基本上由...组成"或 诸如"基本上由...组成"的不同时态的变型表明包括任何列举的整数或整数组，并且任选 地包括未显著改变指定的方法、结构或组合物的基本或新颖特性的任何列举的整数或整数 组。参见 M.P.E.P. §2111.03。
[0084] 此外，涉及元素或组分实例（即出现）的数目在本发明元素或组分前的不定冠词 "一个"或"一种"旨在为非限制性的。因此，应将"一个"或"一种"理解为包括一个或至少 一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。
[0085] 本文所用术语"发明"或"本发明"为非限制性术语，并且不旨在意指本发明的任 何单独实施例，而是涵盖如专利申请所述的所有可能的实施例。
[0086] 如本文所用，修饰本发明的成分或反应物的量或本文所述反应条件的术语"约"是 指可以通过例如以下方式而发生的用数字表示的量的变化：在真实世界中用于制备浓缩物 或溶液的一般测量和液体处理操作；通过这些操作中非故意的误差；通过用于制备组合物 或执行方法的成分的制造、来源或纯度中的差异；等。术语"约"还包括由于产生自特定起 始混合物的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语"约"来修饰，权利要求 包括量的等同量。在一个实施例中，术语"约"指在报告数值的10%范围内，并且有时在报 告数值的5%范围内。
[0087] 在一些情况下，如本文使用的"生物质"是指产生发酵产物的微生物的细胞生物 质，通常单位为g/L干细胞重（dew)。
[0088] 术语"发酵产物"包括所关注的任何所需的产物，包括但不限于1-丁醇、异丁醇 等。
[0089] 术语"丁醇异构体"或"丁醇"是指1-丁醇、异丁醇、或它们的混合物。异丁醇也 被称为2_甲基-1-丙醇。
[0090] 本文所用术语"丁醇生物合成途径"是指产生1-丁醇或异丁醇的酶途径。例如， 美国专利7, 993, 889公开了丁醇生物合成途径，其以引用方式并入本文。
[0091] 术语"异丁醇生物合成"途径是指产生异丁醇的酶途径。有时"异丁醇生物合成途 径"与"异丁醇生产途径"同义地被使用。
[0092] 本文所用术语"1-丁醇生物合成途径"是指产生1-丁醇的酶途径。
[0093] "重组宿主细胞"被定义为经过遗传学操作以表达生物合成生产途径的宿主细胞， 其中所述宿主细胞相对于未改性的宿主细胞产生生物合成产物的量更大或产生未改性宿 主细胞通常不会产生的生物合成产物。
[0094] 应用于丁醇生物合成途径的术语"经工程化的"是指所述丁醇生物合成途径经过 操作使得来自丙酮酸通过经工程化的丁醇生物合成途径的碳通量最大化，从而直接增加产 自可发酵碳底物的丁醇数量。此类工程化包括表达异源多核苷酸或多肽、过表达内源多核 苷酸或多肽、将天然不定位在细胞溶胶的蛋白质定位在细胞溶胶、增加辅因子可用性、降低 竞争性途径的活性等。
[0095] 术语"可发酵的碳底物"是指能被微生物代谢的碳源，诸如本文所公开的那些。合 适的可发酵碳底物包括但不限于糖类，包括单糖，诸如葡萄糖、果糖、阿拉伯糖或木糖；寡 糖，诸如乳糖或蔗糖；多糖，诸如淀粉、纤维素、木质纤维素或半纤维素；单碳底物、脂肪酸； 以及上述物质的组合。
[0096] 本文所用"发酵培养基"是指水、可发酵碳底物、液化固体、发酵产物及发酵容器内 具有的所有其它物质组分的混合物，其中所述发酵产物通过在微生物存在的情况下使可发 酵碳底物反应产生发酵产物、水和二氧化碳（co2)而制得。有时，本文所用术语"发酵液体 培养基"和"发酵混合物"可与"发酵培养基"同义使用。
[0097] 本文所用术语"有氧条件"是指有氧气存在下的生长条件。
[0098] 本文所用术语"微氧条件"是指具有低水平溶解氧的生长条件。例如，所述氧气水 平可少于约1%的空气饱和度。
[0099] 本文所用术语"厌氧条件"是指不存在氧气的生长条件。
[0100] 术语"碳底物"是指能够被本文所公开的重组宿主细胞代谢的碳源。本文提供了 非限制性的碳底物的例子，包括但不限于单糖、寡糖、多糖、乙醇、乳酸盐、琥珀酸盐、甘油、 二氧化碳、乙酸盐、甲醇、葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、右旋糖、以及它们的混合物。
[0101] 术语"2碳补充物"是指具有两个碳原子的碳源，在被加入到发酵培养基时，所述 2碳补充物使破坏了参与发酵过程中形成副产物的蛋白活性的产丁醇生物的生长和/或丁 醇产生增加。2碳补充物的非限制性例子包括乙酸盐和乙醇。
[0102] 本文所用术语"产丁醇生物"是指能产生丁醇异构体的微生物。此类微生物通常 是包含经工程化的丁醇生物合成途径的重组微生物。本文所用术语"产异丁醇生物"是指 能产生异丁醇异构体的微生物。此类微生物通常是包含经工程化的异丁醇生物合成途径的 重组微生物。
[0103] 本文所用术语"PDC基因敲除"是指在编码具有PDC活性的多肽的多核苷酸或基因 中、或在具有roci、rocs或roc6活性的内源多肽、或它们的任何组合中包含破坏、缺失、突 变和/或替换，使得pdc活性消除或降低。
[0104] 本文所用术语"ALD基因敲除"是指在编码具有醛脱氢酶活性的多肽的多核苷酸或 基因中、或在具有ALD2、ALD3、ALD4、ALD5、或ALD6活性的内源多肽、或它们的任何组合中包 含破坏、缺失、突变和/或替换，使得ALD活性消除或降低。
[0105] 如本文所用，术语"改善的丁醇生产"是指在丁醇产生参数中的改善，包括但不限 于增加收率、有效速率、有效滴度或比活性或减少至少一种副产物（诸如异丁酸）收率中的 至少一项。相对于乙酸盐不存在情况下的适当对照方法来确定与与乙酸盐相关联的增加或 减少。
[0106] 如本文所用，术语"收率"指以g/g表示的产物量/碳源量。可将收率例示为用葡 萄糖作为碳源。应当理解，除非另外指明，将收率表达为理论收率的百分比。对于微生物或 代谢途径，将"理论收率"定义为每个底物总量能够产生的产物最大量，所述最大量通过化 学计量用于制备所述产物的代谢途径获得。例如，一种典型的葡萄糖至异丙醇的转化的理 论收率是0. 33g/g。同样地，从0. 297g/g葡萄糖中产生的异丙醇的收率将被表达为90%的 理论量或90%的理论收率。应当理解，虽然在本公开中将收率例示为用葡萄糖作为碳源，本 发明能够应用于其他碳源并且所述收率可能取决于使用的碳源而变化。本领域的技术人员 能够计算不同碳源的收率。
[0107] 本文所用术语"有效滴度"是指每升发酵培养基通过发酵生产的丁醇异构体的总 量。丁醇异构体的总量包括：（i)发酵培养基中的丁醇量；（ii)由有机萃取剂回收的丁醇异 构体量；以及（iii)如果利用气提，由气相回收的丁醇异构体量。
[0108] 本文所用术语"有效产率"是指每升发酵培养基通过发酵每小时产生的丁醇异构 体总量。
[0109] 本文所用术语"比收率"是指每克细胞的干细胞重每单位时间产生的丁醇异构体 的克数。
[0110] 本文所用术语"生长速率"是指微生物在培养基中生长的速率。能够通过例如测 量在600纳米处的光密度来监控所述重组微生物的生长速率。倍增时间可以从生长曲线的 对数部分计算并用作生长率的量度。
[0111] 用于本发明的多狀和多核苷酸
[0112] 如本文所用，术语"多肽"旨在涵盖单数的"多肽"以及复数的"多肽"，并指由单体 (氨基酸）通过酰胺键（也被称为肽键）线性连接组成的分子。术语"多肽"是指任何两个 或更多个氨基酸的链，并且不涉及产物的特定长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、"蛋白质"、 "氨基酸链"、或其它任何用于指由两个或更多个氨基酸组成的一条链或多条链的术语，都 包括在"多肽"的定义内，并且术语"多肽"可用于取代或与这些术语中任一项互换使用。多 肽可来源于天然生物源或由重组技术产生，但不一定是由指定的核酸序列翻译的。它可由 任何方式生成，包括通过化学合成。本发明所用的所述多肽包括全长多肽及其片段。
[0113] 以"分离的"多肽或片段形式的变体和其衍生物拟为不在其自然环境下的多肽。不 需要特别的纯化水平。例如，分离的多肽能够从它原生的或天然的环境中去除。为了本发 明的目的，在宿主细胞中重组产生的多肽和表达的蛋白质被认为是分离的，即为天然的或 重组的多肽，其已通过任何适合的技术被分离、分馏、或部分地或充分地纯化。
[0114] 适用于本发明的多肽和其它酶及其片段是由多核苷酸编码的。术语"多核苷酸"旨 在涵盖单个核酸以及多个核酸，并且指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)、病 毒来源的RNA、或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常规的磷酸二酯键或非常规的键（如酰 胺键，诸如存在于肽核酸（PNA)中的酰胺键）。术语"核酸"指任何一个或多个核酸片段，例 如DNA或RNA片段，它们存在于多核苷酸中。如本发明所述的多核苷酸还包括合成产生的 此类分子。本发明的多核苷酸可为宿主细胞天然具有的或异源的。此外，多核苷酸或核酸 可为或可包括调控元件如启动子、核糖体结合位点、或转录终止子。
[0115] 在某些实施例中，所述多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情况下，包含编码多肽的 核酸的多核苷酸通常可包括启动子和/或其他转录或翻译控制元件，它们可操作地结合一 个或多个编码区。可操作地结合是基因产物如多肽的编码区与一个或多个调控序列以将基 因产物的表达置于调控序列的影响或控制下的方式结合。两个DNA片段（例如多肽编码区 和与其相关联的启动子），如果启动子功能的诱导导致编码期望基因产物的mRNA转录并且 如果两个DNA片段间的连锁本质不干扰表达调控序列引导基因产物表达的能力或干扰DNA 模板被转录的能力，它们是"可操作地结合的"。因此，如果启动子能够影响核酸的转录，该 启动子区将与编码多肽的核酸可操作地结合。除启动子之外的其他转录控制元件例如增强 子、操纵子、阻遏蛋白和转录终止信号可与所述多核苷酸可操作地结合。本文公开了适用的 启动子和其他转录控制区。
[0116] 多核苷酸序列可意为"分离的"，其中它从天然的环境中移除出来。例如，出于本发 明的目的分离了异源多核苷酸，其编码具有酶活性（例如，将底物转化成木酮糖的能力）的 多肽或多肽片段。分离的多核苷酸的另一个例子包括异源宿主细胞拥有的重组多核苷酸或 溶液中的纯化的（部分地或基本上）多核苷酸。根据本发明分离的多核苷酸或核酸还包括 此类人工合成生产的分子。DNA聚合物形式的分离的多核苷酸片段可以由cDNA、基因组DNA 或合成DNA的一个或多个片段构成。
[0117] 术语"基因"指能够被表达为特定蛋白质的核酸片段，其任选包括编码序列前的调 节序列（5'非编码序列）和编码序列后的调节序列（3'非编码序列）。
