脂肪酸的酶促ω氧化和ω胺化的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于氧化式（I）H3C–(CH2)n–COOR的脂肪酸或其酯的方法，其中R选自H、甲基、乙基、丙基和丁基，其中n是0-30，优选6-24，所述方法包括通过在分子氧和NAD(P)H和全细胞催化剂存在的情况下与CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶接触来氧化所述脂肪酸或其酯的步骤，所述全细胞催化剂表达重组的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶、重组的醇脱氢酶、重组的氨基转移酶和任选一种或多于一种选自以下的重组酶：丙氨酸脱氢酶、铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶，还涉及所述全细胞催化剂用于氧化脂肪酸或其酯的用途。
【专利说明】脂肪酸的酶促ω氧化和ω胺化
[0001]本发明涉及氧化脂肪酸或其酯的方法，
包括通过在分子氧和NAD (P)H和全细胞催化剂存在的情况下通过与CYP153家族的细胞色素Ρ450单加氧酶接触来氧化脂肪酸或其酯的步骤，所述全细胞催化剂表达CYP153家族的重组细胞色素Ρ450单加氧酶、重组醇脱氢酶、重组氨基转移酶和任选一种或多于一种选自丙氨酸脱氢酶、铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶的重组酶，并涉及该全细胞催化剂用于氧化脂肪酸或其酯的用途，
其中所述脂肪酸或其酯优选具有式(I)
【权利要求】
1.用于氧化式(I)的脂肪酸或其酯的方法H3C - (CH2)fl - COOR (I), 其中R选自H、甲基、乙基、丙基和丁基， 其中η是0-30，优选6-24， 所述方法包括以下步骤: a)通过在分子氧和NAD(P) H存在的情况下与CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶接触来氧化所述脂肪酸或其酯。
2.权利要求1的方法，其进一步包括以下步骤: b)通过与醇脱氢酶接触进一步氧化来自步骤a)的氧化的脂肪酸或其酯， c)通过在胺供体，优选为丙氨酸存在的情况下与氨基转移酶接触将来自步骤b)的进一步氧化的脂肪酸或其酯胺化， 其中步骤c)任选在丙氨酸脱氢酶、铵和NAD (P) H存在的情况下进行。
3.权利要求1或2任一项的方法，其中所述CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶具有肽序列LL (I/L) (V/ I) GGNDTTRN,并优选为来自泊库岛食烧菌(Alcanivorax borkumensis)SK2的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶(数据库编号YP_691921)或其变体。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述醇脱氢酶是NAD(P)+依赖的醇脱氢酶，优选来自大肠杆菌coli ) MS 187-1的NAD依赖的醇脱氢酶(数据库编号ZP_07145023)或其变体，或葡萄糖-甲醇-胆碱-氧化还原酶家族的氧化还原酶，优选来自恶臭假单胞菌putida) GB-1 (数据库编号CAB54054.1)的氧化还原酶或其变体，或含黄素的醇脱氢酶，优选来自热带念珠菌tropical is)的含黄素的醇脱氢酶(数据库编号AAS46878.1)或其变体。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中，在所述步骤a)中，存在另外的铁氧还蛋白还原酶，优选来自泊库岛食烷菌SK2的铁氧还蛋白还原酶(数据库编号YP_691923)或其变体，和/或铁氧还蛋白，优选来自泊库岛食烷菌SK2的铁氧还蛋白(数据库编号ΥΡ_691920)或其变体。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述步骤c)在丙氨酸脱氢酶、铵和NADH存在的情况下进行，并且所述丙氨酸脱氢酶是来自枯草芽孢杆菌枯草亚种憾獅―subtilis subsp.subtilis str.2你)的丙氨酸脱氢酶(数据库编号NP_391071)或其变体。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中以全细胞催化剂的形式重组提供至少一种选自以下的酶:CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶、醇脱氢酶、氨基转移酶、丙氨酸脱氢酶、铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶。
8.权利要求7的方法，其中以一种或多于一种的全细胞催化剂的形式重组提供在所述步骤a)、b)或c)的至少一个中存在的或与所述脂肪酸或其酯、来自步骤b)的进一步氧化的脂肪酸或其酯或者来自步骤c)的胺化的进一步氧化的脂肪酸或其酯接触的选自CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶、醇脱氢酶、氨基转移酶、丙氨酸脱氢酶、铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶的所有酶。
9.权利要求7-8中任一项的方法，其中所述全细胞催化剂另外表达AlkL家族的多肽，优选选自以下的AlkL:来自恶臭假单胞菌的AlkL (数据库编号CAB69081)、来自水油海杆HMarinobacter aquaeolei) VT8 的 AlkL (数据库编号 YP_957722)、来自亚历山大海洋柄菌alexandrii) HTCC2633 的 AlkL (数据库编号 ZP_00953584)、来这 Marinobacter manganoxydans MnI7_9 的 AlkL (数据库编号 ZP_09158756)、来自柄杆菌属种(GWohcter sp.) K31的AlkL (数据库编号YP_001672217)、来自食油假单胞菌{Pseudomonas oIeovorans)的 AlkL (数据库编号 Q00595)或其变体。
10.权利要求7-9中任一项的方法，其中所述全细胞催化剂是这样的细胞，其具有相比于其野生型至少一种催化脂肪酸的氧化反应之一的酶降低的活性，其中所述酶优选选自脂肪酸输入蛋白、脂肪酸-CoA连接酶、酰基-CoA脱氢酶、2，4- 二烯酰基-CoA还原酶、烯酰基-CoA水合酶和3-酮酰基-CoA硫解酶。
11.权利要求6-10中任一项的方法，其中选择步骤C)中的所述丙氨酸脱氢酶使得它还原在步骤b)中由所述醇脱氢酶氧化的氧化还原辅因子，优选NAD+或NADP+。
12.全细胞催化剂，其表达重组的CYP153家族的细胞 色素P450单加氧酶、重组的醇脱氢酶、重组的氨基转移酶和任选一种或多于一种选自以下的重组酶:丙氨酸脱氢酶、铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶。
13.权利要求12的全细胞催化剂，其中所述全细胞催化剂另外表达AlkL家族的多肽，优选选自以下的AlkL:来自恶臭假单胞菌的AlkL (数据库编号CAB69081)、来自水油海杆舊(Marinobacter aquaeolei) VT8的AlkL (数据库编号YP_957722)、来自亚历山大海洋柄菌alexandrii) HTCC2633 的 AlkL (数据库编号 ZP_00953584)、来这 Marinobacter manganoxydans MnI7_9 的 AlkL (数据库编号 ZP_09158756)、来自柄杆菌属种(GWohcter sp.) K31的AlkL (数据库编号YP_001672217)、来自食油假单胞菌{Pseudomonas oIeovorans)的 AlkL (数据库编号 Q00595)或其变体。
14.权利要求12-13中任一项的全细胞催化剂，其中所述全细胞催化剂是这样的细胞，其具有相比于其野生型至少一种催化脂肪酸的β_氧化反应之一的酶降低的活性，其中所述酶优选选自脂肪酸输入蛋白、脂肪酸-CoA连接酶、酰基-CoA脱氢酶、2，4- 二烯酰基-CoA还原酶、烯酰基-CoA水合酶和3-酮酰基-CoA硫解酶。
15.权利要求12-14中任一项的全细胞催化剂，其中所述全细胞催化剂表达铁氧还蛋白还原酶和铁氧还蛋白。
16.权利要求12-15中任一项的全细胞催化剂，其中所述全细胞催化剂表达丙氨