[0118] 如本文所用，"编码区"或"0RF"是核酸的一部分，其由翻译成氨基酸的密码子组 成。虽然"终止密码子"（TAG、TGA、或TAA)不翻译成氨基酸，如果存在的话，可认为它是编 码区的一部分，但是任何侧接序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5' 和3'非翻译区等，不是编码区的一部分。"合适的调控序列"是指位于编码序列上游（5' 非编码序列）、中间、或下游（3'非编码序列）并影响相关联的编码序列的转录、RNA加工 或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调节序列可以包括启动子、翻译前导序列、内含子、多腺苷 酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。
[0119] 多种翻译控制元件时本领域的普通技术人员已知的。这些元件包括但不限于核糖 体结合位点、翻译起始和终止密码子、以及来源于病毒体系的元件（尤其是内部核糖体进 入位点或IRES)。在其它实施例中，本发明的多核苷酸是RNA，例如信使RNA (mRNA)形式的 RNA。本发明的RNA可为单链的或双链的。
[0120] 如本文所用，术语"转化"指将核酸片段转移至宿主生物体的基因组内，导致在基 因上稳定遗传。含有转化核酸片段的宿主生物被称为"重组"或"转化"生物体。
[0121] 术语"质粒"、"载体"和"盒"指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的 染色体外元件，并且常常是环状双链DNA片段的形式。此类元件可以是线性或环状的、单链 或双链DNA或RNA的、来源于任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸 序列，在其中许多核苷酸序列已被接合或组合为能够将针对所选择的基因产物的启动子片 段和DNA序列与适当的3'非翻译序列一起导入细胞中的独特构造。"转化盒"指含有外来 基因并且除了该外来基因外还含有有利于转化特定宿主细胞转化的元件的特定载体。"表 达盒"指包含外来基因并且除该外来基因以外还具有使得该基因在外来宿主中的表达增强 的元件的特定载体。
[0122] 如本文所用，"天然的"是指多核苷酸、基因或多肽的形式与天然存在的一样，带有 其自身的调节序列（如果存在调节序列）。
[0123] 术语"内源的"当用于指多核苷酸、基因、或多肽时是指在生物体基因组中处于其 天然位置的天然多核苷酸或基因，或者对于天然多肽，从基因组中的该位置被转录和翻译。
[0124] 术语"异源的"当用于指多核苷酸、基因、或多肽时是指通常不存在于宿主生物中 的多核苷酸、基因、或多肽。"异源"也包括原生的编码区、或它们的一部分，即以不同于对应 的原生基因的形式重新导入源生物体，例如，不在所述生物体基因组中的原生位置上。所述 异源多核苷酸或基因可通过例如基因转移的方式导入宿主生物体。异源基因可包括具有被 重新引入天然宿主的非天然调控区的天然编码区。"转基因"是已通过转化方法被引入基因 组内的基因。
[0125] "调控序列"是指位于编码序列的上游（5'非编码序列）、中间或下游（3'非编码 序列）的核苷酸序列，其可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。调控序 列可包括启动子、增强子、操作子、抑制子、转录终止信号、翻译前导序列、内含子、聚腺苷酸 化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。
[0126] 术语"启动子"是指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的核酸序列。一般来 讲，编码序列位于启动子序列的3'端。启动子可整个来源于天然基因、或者可由来源于天 然存在的不同启动子的不同元件组成、或者甚至包含合成的核酸片段。本领域的技术人员 知道，不同的启动子可指导基因在不同的组织或细胞类型中、在不同的发育阶段、或响应于 不同的环境或生理条件的表达。导致基因在大多数细胞类型中在大多数时候表达的启动子 通常被称为"组成型启动子"。在另一方面，"诱导型启动子"导致基因在该启动子被诱导或 被启动子特异性的信号或分子开启时被表达。此外还认识到，由于大多数情况下调控序列 的确切界限还未被彻底地界定，不同长度的DNA片段可具有相同的启动子活性。例如，应当 理解，"FBA1启动子"能够被用于指来源于FBA1基因的启动子区的片段。
[0127] 如本文所用，术语"终止子"是指位于编码序列下游的DNA序列。这包括聚腺苷酸 化识别序列以及编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其他序列。多腺苷酸化 信号通常表征为影响多腺苷酸片添加到mRNA前体的3'端。3'区可影响相关编码序列的 转录、RNA加工或稳定性或翻译。已经认识到，由于大多数情况下调控序列的确切界限还未 被彻底地界定，不同长度的DNA片段可具有相同的终止子活性。例如，应当理解，"CYC1终 止子"可用于指来源于CYC1基因终止子区的片段。
[0128] 术语"可操作地连接"是指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸 序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达（即，该 编码序列受到该启动子的转录控制）时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序 列可以按有义或反义的取向可操作地连接至调控序列。
[0129] 如本文所用，术语"表达"指源于本发明核酸片段的有义RNA(mRNA)或反义RNA的 转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。
[0130] 本文所使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且描述在下列 文献中：Sambrook等人（Sambrook、Fritsch和Maniatis,Molecular Cloning :ALaboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)(下文称为 "Maniatis"）；和 Silhavy 等人（Silhavy 等人，Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor, NY, 1984);以及 Ausubel,F. M?等人（Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology,由 Greene Publishing Assoc, and Wiley-Interscience 出版，1987) 〇
[0131] 丁醇牛物合成涂径
[0132] 利用碳水化合物的微生物将Embden-Meyerhof-Parnas (EMP)途径、 Entner-Doudoroff途径和戊糖磷酸循环用作中心代谢途径以便为生长和维持提供能量和 细胞前体。这些途径均有中间体3-磷酸甘油醛，而且最终会直接形成丙酮酸或与EMP途 径结合形成丙酮酸。随后，经由多种方法将丙酮酸转化为乙酰-辅酶A(乙酰-CoA)。乙 酰-CoA是关键中间体，例如在生成脂肪酸、氨基酸和次级代谢物的途径中它是关键中间产 物。糖转化为丙酮酸的组合反应产生能量（例如腺苷-5'-三磷酸，ATP)和还原型等价 物（例如，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH，以及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐 NADPH)。NADH和NADPH必须被循环以形成其氧化形式（分别为NAD+和NADP+)。在存在无 机电子受体（如，〇2、N〇i和50广）的情况下，所述还原型等价物可以用于增加能量池；或者 可形成还原型碳副产物。
[0133] 在例如美国专利7, 851，188和7, 993, 889中描述了可用于本发明的从可发酵碳 底物产生丁醇异构体的经工程化的生物合成途径，其以引用方式并入本文。在一个实施例 中，所述经工程化的丁醇生物合成途径是异丁醇生物合成途径，其包括下列底物至产物的 转化：
[0134] a)丙酮酸至乙酰乳酸，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；
[0135] b)乙酰乳酸至2,3_二羟基异戊酸，其可被例如乙酰羟酸异构酶催化；
[0136] c) 2, 3-二羟基异戊酸至a _酮异戊酸，其可被例如二羟基酸脱水酶催化：
[0137] d) a-酮异戊酸至异丁醛，其可被例如a-酮酸脱羧酶催化；以及
[0138] e)异丁醛至异丁醇，其可被例如醇脱氢酶催化。
[0139] 在另一个实施例中，异丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化：
[0140] a)丙酮酸至乙酰乳酸，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；
[0141] b)乙酰乳酸至2,3_二羟基异戊酸，其可被例如乙酰羟酸异构酶催化；
[0142] c) 2, 3-二羟基异戊酸至a _酮异戊酸，其可被例如二羟基酸脱水酶催化；
[0143] d) a _酮异戊酸至异丁酰-CoA，其可被例如支链酮酸脱氢酶催化；
[0144] e)异丁酰-CoA至异丁醛，其可被例如乙酰化醛脱氢酶催化；以及
[0145] f)异丁醛至异丁醇，其可被例如醇脱氢酶催化。
[0146] 用于生产可使用的1- 丁醇的经工程化的生物合成途径包括在美国专利申请公布 20080182308中描述的那些，其以引用的方式并入本文。在一个实施例中，1-丁醇生物合成 途径包括下列底物至产物的转化：
[0147] a)乙酰-CoA至乙酰乙酰-CoA，其可被例如乙酰-CoA乙酰转移酶催化；
[0148] b)乙酰乙酰-CoA至3-羟丁酸-CoA，其可被例如3-羟丁酸-CoA脱氢酶催化；
[0149] c) 3-羟丁酸-CoA至丁烯酰-CoA，其可被例如巴豆酸酶催化；
[0150] d) 丁烯酰-CoA至丁酰-CoA，其可被例如丁酰-CoA脱氢酶催化；
[0151] e) 丁酰-CoA至丁醛，其可被例如丁醛脱氢酶催化；以及
[0152] f) 丁醛至1- 丁醇，其可被例如丁醇脱氢酶催化。
[0153] 在一个实施例中，本发明从源自植物的碳源来生产丁醇，避免了与丁醇生产的标 准石油化学工艺相关的负面的环境影响。在一个实施例中，本发明提供使用包含经工程化 的丁醇生物合成途径的重组工业宿主细胞生产丁醇的方法。
[0154] 在一些实施例中，所述丁醇生物合成途径包括至少一个多核苷酸、至少两个多核 苷酸、至少三个多核苷酸、或至少四个多核苷酸，它/它们对宿主细胞是异源的。在一些实 施例中，在重组宿主细胞中丁醇生物合成途径的每种产物转化过程的底物是由异源多肽进 行催化的。在实施例中，催化乙酰乳酸至2, 3-二羟基异戊酸的底物至产物的转化的多肽和 /或催化异丁醛至异丁醇的底物至产物的转化的多肽能够利用NADH作为辅因子。
[0155] 在一些实施例中，所述产丁醇生物的经工程化的丁醇途径包括至少一个多 肽，所述多肽选自具有下列酶学委员会编号的酶：EC2. 2. 1.6、EC1. 1. 1.86、EC4. 2. 1.9、 EC4. 1. 1. 72、EC1. 1. 1. 1、EC1. 1. 1. 265、EC1. 1. 1. 2、EC1. 2. 4. 4、EC1. 3. 99. 2、EC1. 2. 1. 10、 EC2. 3. 1. 9、EC2. 3. 1. 16、EC1. 1. 1. 35、EC1. 1. 1. 157、EC1. 1. 1. 36、EC4. 2. 1. 17、EC4. 2. 1. 55、 EC1. 3. 1. 44、EC1. 3. 1. 38 和 EC1. 2. 1. 57。
[0156] 在一些实施例中，所述产丁醇生物的经工程化的丁醇途径包括至少一个选自下列 酶的多肽：乙酰乳酸合酶、乙酰羟酸异构还原酶、二羟酸脱水酶、支链a _酮酸脱羧酶、支链 醇脱氢酶、乙酰化醛脱氢酶、支链酮酸脱氢酶、丁酰-CoA脱氢酶、丁醛脱氢酶、乙酰-CoA乙 酰转移酶、3-羟丁酰-CoA脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰-CoA脱氢酶、丁醇脱氢酶和丁醛脱氢酶。
[0157] 术语"乙酰羟酸合酶"和"乙酰乳酸合酶"（缩写为"ALS"）本文互换使用，是指任 何具有乙酰乳酸合酶的生物学功能的多肽。此类多肽包括催化丙酮酸转化为乙酰乳酸和 C02的多肽。已知乙酰乳酸合酶的例子为EC编号2. 2. 1.6 (Enzyme Nomenclature 1992， Academic Press, San Diego)。这些未经修饰的酶可得自多种来源，包括但不限于枯草芽 孢杆菌（Bacillus subtilis)(GenBank No :CAB15618 和 Z99122,分另是 NCBI (National Center for Biotechnology Information)氨基酸序列、NCBI核苷酸序列）、肺炎克雷 伯氏菌（Klebsiella pneumoniae) (GenBank No :AAA25079 和 M73842)、以及乳酸乳球菌 (Lactococcus lactis)(GenBank No :AAA25161 和 L16975)。
[0158] 术语"酮醇酸还原异构酶"（"KARI"）、"乙酰羟酸异构还原酶"和"乙酰羟酸还原 异构酶"将可互换使用，是指任何具有酮醇酸还原异构酶的生物学功能的多肽。此类多肽 包括能够催化（S)_乙酰乳酸转化为2, 3-二羟基异戊酸反应的多肽。KARI酶的例子可归 类为 EC 编号 EC1. 1.1. 86 (Enzyme Nomenclature 1992，Academic Press，San Diego)，并 且得自多种微生物，包括但不限于大肠杆菌（Escherichia coli)(SEQ ID NO :1) (GenBank No:NP_418222 和 NC_000913)、啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevlslae)(GenBank No: NP_013459 和 NC_001144)、海沼甲烧球菌（Methanococcus maripaludis) (GenBank No: CAF30210 和 BX957220)，荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens)(SEQ ID NO :2)和枯 草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) (GenBank No :CAB14789 和 Z99118)。KARI 包括粪厌氧 棒状菌（Anaerostipes caccae)KARI 变体"K9G9，，（SEQ ID N0:132)、"K9D3，，（SEQ ID NO: 133)、"1(9贝？4?"(5￡〇10勵：130)、和"1(9582-511"(5￡〇10勵：126)。美国专利7,910,342， 和8, 129, 162 ;美国专利申请公布20100197519 ;和国际专利申请公布W0/201I/041415中 描述了酮醇酸还原异构酶（KARI)，其以引用方式并入本文。本文所公开的KARI的例子是 来源于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis)、霍乱弧菌（Vibrio cholera)、铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aerugmosa)PA01 和突光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens)PF5 突变体 的那些。在一些实施例中，KARI利用NADH作为辅因子。在一些实施例中，KARI利用NADPH 作为辅因子。PCT专利申请公布W02012/129555还描述了本发明中可用的KARI变体，以引 用方式并入本文。
[0159] 术语"乙酰羟酸脱水酶"和"二羟酸脱水酶"（"DHAD"）是指任何具有二羟酸脱水 酶的生物学活性的多肽。此类多肽包括催化2, 3-二羟基异戊酸转化为a-酮异戊酸的多 肽。已知二羟酸脱水酶例子是EC编号4. 2. 1.9。此类酶可得自多种微生物，包括但不限于 大肠杆菌（E. cali) (GenBank No :YP_026248 和 NC_000913)、啤酒糖酵母（S. cerevlslae) (GenBank No :NP_012550 和 NC_001142)、海沼甲烷球菌（M. maripaludis) (GenBank No : CAF29874和BX957219)、和枯草芽孢杆菌（B. subtilis) (GenBank No :CAB14105和Z99115)， 乳酸乳球菌（Lactococcus lactis)(SEQ ID NO :3)，变异链球菌（Streptococcus mutans) (SEQ ID N0:4)和粗糙链孢霉（N. crassa)。美国专利申请公布20100081154A1和美国专 利7, 993, 889(其以引用方式并入本文）描述了二羟酸脱水酶（DHAD)，其包括来自变异链 球菌（Streptococcus mutans)的 DHAD(SEQ ID N0:131)。合适的 DHAD 也包括变异链球菌 (Streptococcus mutans)的变体诸如 "L2V4，'（SEQ ID N0 :134)。
[0160] 术语"支链a -酮酸脱羧酶"或" a -酮酸脱羧酶"或" a -酮异戊酸脱羧酶"或 "2-酮异戊酸脱羧酶"("1(1￥0"）是指任何具有2-酮异戊酸脱羧酶的生物学功能的多肽。此 类多肽包括催化a-酮异戊酸转化为异丁醛和C02的多肽。已知支链a-酮酸脱羧酶的例子 为EC编号4. 1. 1. 72,并且得自许多来源，包括但不限于乳酸乳球菌（Lactococcus lactls) (GenBank No :六六549166、六丫548760、〇六634226、和六了746364)、鼠伤寒沙门氏菌（5&1111〇11611& typhimurium) (GenBank No :NP_461346 和 NC_003197)、丙酮丁 醇梭菌（Clostridium acetobutylicum) (GenBank No :NP_149189 和 NC_001988)、溶酪巨球菌（Macrococcus 。&86〇1}^;[(3118)(3￡(>)10腸：5)、和格氏李斯特菌（1^8七61'13 8四7；0(3￡(>)10腸：6)。
[0161] 术语"支链醇脱氢酶"或"醇脱氢酶"（"ADH"）是指任何具有醇脱氢酶的生物学 功能的多肽。此类多肽包括催化异丁醛转化为异丁醇的多肽。支链醇脱氢酶的例子是已 知EC编号1. 1. 1. 265的酶，但是所述酶也可被归类为其它醇脱氢酶（具体地讲，EC1. 1. 1. 1 或1.1. 1.2)。醇脱氢酶可使用NADPH或NADH作为辅因子。这些酶可得自多种来源，包括 但不限于啤酒糖酵母（S. cerevlslae) (GenBank No :NP_010656、NC_001136、NP_014051 和 NC_001145)、大肠杆菌（E. coli.) (GenBank No :NP_417484 和 NC_000913)、丙酮丁醇梭菌 (C. acetobutylicum) (GenBank No :NP 349892、NC_003030、NP_349891 和 NC_003030)、印 度拜叶林克氏菌（13.;[11(1;[03)(3￡(>)10勵：7)、和木糖氧化无色杆菌（4.17108(?1(^118)(3￡( >) ID N0:8)。美国专利申请公布20090269823A1(其以引用方式并入本文）描述了一种来 源于木糖氧化无色杆菌（Achromobacter xylosoxidans)的醇脱氢酶（ADH)SadB。醇脱氢 酶也包括马肝ADH和印度拜叶林克氏菌（Beijerinkia indica)ADH(如美国专利申请公布 20110269199所述，其以引用方式并入本文）。
[0162] 术语"丁醇脱氢酶"是指任何具有丁醇脱氢酶的生物学功能的多肽。此类多肽 包括催化异丁醛转化为异丁醇或2- 丁酮转化为2- 丁醇的多肽。丁醇脱氢酶是乙醇脱 氢酶大家族中的一个子集。丁醇脱氢酶可以是NADH或NADPH依赖型。所述NADH依赖 型酶已知为EC1. 1. 1. 1并且可得自例如赤红球菌（Rhodococcus ruber) (GenBank No : CAD36475和AJ491307)。NADPH依赖型酶已知为EC1. 1. 1. 2并且可得自例如强烈火球菌 (Pyrococcus furiosus) (GenBank No :AAC25556 和 AF013169)。另外，丁醇脱氧酶得自大肠 杆菌（Escherichia coli) (GenBank No :NP_417484 和 NC_000913)，并且环己醇脱氧酶得自 不动杆菌属（Acinetobacter sp.)(GenBank N〇:AAG10026 和 AF282240)。术语"丁醇脱氢 酶"也指催化丁醛转化成1-丁醇的酶，其使用NADH或NADPH作为辅因子。丁醇脱氢酶得自 例如丙酮丁醇梭菌（C. acetobutylicum) (GenBank No :NP_149325和NC_001988(注：这个酶 同时具有醛和醇脱氢酶活性）、NP_349891、NC_003030、NP_349892和NC_003030)和大肠杆 菌（E.coli)(GenBank No :NP_417484 和 NC_000913)。
[0163] 术语"支链酮酸脱氢酶"是指任何具有支链酮酸脱氢酶的生物学功能的多肽。此类 多肽包括催化a-酮异戊酸转化为异丁酰-CoA (异丁酰辅酶A)的多肽，通常使用NAD+(烟 酰胺腺嘌呤二核苷酸）作为电子受体。支链酮酸脱氢酶的例子已知其编号为EC1. 2. 4. 4。 此类支链酮酸脱氢酶由四个亚基构成，并且来自所有亚基的序列可得自多种微生物，包括 但不限于枯草芽孢杆菌（B. subtilis) (GenBank No :CAB14336、Z99116、CAB14335、Z99116、 〇八814334、299116、04814337、和299116)和恶臭假单胞菌（？8611(1〇111〇1^8口11衍(^)(66118 &1^ No :AAA65614、M57613、AAA65615、M57613、AAA65617、M57613、AAA65618 和 M57613)。
[0164] 术语"乙酰化醛脱氢酶"是指任何具有乙酰化醛脱氢酶的生物学功能的多肽。此 类多肽包括催化异丁酰-CoA转化为异丁醛的多肽，其通常使用NADH或NADPH作为电子供 体。已知乙酰化醛脱氢酶的例子为EC编号1.2. 1. 10和1.2. 1.57。此类酶得自多种来源，包 括但不限于拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii) (GenBank No :AAD31841 和 AF157306)、 丙酮丁醇梭菌（C. acetobutylicum) (GenBank No :NP_149325、NC_001988、NP_149199 和 NC_001988)、恶臭假单胞菌（P. putida) (GenBank No :AAA89106 和 U13232)、和嗜热栖热菌 (Thermus thermophilus)(GenBank No :YP_145486 和 NC_006461)。
[0165] 术语"乙酰-CoA乙酰转移酶"是指任何具有乙酰-CoA乙酰转移酶的生物学功能 的多肽。此类多肽包括催化两分子乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA和辅酶A(C〇A)的多肽。 乙酰-CoA乙酰转移酶的例子是具有对短链酰基-CoA和乙酰-CoA的底物偏好（在正向上反 应）的乙酰-CoA乙酰转移酶，并且该酶归类为E. C. 2. 3. 1. 9[Enzyme Nomenclature 1992， Academic Press，San Diego];但是具有更广泛底物范围的酶（E. C. 2. 3. 1. 16)也将具有功 能。乙酰-CoA乙酰转移酶得自多种来源，例如，大肠杆菌（Escherichia coli) (GenBank No : NP_416728 和 NC_000913)、丙酮丁醇梭菌（Clostrudium acetobutylicum)(GenBank No: NP_349476. 1、NC_003030、NP_149242 和 NC_001988)、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) (GenBank No :NP_390297 和 NC_000964)、和啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae) (GenBank No :NP_015297 和 NC_001148)。
[0166] 术语"3-羟丁酰-CoA脱氢酶"是指任何具有3-羟丁酰-CoA脱氢酶的生物学功能 的多肽。此类多肽包括催化乙酰乙酰-CoA转化为3-羟丁酰-CoA的多肽。3-羟丁酰-CoA 脱氢酶的例子可为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH)-依赖型的、具有对（S)-3-羟 丁酰-CoA或（R) -3-羟丁酰-CoA的底物偏好的酶。例子可分别归类为E. C. 1. 1. 1. 35 和E. C. 1. 1. 1. 30。另外，3-羟丁酰-CoA脱氢酶可为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADPH)-依赖型的、具有对（S)-3-羟丁酰-CoA或（R)-3-羟丁酰-CoA的底物偏好的酶， 并且其可分别归类为E.C. 1. 1. 1. 157和E.C. 1. 1. 1.36。3-羟丁酰-CoA脱氢酶得自多种来 源，例如，丙酮丁醇梭菌（C.acetobutylicum) (GenBank No :NP_349314 和 NC_003030)、枯草 芽抱杆菌（B. subtilis) (GenBank No :AAB09614和U29084)、富养罗尔斯通氏菌（Ralstonia eutropha)(GenBank No :YP_294481 和 NC_007347)、和真养产喊杆菌（Alcaligenes eutrophus)(GenBank No :AAA21973 和 J04987)。
[0167] 术语"巴豆酸酶"是指任何具有巴豆酸酶的生物学功能的多肽。此类多肽包括催化 3_羟丁酰-CoA转化为巴豆酰-CoA和H20的多肽。巴豆酸酶的例子可具有对（S) -3-羟丁 酰-CoA或（R)-3-羟丁酰-CoA的底物偏好并可分别归类为E. C. 4. 2. 1. 17和E. C. 4. 2. 1. 55。 巴豆酸酶得自多种来源，例如，大肠杆菌（E. coli) (GenBank No :NP_415911和NC_000913)、 丙酮丁醇梭菌（C.acetobutylicum) (GenBank No :NP_349318 和 NC_003030)、枯草芽抱杆菌 (B. subtilis) (GenBank No :CAB13705 和 Z99113)、和豚鼠气单胞菌（Aeromonas caviae) (GenBank No :BAA21816 和 D88825)。
[0168] 术语"丁酰-CoA脱氢酶"是指任何具有丁酰-CoA脱氢酶的生物学功能的多肽。 此类多肽包括催化巴豆酰-CoA转化为丁酰-CoA的多肽。丁酰-CoA脱氢酶的例子可为 NADH-依赖型的、NADPH-依赖型的、或黄素-依赖型的，并且可分别归类为E. C. 1. 3. 1. 44、 E.C. 1.3. 1.38、和E.C. 1.3.99. 2。丁酰-CoA脱氢酶得自多种来源，例如丙酮丁醇梭菌 (C.acetobutylicum) (GenBank No :NP_347102 和 NC_003030)、小眼虫（Euglena gracilis) (GenBank No :Q5EU90 和 AY741582)、山丘链霉菌（Streptomyces collinus) (GenBank No :AAA92890 和 U37135)、和天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor) (GenBank No : CAA22721 和 AL939127)。
[0169] 术语"丁醛脱氢酶"是指任何具有丁醛脱氢酶的生物学功能的多肽。此类多肽 包括催化丁酰-CoA转化为丁醛的多肽，其使用NADH或NADPH作为辅因子。丁醛脱氢酶 具有对NADH的偏好性，该酶已知为E. C. 1. 2. 1. 57并且得自例如拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii) (GenBank No :AAD31841 和AF157306)和丙酮丁醇梭菌（C.acetobutylicum) (GenBankNo :NP 149325 和 NC 001988)。
[0170] 宿丰细朐
[0171] 用于丁醇产生的宿主细胞可选自细菌和酵母。在实施例中，合适的宿主细胞包括 任何可用于基因改性和重组基因表达的细菌或酵母。选择合适微生物宿主的标准包括如 下：对所产生的丁醇异构体的固有耐受性、对葡萄糖的高利用率、用于基因操纵的遗传工具 的可用性、以及产生稳定的染色体变异的能力。
[0172] 在基因方面修饰宿主的能力对任何重组微生物的产生来说十分关键。基因转移技 术的模式可以是电穿孔、接合、转导或自然转化。可利用多种宿主接合性质粒和药物抗性标 记。基于可在宿主中产生作用的抗生素抗性标记的性质，针对该宿主生物体来定制克隆载 体。
[0173] 还必须操纵微生物宿主以便通过删除多种基因而使竞争碳流的途径失活。这就需 要存在转座子或染色体整合载体用以引导失活。此外，生产宿主应能受到化学诱变以便得 到改善的丁醇固有耐受性的突变体。
[0174] 所述用于产生丁醇异构体的微生物宿主细胞优选地耐受所产生的丁醇异构体，使 得丁醇异构体的收率不会受到丁醇异构体毒性的限制。在一个实施例中，所述用于异丁醇 产生的宿主耐受异丁醇。对异丁醇耐受的合适的宿主菌株可通过美国专利7, 993, 889 (以 引用方式并入本文）所述的基于菌株固有耐受性的筛选方法进行鉴定。
[0175] 所述用于异丁醇产生的微生物宿主也可高速利用碳水化合物，包括单糖、寡糖和 多糖。大多数微生物都能够利用碳水化合物。然而，某些环境微生物不能高效利用碳水化 合物，因此它们将不是合适的宿主。
[0176] 基于上述标准，用于生产丁醇的适当的微生物宿主包括但不限于梭菌属 (Clostridium)、发酵单胞菌属（Zymomonas)、埃希氏菌属（Escherichia)、沙门氏菌 属（Salmonella)、红球菌属（Rhodococcus)、假单胞菌属（Pseudomonas)、芽抱杆菌 属（Bacillus)、乳杆菌属（Lactobacillus)、肠球菌属（Enterococcus)、产喊杆菌属 (Alcaligenes)、克雷伯氏菌属（Klebsiella)、类芽孢杆菌属（Paenibacillus)、节杆 菌属（Arthrobacter)、棒状杆菌属（Corynebacterium)、短杆菌属（Brevibacterium)、 毕赤酵母属（Pichia)、假丝酵母属（Candida)、汉逊酵母属（Hansenula)、裂殖酵母属 (Schizosaccharomyces)、伊萨酵母属（Issatchenkia)、克鲁维酵母属（Kluyveromyces)、 耶氏酵母属（Yarrowia)、毕赤酵母属（Pichia)、假丝酵母属（Candida)、汉逊酵母 属（Hansenula)、和糖酵母属（Saccharomyces)的成员。优选的宿主包括：大肠杆菌 (Escherichia coli)、真养产喊杆菌（Alcaligenes eutrophus)、地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis)、浸麻类芽抱杆菌（Paenibacillus macerans)、红平红球菌（Rhodococcus erythropolis)、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida)、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)、屎肠球菌（^Enterococcus faeclum)、_ 鸡肠球菌（^Enterococcus gal 1 inarium)、奠肠球菌（Enterococcus faecalis)、枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)、 粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis)、 耐热克鲁维酵母（Kluyveromyces thermotolerans)、马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus)、光滑假丝酵母（Candida glabrata)、白假丝酵母（Candida albicans)、树干毕 赤酵母（Pichia stipitis)、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica)、大肠杆菌（E. coli)、植 物乳杆菌（L. plantarum)和啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae)。在一些实施例中， 所述宿主细胞是啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae)。啤酒糖酵母（S. cerevlslae) 为本领域所已知并可购自多种来源，包括但不限于美国典型培养物保藏中心（ATCC) (Rockville, MD) ；Centraalbureau voor Schimmelcultures(CBS)Fungal Biodiversity Centre ；LeSaffre ；Gert Strand AB ；Ferm Solutions ；North American Bioproducts ； Martrex和 Lallemand。啤酒糖酵母（S. cerevisiae)包括但不限于BY4741、CEN. PK 113-7D、 Ethanol Red?酵母、Ferm Pro? 酵母、Bio-Ferm.XR 酵母、Gert Strand Prestige Batch Turbo alcohol酵母、Gert Strand Pot Distillers酵母、Gert Strand Distillers Turbo 酵母、FerMax? Green 酵母、FerMax? Gold 酵母、Thermosacc #酵母、BG-1、PE-2、CAT-1、 CBS7959、CBS7960 和 CBS7961。
[0177] 用于异丁醇产牛的宿丰细朐
[0178] 可以采用本领域熟知的技术来构建含有必需基因的重组微生物，所述必需基因编 码用于将可发酵碳底物转化为丁醇异构体的酶途径。如例如美国专利7, 993, 889所述，在 本发明中，编码本发明其中一种丁醇生物合成途径的酶的基因可从多个来源分离获得，所 述酶例如乙酰乳酸合酶、乙酰羟酸异构还原酶、二羟酸脱水酶、支链a-酮酸脱羧酶、和支 链醇脱氢酶。
[0179] 一旦鉴定和分离了相关的途径基因，就可将所述丁醇生物合成途径的相关酶导 入宿主细胞或操作所述丁醇生物合成途径的相关酶以生成产丁醇生物，如例如美国专利 7, 993, 889所述。所生成的产丁醇生物包含经工程化的丁醇生物合成途径。在一些实施例 中，所述产丁醇生物是产异丁醇生物，其包含经工程化的异丁醇生物合成途径。
[0180] 在一些实施例中，所述产丁醇生物是酵母。在一些实施例中，所述产丁醇生物是细 菌。在一些实施例中，所述产丁醇生物是啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae)。
[0181] 在一些实施例中，经工程化的产丁醇生物包含一个或多个多肽，所述多肽选自具 有下列酶学委员会编号的酶：EC2. 2. 1. 6、EC1. 1. 1. 86、EC4. 2. 1. 9、EC4. 1. 1. 72、EC1. 1. 1. 1、 EC1. 1. 1. 265、EC1. 1. 1. 2、EC1. 2. 4. 4、EC1. 3. 99. 2、EC1. 2. 1. 10、EC2. 3. 1. 9、EC2. 3. 1. 16、 EC1. 1. 1. 35、EC1. 1. 1. 157、EC1. 1. 1. 36、EC4. 2. 1. 17、EC4. 2. 1. 55、EC1. 3. 1. 44、EC1. 3. 1. 38 和 EC1. 2. 1. 57。
[0182] 在一些实施例中，经工程化的产异丁醇生物包含一个或多个多肽，所述多肽选自 乙酰乳酸合酶、乙酰羟酸异构还原酶、二羟酸脱水酶、支链a _酮酸脱羧酶、支链醇脱氢酶、 乙酰化醛脱氢酶、支链酮酸脱氢酶、丁酰-CoA脱氢酶、丁醛脱氢酶、乙酰-CoA乙酰转移酶、 3_羟丁酰-CoA脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰-CoA脱氢酶、丁醇脱氢酶、和丁醛脱氢酶。
[0183] 在一些实施例中，通常定位于线粒体的丁醇生物合成途径的酶不定位于线粒体。 在一些实施例中，经工程化的丁醇生物合成途径的酶定位于细胞溶胶。在一些实施例中，通 过去除线粒体靶向序列将所述生物合成途径的酶定位于细胞溶胶。在一些实施例中，如例 如美国专利7, 993, 889所述，通过生成新的起始密码子消除线粒体靶向，其以引用方式并 入本文。在一些实施例中，所述定位于细胞溶胶的生物合成途径的酶是DHAD。在一些实施 例中，所述定位于细胞溶胶的来自生物合成途径的酶是KARI。
[0184] 在一些实施例中，经工程化的丁醇生物合成途径的酶可使用NADH或NADPH作为辅 因子，其中NADH或NADPH起到电子供体的作用。在一些实施例中，所述丁醇生物合成途径 的一个或多个酶使用NADH作为电子供体。在一些实施例中，所述丁醇生物合成途径的一个 或多个酶使用NADPH作为电子供体。
[0185] 产丁醇牛物的其他修饰
[0186] 本文所提供的产丁醇生物还可包含一种或多种其他修饰。此类修饰，例如，可包括 破坏基因的活性，所述基因参与通过经工程化的丁醇生物合成途径在丁醇异构体的发酵生 产过程中产生副产物。破坏参与在发酵生产丁醇异构体的过程中产生副产物的基因的活性 降低了来自碳流竞争性途径的收率损耗并且增加了丁醇产生。在一些实施例中，此类修饰 包括破坏丙酮酸脱羧酶、醛脱氢酶或两者的活性。
[0187] 术语"丙酮酸脱羧酶"是指任何具有丙酮酸脱羧酶的生物学功能的多肽。此类 多肽包括催化丙酮酸脱羧转化为乙醛和二氧化碳的多肽。丙酮酸脱氢酶已知为EC编号 4. 1. 1. 1。能通过本领域所熟知的和PCT专利申请公布W02012/129555中所公开的方法测 定此类多肽。这些酶存在于多种酵母中，包括啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae) (GenBank No :CAA97575、CAA97705 和 CAA97091)。在美国专利申请公布 2009035363 中提供 了 roc的其他例子，其以引用方式并入本文。
[0188] 在一些实施例中，本文所公开的产丁醇生物在编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽 的内源多核苷酸和/或基因中、或具有丙酮酸脱羧酶活性的内源多肽中能包含一个修饰或 破坏。在一些实施例中，本文所公开的产丁醇生物在编码具有PDC活性的多肽的内源多核 苷酸或基因中、或具有PDC活性的内源多肽中能包含一个缺失、突变和/或替换。此类修 饰、破坏、缺失、突变、和/或替换能够导致PDC活性被降低或消除，导致例如，PDC基因敲除 (PDC-K0)表型。
[0189] 酵母中的内源丙酮酸脱羧酶将丙酮酸转化成乙醛，然后将其转化成乙醇或经由 乙酸转化成乙酰-CoA。酵母可具有一个或多个编码丙酮酸脱羧酶的基因。例如在光滑 假丝酵母（Candida glabrata)和粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)和乳酸 克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis)中有一个编码丙酮酸脱羧酶的基因，而在糖酵母属 (Saccharomyces)中有三个丙酮酸脱羧酶的同功酶，它们由H)C1、PCD5和/或H)C6基因编 码。在一些实施例中，在酵母细胞中存在的至少一个PDC基因是灭活的。如果使用的酵母 细胞具有多于一种的表达（活性）PDC基因，那么可修饰或灭活每个活性PDC基因，从而制 备pdc-细胞。例如，在啤酒糖酵母（S. cerevisiae)中可修饰或灭活H)C1、PDC5和H)C6基 因。如果在发酵条件下PDC基因没有活性不能用，那么此类基因就不需要修饰或灭活。在 一些实施例中，缺失或下调的丙酮酸脱羧酶选自：PDCl、roC5、PDC6、以及它们的组合。美国 专利申请公布20090305363和PCT专利申请公布W02012/129555 (以引用方式并入本文） 还描述了在内源丙酮酸脱羧酶中的修饰，并且以引用方式并入本文。美国专利申请公布 20090305363(以引用的方式并入本文）公开了通过工程化酵母以增加丙酮酸转化为乙酰 乳酸，所述工程化酵母表达定位于胞质溶胶的乙酰乳酸合酶并且基本消除了丙酮酸脱羧酶 的活性。能使用各种方法鉴定具有降低的酶活性的酵母。例如，能使用通用方法鉴定具有 减小的丙酮酸脱羧酶活性的酵母，所述方法包括，例如，通过气相色谱法测定乙醇形成。
[0190] 其他靶基因，诸如编码丙酮酸脱羧酶蛋白质的那些，其具有与丙酮酸脱羧酶至少 约70-75%、至少约75-85%、至少约80-85%、至少约85-90%、至少约90-95%、或至少约 96%、至少约97%、至少约98%、或至少约99%的序列同一性，所述基因可在文献中或在技 术人员所熟知生物信息学数据库中鉴定。在美国专利申请公布20090305363和PCT专利申 请公布W02012/129555中详细描述了破坏丙酮酸脱羧酶活性的方法以及鉴定具有改性或 缺失丙酮酸脱羧酶的产丁醇生物的方法。
[0191] 在一些实施例中，产丁醇生物包含降低甘油-3-磷酸脱氢酶的活性的修饰，和/ 或破坏至少一个编码具有PDC活性的多肽基因，或破坏至少一个编码控制PDC基因表达的 调控元件的基因，如美国专利申请公布20090305363和PCT专利申请公布W02012/129555 中所述，所述修饰将提供增加的通过Entner-Doudoroff途径的碳通量，或降低当量余量， 如美国专利申请公布20100120105(其以引用方式并入本文）所述。在美国专利申请公布 20110124060中描述了带有灭活的内源PDC基因和经工程化的生物合成途径的酵母细胞， 当葡萄糖阻遏减少时改善了生长和产物收率，其以引用方式并入本文。
[0192] 术语"醛脱氢酶"是指任何具有醛脱氢酶的生物学功能的多肽。此类多肽包括催 化醒氧化（脱氢）的多肽（Wang 等人，J. Bacteriol. 18〇 :822_3〇, I"8;Navarro_Avino 等 人，Yeast 15 :829-42,1999;和 Saint-Prix 等人，Microbiology 150:2209-20, 2004)。此 类多肽包括催化异丁醛转化至异丁酸的多肽。此类多肽也包括对应于EC编号1. 2. 1. 3、 EC1. 2. 1. 4或1. 2. 1. 5的多肽。能通过本领域所熟知的和PCT专利申请公布W02012/129555 中所公开的方法测定此类多肽。
[0193] 在一些实施例中，产丁醇生物能在编码具有醛脱氢酶（ALD)和/或醛氧化酶活性 的多肽的内源多核苷酸或基因中包含缺失、突变和/或替换，或在具有醛脱氢酶和/或醛 氧化酶活性的内源多肽中包含缺失、突变和/或替换。在一些实施例中，本发明的重组宿 主细胞可为啤酒糖酵母（S. cerevisiae)，并且具有醛脱氢酶活性的多肽可为ALD2、ALD3、 ALD4、ALD5、ALD6、或它们的组合。在一些实施例中，重组宿主细胞可为乳酸克鲁维酵母 (Kluyveromyces lactis)，并且具有醛脱氢酶活性的多肽可为 KLLA0F00440、KLLA0E23057、 KLLA0D10021、KLLA0D09999G、或它们的组合。在其它实施例中，重组宿主细胞可为树干毕 赤酵母（Pichia stipitis)，并且具有醛脱氢酶活性的多肽可为ALD2、ALD3、ALD4、ALD5、 ALD7、或它们的组合。在其它实施例中，重组宿主细胞可为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)，并且具有醛脱氢酶活性的多肽可为AldH。在其它实施例中，重组宿主细胞可为 大肠杆菌（E. coli)，并且具有醛脱氢酶活性的多肽可为aldA、aldB、aldH、或它们的组合。
[0194] 在一些实施例中，所述具有醒脱氢酶活性的多肽是啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae)中的ALD6或其同源物。此类修饰、破坏、缺失、突变、和/或替换能够导致 ALD活性被降低或消除，导致例如，ALD6基因敲除（ALD6-K0)表型。在PCT专利申请公布 W02012/129555中提供了更详细的醛脱氢酶多核苷酸、基因和多核苷酸的例子，其能在重组 宿主细胞中作为改性或灭活的靶标。
[0195] 能使用醛脱氢酶基因的内部和外部引物进行PCR筛选，或使用为醛脱氢酶基因序 列设计的探针通过Southern印记法来验证特定醛脱氢酶的破坏。作为另外一种选择，能利 用气相色谱-质谱或液相色谱来筛选暴露于异丁醛的菌株用于降低异丁酸的形成。例如， 筛选降低了异丁酸形成的菌株的方法包括：a)提供菌株，其在编码具有醛脱氢酶活性的多 肽的多核苷酸中和/或在编码具有醛氧化酶活性的多肽的多核苷酸中包含修饰；b)使所述 细胞与异丁醛接触；以及c)测定异丁酸形成；其中在与不具有所述修饰的对照菌株相比， 异丁酸的形成降低了。在一些实施例中，使用气相色谱-质谱进行测定。在例如PCT专利 申请公布W02012/129555中详细描述了针对醛脱氢酶的多核苷酸、基因或多肽的缺失、突 变和/或替换的方法以及鉴定破坏醛脱氢酶活性的方法。
[0196] 其他靶基因，诸如编码醛脱氢酶蛋白质的那些，其具有与醛脱氢酶至少约 70-75 %、至少约75-85 %、至少约80-85 %、至少约85-90 %、至少约90-95 %、或至少约 96%、至少约97%、至少约98%、或至少约99%的序列同一性，所述基因可在文献中或在技 术人员所熟知生物信息学数据库中鉴定。
[0197] 在一些实施例中，本文所述的产丁醇生物能包含降低或消除的醛脱氢酶和/或醛 氧化酶活性，如PCT专利申请公布W02012/129555中所述。在一些实施例中，具有降低或消 除的醛脱氢酶活性的产丁醇生物能通过经工程化的生物合成途径产生丁醇异构体，其收率 或数量比不包含降低或消除的醛脱氢酶活性的产丁醇生物产生的相同异构体的收率或数 量更高。
[0198] 在一些实施例中，如本文所述产丁醇生物可在编码多肽的内源多核苷酸或基因 中包含缺失、突变和/或替换，所述多肽参与在发酵生产丁醇异构体过程中产生副产物的 途径。在一些实施例中，产丁醇生物可在内源多肽中包含一处或多处缺失、突变和/或替 换，所述内源多肽参与在发酵生产丁醇异构体过程中产生副产物的途径。在一些实施例 中，这些修饰存在于编码FRA2 (铁阻遏蛋白）、CCC1 (推测的液泡Fe2+/Mn2+转运蛋白）或 GPD2 (甘油-2-磷酸脱氢酶）的基因或多核苷酸中或具有FRA2、CCC1或GPD2活性的多肽 及其组合中。
[0199] 在其它实施例中，修饰包括整合至少一个编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化利 用丙酮酸的生物合成途径中一个步骤。其他修改包括编码具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽 的内源多核苷酸中的至少一个缺失、突变、和/或替换。在实施例中，所述具有乙酰乳酸还 原酶活性的多肽为啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisae)的YMR226C或其同源物。
[0200] 在实施例中，宿主细胞可包含编码具有磷酸解酮酶活性的多肽的异源多核苷酸和 /或编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源多核苷酸，诸如，例如由SEQ ID NO :262和 263编码的那些，以及如PCT专利申请公布W0 2011/159853中所述的。如本文所述，这样改 性的roc-K〇细胞相比于roc-K〇细胞表现出降低或消除对于用于它们生长的外源二碳底物 补充物的需求。因此，如例子中所表明的，本文所提供的方法提供了如下优势：经工程化的 重组宿主细胞降低或消除丙酮酸脱羧酶（roc)活性并且包含降低或消除对于用于它们生 长的外源二碳底物补充物的需求。
[0201] 发酵培养某
[0202] 本发明的发酵培养基必须含有合适的可发酵碳底物。合适的可发酵碳底物包括 但不限于单糖，诸如葡萄糖、果糖、木糖或阿拉伯糖；寡糖诸如乳糖、麦芽糖、半乳糖或蔗糖； 多糖诸如淀粉或纤维素；或它们的组合。合适的可发酵碳底物可包括来自可再生原料的未 纯化的混合物，诸如奶酪乳清渗透物、玉米浆、糖用甜菜糖蜜和大麦麦芽。另外，可发酵碳底 物也可以是已被证明可以被代谢转化为关键生化中间产物的一碳底物，诸如二氧化碳或甲 醇。除了一碳和二碳可发酵底物之外，甲基营养生物体也已知可以利用多种其它含碳化合 物，例如甲胺、葡糖胺和用于代谢活动的多种氨基酸。例如，甲基营养酵母已知可利用来自 甲胺的碳来形成海藻糖或甘油（Bellion等人，Microb. Growth Cl Compd.，[Int.Symp.]， 第 7 版，415-32。编辑：Murrell，J. Collin ;Kelly，Don P. Publisher :Intercept，Andover， UK (1993))。类似地，假丝酵母属（Candida)的各种菌种将会代谢丙氨酸或油酸（Suiter等 人，Arch. Microbiol.，153 :485-489 (1990))。因此，预期本发明中利用的碳的来源可涵盖广 阔范围的包含碳的底物，并将仅受生物体的选择的限制。其他碳底物可包括乙醇、乳酸盐、 琥珀酸盐或甘油。
[0203] 尽管预期以上提及的所有可发酵碳底物及它们的混合物均适用于本发明，优选的 可发酵碳底物是葡萄糖、果糖和蔗糖，或者是它们与5碳糖诸如木糖和阿拉伯糖的混合物。 蔗糖可来源于可再生的糖源如甘蔗、糖用甜菜、木薯、甜高粱、或它们的混合物。葡萄糖和右 旋糖可通过淀粉基原料包括谷物如玉米、小麦、黑麦、大麦、燕麦、以及它们的混合物的糖化 来源于可再生的谷物来源。此外，可发酵的糖类可通过预处理和糖化过程来源于可再生的 纤维素的或木质纤维素的生物质，如例如美国专利7, 932, 063中所述，该专利以引用方式 并入本文。生物质包括包含纤维素、并且任选地还包含半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖和/ 或单糖的材料。生物质也可包含其他组分诸如蛋白质和/或脂质。生物质可来源于单一来 源，或者生物质可包括来源于一种以上来源的混合物；例如，生物质可包括玉米芯和玉米秸 杆的混合物，或草和叶片的混合物。生物质包括但不限于生物能作物、农业残余物、市政固 体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸业的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的例子包括 但不限于：玉米粒、玉米芯、作物残余物如玉米壳、玉米秸杆、玉米纤维、草、小麦、小麦秸杆、 大麦、大麦秸杆、干草、稻杆、柳枝稷、废纸、蔗渣、高粱、大豆、从谷物的研磨中获得组分、树、 枝、根、叶、木屑、锯末、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花和动物粪肥、以及它们的混合物。
[0204] 在一些实施例中，所述可发酵的碳底物是来源于玉米的葡萄糖。在一些实施例中， 所述可发酵的碳底物是来源于小麦的葡萄糖。在一些实施例中，所述可发酵的碳底物是来 源于甘蔗的蔗糖。在一些实施例中，所述可发酵的碳底物是木糖。
[0205] 除了合适的碳源外，发酵培养基还必须含有本领域的技术人员已知的适于培养物 生长并促进生产异丁醇所必需的酶途径的矿物质、盐、辅因子、缓冲剂及其他组分。
[0206] 在一些实施例中，本发明中的所述发酵培养基含有乙酸盐作为外源2碳源，其以 足以满足所述重组宿主细胞的生长的量被加入到所述发酵培养基作为补充物。在一些实施 例中，所述发酵培养基中加入了足以改善丁醇产生的量的乙酸盐。在一些实施例中，加入到 所述发酵培养基的乙酸盐在约〇. ImM至约50mM的范围内。在一些实施例中，被加入到所 述发酵培养基的乙酸盐为 〇? lmM、〇. 2mM、0. 4mM、0. 5mM、0. 6mM、0. 7mM、0. 8mM、0. 9mM、l. OmM、 1. ImM、1. 2mM、1. 3mM、1. 4mM、1. 5mM、1. 6mM、1. 7mM、1. 8mM、1. 9mM、2. 0mM、5mM、10mM、15mM、 20禮、251111、3〇1111、351111、4〇1111、451111或5〇1111。在一些实施例中，在所述发酵培养基中糖类与2 碳补充物的比率为95 :5、90 :10、85 :15、80 :20、75 :25或70 :30。在一些实施例中，在生长 期、生产期或两者加入乙酸盐。
[0207] 在一些实施例中，所述发酵培养基还可包含丁醇。在一些实施例中，丁醇在约 0. OlmM 至约 500mM 的范围内。在一些实施例中，丁醇为 0. 01mM、1.0mM、10mM、15mM、20mM、 25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM、 100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM、200mM、210mM、 220mM、230mM、240mM、250mM、260mM、270mM、280mM、290mM、300mM、310mM、320mM、330mM、 340mM、350mM、360mM、370mM、380mM、390mM、400mM、410mM、420mM、430mM、440mM、450mM、 460禮、470禮、4801111、4901111或5001111。在一些实施例中，存在于所述发酵培养基中的丁醇为 丁醇理论收率的约0.01%至约100%。在一些实施例中，存在于所述发酵培养基中的丁醇 为丁醇理论收率的 〇? 〇1%、〇. 5%、1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或 100%。
[0208] 在一些实施例中，改善的丁醇生产表现为增加收率、有效速率、有效滴度，或比生 产率。在实施例中，收率、有效速率、有效滴度，或比生产率的至少一个增加了至少约3%、至 少约5%、或至少约10%。
[0209] 在一些实施例中，改善的丁醇生产表现为副产物收率的下降。在实施例中，副产物 收率下降了至少约3%、至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、 或至少约50、或至少约70%。在实施例中，所述副产物为异丁酸。
[0210] 发酵备件
[0211] 通常，细胞在约20°C至约40°C范围的温度在适当的培养基中生长。在一些实施 例中，细胞生长的温度为 20°C、22°C、25°C、27°C、30°C、32°C、35°C、37°C 或 40°C。本发明 中适合的生长培养基包括常规的商品化制备的培养基，例如Luria Bertani(LB)液体培 养基、沙氏葡糖（SD)液体培养基、酵母培养基（YM)液体培养基、或包括酵母氮源、硫酸铵 和右旋糖（作为碳/能源）的液体培养基，或YH)培养基，一种针对大多数啤酒糖酵母 (Saccharomyces cerevisiae)菌株的生长优化比例的蛋白胨、酵母提取物、和右旋糖的混 合物。其他限定或合成生长培养基也可被使用，并且适合特定微生物的生长的培养基将是 微生物学或发酵科学领域的技术人员已知的。已知可以直接或间接调节分解代谢物阻遏的 试剂，如环腺苷酸2' :3'单磷酸，也可以掺入发酵培养基中。
[0212] 适合发酵的pH范围是从约pH3. 0至约pH9. 0。在一个实施例中，约pH4. 0至约 PH8. 0被用于初始条件。在另一个实施例中，约pH3. 5至约pH9. 0被用于初始条件。在一个 实施例中，约pH4. 5至约pH6. 5被用于初始条件。在一个实施例中，约pH5. 0至约pH8. 0被 用于初始条件。适宜酵母发酵的pH值范围通常为约pH3.0至约pH9.0。适宜其它微生物体 发酵的pH值范围为约pH3. 0至约pH7. 5。
[0213] 在一些实施例中，所述发酵培养基与所述重组微生物的接触是在厌氧或微氧条件 下进行的。
[0214] 在一些实施例中，丁醇是在下列生长期中的一个或多个中产生的：高生长的对数 期、温和通过静态延滞期、稳定期、稳态生长期以及它们的组合。
[0215] 工业分枇和连续发酵
[0216] 在一些实施例中，可使用分批或连续发酵生产丁醇异构体。可使用分批发酵方法 产生丁醇异构体，诸如异丁醇。经典的分批发酵是封闭体系，在其中培养基的组成在发酵开 始时被设定，并且在发酵过程中不受人工改变。因此在发酵开始时，用所需生物体对培养基 进行接种，在不向系统添加任何物质的情况下进行发酵。然而，通常来说，"分批"发酵是指 碳源的添加是成批的，但经常试图控制诸如pH和氧浓度之类的因素。在分批发酵系统中， 代谢产物和生物质组成持续改变直至发酵结束时。在分批培养物内，细胞缓慢通过静态延 滞期到达高速生长对数期，并最后达到稳定期，此时生长速率减缓或终止。如果不加以处 理，稳定期中的细胞将最终死亡。通常，对数期中的细胞负责产生大部分终产物或中间产 物。
[0217] 标准的分批体系的变型是补料-分批体系。补料-分批发酵方法也适用于本发明， 并且包括典型的分批体系，不同之处在于底物随着发酵过程递增地被添加。在代谢产物往 往抑制细胞的代谢作用以及其中期望培养基中具有有限量的底物时，补料分批式系统是有 用的。补料分批式系统中的实际底物浓度难于测量并因而可根据一些可测量因素例如pH、 溶解氧以及废气如C02的分压进行评估。分批发酵和补料-分批发酵在本领域内是常用的 且众所周知，并且例子可见于如下文献：Thomas D. Brock，Biotechnology :A Textbook of Industrial Microbiology,第二版，Sinauer Associates, Inc. , Sunderland, MA) 〇 (1989) ("Brock"），或 Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol，36 :227, (1992)，该文 献以引用方式并入本文。
[0218] 可使用连续发酵方法产生丁醇异构体，诸如异丁醇。连续发酵是一种开放式系统， 其中将设定好的发酵培养基连续加入生物反应器中，并同时移出等量条件培养基用于加 工。连续发酵一般而言使培养物维持在恒定的高密度，其中细胞主要处于对数期生长。连 续发酵考虑到影响细胞生长或终产物浓度的一种因素或任何数量的因素的调节。例如，一 种方法将维持限制性营养物质诸如碳源或氮水平处于固定速率并允许所有其它参数适度。 在其它系统中，影响生长的许多因素能够连续改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保 持不变。连续系统力求维持稳态的生长条件，并因而在发酵过程中由于培养基被取出而导 致的细胞损失必须与细胞的生长率保持平衡。用于调节连续发酵工艺中的营养物质和生长 因子的方法以及使产物形成速率保持最高水平的方法是工业微生物领域众所周知的，并且 多种方法已由Brock详细描述。
[0219] 预期可采用分批、分批补料或连续方法实行丁醇（包括异丁醇）的产生，并且任何 已知的发酵模式将是合适的。此外，预期细胞可作为全细胞催化剂被固定在基质上，并经受 发酵条件以生产异丁醇。
[0220] 从发酵培养某分离丁醇的方法（回收）
[0221] 可使用本领域已知的方法从发酵培养基回收生物产生的丁醇异构体。参见， 例如，Durre，Appl. Microbiol. Biotechnol. 49 :639-648 (1998)，Groot 等人，Process. Biochem. 27 :61-75(1992)，以及本文参考。例如，可使用方法诸如蒸馏、液-液萃取、或基 于膜的分离从或发酵培养基分离丁醇。美国专利申请公布20090305370、20110312043和 20110312044(其以引用方式并入本文）描述了液-液萃取，其包括步骤有：使发酵液体培 养基与水不混溶的萃取剂接触以形成包含水相和有机相的两相混合物。
[0222] 也可利用原位产物移除（ISPR)将丁醇从发酵液体培养基中移出。在一些实施例 中，ISPR包括液-液萃取。所述萃取剂通常可为有机萃取剂,其选自饱和的、单不饱和的、多 不饱和的（以及它们的混合物）c12-c22脂肪醇、c12-c 22脂肪酸、c12-c22脂肪酸酯、c12-c22脂肪 醛、（:12-(:22脂肪酰胺、甘油三酯、以及它们的混合物，其与发酵液体培养基接触并形成包含 水相和有机相的两相混合物。所述萃取剂也可为有机萃取剂，其选自饱和的、单不饱和的、 多不饱和的（以及它们的混合物）c4-c22脂肪醇、c4-c28脂肪酸、c 4-c28脂肪酸酯、c4-c22脂肪 醛、c4-c22脂肪酰胺、以及它们的混合物，其与发酵液体培养基接触并形成包含水相和有机 相的两相混合物。来自浆液的游离脂肪酸也可用作ISPR萃取剂。ISPR萃取剂（FFA)接触 发酵液并形成包含水相和有机相的两相混合物。存在于发酵液体培养基中的产物醇优先分 配到有机相中以形成包含醇的有机相。
[0223] 因为丁醇异构体与水形成低沸点的共沸混合物，蒸馏仅能被用于分离混合物直 至其共沸组成。蒸馏可结合其他分离方法被使用，以获得共沸物附近的分离。可结合蒸 馏被用于分离和纯化丁醇的方法包括但不限于滗析、液-液萃取、吸附、和基于膜的技术。 此外，可使用共沸蒸馈用夹带剂（参见例如Dohertv和Malone, Conceptual Design of Distillation Systems，McGraw Hill，New York，（2001))分离丁醇异构体。
[0224] 当蒸馏与滗析联合使用以分离和纯化丁醇时，包含发酵液体培养基的丁醇被蒸馏 至接近共沸组合物。然后，冷凝共沸混合物，通过滗析从发酵培养基分离丁醇。滗出的水相 可作为回流返回至第一蒸馏塔。富含丁醇的滗析有机相可通过在第二蒸馏塔中蒸馏进一步 被纯化。
[0225] 当蒸馏与液-液萃取联合使用时，使用带有合适的溶剂的液-液萃取从发酵液体 培养基萃取丁醇。然后蒸馏包含丁醇的有机相以从溶剂中分离丁醇。
[0226] 当蒸馏与吸附联合使用时，蒸馏包含丁醇的发酵液使其接近共沸组成，然后使用 吸附剂移除剩余的水，例如分子筛（Aden等人，Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover, Report NREL/TP-510-32438, National Renewable Energy Laboratory,2002 年 6 月）。
[0227] 当蒸馏与全蒸发联合使用时，蒸馏包含丁醇的发酵液使其接近共沸组合物，然后 用全蒸发通过亲水性膜移除剩余的水（Guo等人，J. Membr. Sci.，245 :199-210(2004))。
[0228] 任何相中的丁醇滴度能够通过本领域中已知的方法被测定，例如通过高效液相色 谱法（HPLC)或气相色谱法，如在例如美国专利申请公布US20090305370中所描述的，该专 利以引用方式并入本文。
[0229] 移除固体的方法
[0230] 可使用本领域已知的方法移除可发酵碳底物发酵后在发酵培养基中剩余的无汁 固体残余（或固体）。这些固体包含蛋白质、纤维和油脂，可以有三种类型：干酒糟（DDG)、 酒糟干燥物（DDS)和干酒糟颗粒物（DDGS)。在这些固体中，仅DDGS能被用于动物饲料工 业。DDGS具有高营养价值并因此适于作为动物饲料。
[0231] 可通过离心、过滤、滗析等方法从发酵培养基中移除固体。移除所述固体之后，可 使用诸如蒸馏、共沸蒸馏、液-液萃取、吸附、气提、膜蒸发、或全蒸发的方法从发酵培养基 中分离丁醇。
[0232] 实魁
[0233] 本发明将在下面的实例中得到进一步阐述。应该理解，尽管这些实例说明了本发 明的实施例，但仅是以例证的方式给出的。从上述讨论和这些实例中，本领域的技术人员能 够确定本发明的基本特性，并且在不脱离其实质和范围的情况下，能够对本发明进行各种 变化和修改以适应不同的用途和条件。
[0234] 一般方法
[0235] 适于细菌培养物维持和生长的材料和方法是本领域所熟知的。以下实例中适用的 技术描述可在下列文献中查到：Manual of Methods for General Bacteriology(Phillipp 等人编辑，American Society for Microbiology， Washington， DC. ，1994)或 Brock， Biotechnology ：A Textbook of Industrial Microbiology,第二版，Sinauer Associates, Inc, Sunderland, MA(1989)。除非另外指明，用于细菌细胞生长和维持的所有试剂、 限制性酶和材料得自 Sigma-Aldrich Chemicals (St. Louis，M0)、BD Diagnostic Systems(Sparks, MD) > Invitrogen(Carlsbad, CA) > HiMedia(Mumbai, India)、SD Fine chemicals (India)、或 Takara Bio Inc. (Shiga, Japan) 〇
[0236] 测定培养某中异丁醇浓度的方法
[0237] 在培养基中的异丁醇浓度可通过本领域已知的多种方法进行测定。例如，一 种特异性的使用Shodex SH-1011柱和Shodex SH-G保护柱（二者均可购自Waters Corporation，Milford，Mass.)并联合折射率（RI)检测的高效液相色谱（HPLC)方法。用 0. 01M H2S04作为流动相，以0. 5mL/分钟流速和50°C的柱温实现色谱分离。在使用条件下异 丁醇的保留时间为46. 6分钟。作为另外一种选择，气相色谱法（GC)是可用的。例如，特异 性的 GC 方法利用 HP-INNOWax 柱（30mX 0? 53mm id，1 u m 膜厚度，Agilent Technologies， Wilmington，Del.)，配有火焰离子化检测器（FID)。载气为氦气，流速为4. 5mL/分钟，在 150°C用恒定顶压测量；注射分流比在200°C为1 :25 ;炉温为45°C 1分钟，以10°C /分钟从 45°C升温至220°C，并在220°C保持5分钟；并且FID检测在240°C、26mL/分钟的氦气补气 条件下使用。异丁醇的保留时间为4. 5分钟。
[0238] 缩写的含义如下'sec"指秒，"min"指分钟，"h"指小时，"nm"指纳米，"uL"指微 升，"mL"指毫升，"mg/mL"指毫克每毫升，"L"指升，"nm"指纳米，"mM"指毫摩尔，"M"指摩 尔，"mmol"指毫摩尔，" y mole"指微摩尔，"kg"指千克，"g"指克，" y g"指微克，"ng"指 纳克，"PCR"指聚合酶链反应，"0D"指光密度，"0D600"指在600nm波长下测量的光密度， "kDa"指千道尔顿，"g"也可指引力常数，"bp"指碱基对，"kbp"指千碱基对，"kb"指千碱 基，" ％ "指百分比，" ％ w/v"指重量/体积百分比，" ％ v/v"指体积/体积百分比，"HPLC" 指高效液相色谱，"g/L"指克每升，" y g/L"指微克每升，"ng/ y L"指纳克每微升，"pmol/ U L"指皮摩尔每微升，"RPM"指每分钟转数，" y mol/min/mg"指微摩尔每分钟每毫克，"w/ v"指每单位体积重量，"v/V"指每单位体积体积。
[0239] 除非另外指明，微生物菌株得自美国典型培养物保藏中心（ATCC)，Manassas，Va。
[0240] 表1提供了以下实例中使用的某些寡核苷酸引物。所有的寡核苷酸引物是由 Sigma-Genosvs(Woodlands, Tex.)或 Integrated DNA Technologies(IDT)(Coralville, Iowa)合成的。
[0241] 表1 :宴核苷酸引物
[0242]

【权利要求】
1. 生产丁醇的方法，包括： a) 提供重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含： i)经工程化的丁醇生物合成途径；以及 b) 使a)的宿主细胞与发酵培养基接触，所述发酵培养基包含： i) 可发酵的碳底物；和 ii) 足以改善所述宿主细胞的生长或改善丁醇的产生中的至少一个的量的乙酸盐，其 中将所述乙酸盐加入到所述发酵培养基； 其中所述重组宿主细胞已经经工程化以降低或消除丙酮酸脱羧酶（roc)活性；并且 由此经由所述经工程化的丁醇生物合成途径来直接由所述可发酵的碳底物产生丁醇。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中至少一种编码丙酮酸脱羧酶的内源基因是灭活 的。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述内源基因是roci、roC5、PDC6、或它们的组合。
4. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞已经经工程化或进化以 包含降低或消除的对于用于它们生长的外源二碳底物补充物的需求。
5. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞包含编码具有磷酸解酮 酶活性的多肽的异源多核苷酸和编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源多核苷酸。
6. 根据权利要求1所述的方法，其中所述重组宿主细胞已经经工程化以降低或消除醛 脱氢酶活性。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中编码醛脱氢酶的内源基因是灭活的。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述内源基因是ALD2、ALD3、ALD4、ALD5、ALD6、* 它们的组合。
9. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中丁醇的产生是改善的。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中丁酸的产生是下降的。
11. 根据权利要求9所述的方法，其中丁醇的收率或有效滴度是提高的。
12. 根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述丁醇是异丁醇或1-丁醇、或它 们的组合。
13. 根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述丁醇生物合成途径包括下列底 物至产物的转化： a) 丙酮酸至乙酰乳酸（途径步骤a); b) 来自a)的乙酰乳酸至2, 3-二羟基异戊酸（途径步骤b); c) 来自b)的2, 3-二羟基异戊酸至α -酮异戊酸（途径步骤c); d) 来自c)的α -酮异戊酸至异丁醛（途径步骤d);以及 e) 来自d)的异丁醛至异丁醇（途径步骤e); 并且其中 i) 步骤a)的底物至产物的转化是通过乙酰乳酸合酶进行的； ii) 步骤b)的底物至产物的转化是通过乙酰羟酸异构还原酶进行的； iii) 步骤c)的底物至产物的转化是通过二羟酸脱水酶进行的； iv) 步骤d)的底物至产物的转化是通过α-酮酸脱羧酶进行的；并且 ν)步骤e)的底物至产物的转化是通过醇脱氢酶进行的； 由此经由所述经工程化的丁醇生物合成途径来直接由丙酮酸产生异丁醇。
14. 根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述丁醇生物合成途径包括下列底 物至产物的转化： a) 丙酮酸至乙酰乳酸（途径步骤a); b) 来自a)的乙酰乳酸至2, 3-二羟基异戊酸（途径步骤b); c) 来自b)的2, 3-二羟基异戊酸至α -酮异戊酸（途径步骤c); d) 来自c)的α -酮异戊酸至异丁酰-CoA (途径步骤f);以及 e) 来自d)的异丁酰-CoA至异丁醛（途径步骤g); f) 来自e)的异丁醛至异丁醇（途径步骤e); 并且其中 i) 步骤a)的底物至产物的转化是通过乙酰乳酸合酶进行的； ii) 步骤b)的底物至产物的转化是通过乙酰羟酸异构还原酶进行的； iii) 步骤c)的底物至产物的转化是通过二羟酸脱水酶进行的； iv) 步骤d)的底物至产物的转化是通过支链酮酸脱氢酶进行的； v) 步骤e)的底物至产物的转化是通过乙酰化醛脱氢酶进行的；并且 vi) 步骤f)的底物至产物的转化是通过醇脱氢酶进行的； 由此经由所述经工程化的生物合成途径来直接由丙酮酸产生异丁醇。
15. 根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述重组宿主细胞是细菌或酵母。
16. 根据权利要求15所述的方法，其中所述重组宿主细胞是酵母，并且其中进行所述 经工程化的丁醇生物合成途径的底物至产物的转化的两种或更多种酶并非定位于线粒体。
17. 根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述发酵培养基还包含丁醇。
18. 根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述发酵培养基与所述重组宿主细 胞的接触的至少一部分是在厌氧或微氧条件下进行的。
19. 根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述发酵培养基与所述重组宿主细 胞的接触是以分批或连续发酵的方式进行的。
20. 根据权利要求1-19中任一项所述的方法，还包括c)回收所述丁醇。
21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述回收是通过蒸馏、液-液萃取、吸附、滗析、 全蒸发、或它们的组合。
22. 由根据权利要求1-21中任一项所述的方法而产生的丁醇。
23. 组合物，包含： a) 重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含： i)经工程化的丁醇生物合成途径；和 b) 发酵培养基，所述发酵培养基包含： i) 可发酵的碳底物；和 ii) 足以改善a)的宿主细胞的生长或改善丁醇的产生的量的乙酸 盐，其中将所述乙酸盐加入到所述发酵培养基； 其中所述重组宿主细胞已经经工程化以降低或消除丙酮酸脱羧酶（roc)活性以及任 选地醛脱氢酶活性。
24. 根据权利要求23所述的组合物，其中至少一种编码丙酮酸脱羧酶的内源基因是灭 活的。
25. 根据权利要求23所述的组合物，其中编码醛脱氢酶的内源基因是灭活的。
26. 根据权利要求25所述的组合物，其中所述内源基因是ALD2、ALD3、ALD4、ALD5、 ALD6、或它们的组合。
27. 根据权利要求26所述的组合物，其中所述内源基因是H)C1、PDC5、H)C6、或它们的 组合。
28. 根据权利要求23-27中任一项所述的组合物，其中所述重组宿主细胞是细菌或酵 母。
29. 根据权利要求23-27中任一项所述的组合物，其中所述发酵培养基还包含丁醇。
30. 根据权利要求29所述的组合物，其中所述丁醇是异丁醇或1-丁醇、或它们的组合。
31. 根据权利要求29或30所述的组合物，其中所述发酵培养基包含约0. OlmM至约 500mM范围内的丁醇。
32. 根据权利要求23-31中任一项所述的组合物，其中所述发酵培养基包含约0. ImM至 约50mM范围内的乙酸盐。
【文档编号】C12N9/88GK104284981SQ201380015950
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年3月15日 优先权日:2012年3月23日
【发明者】L.A.马格吉奧-哈尔 申请人:布特马斯先进生物燃料有限责任公司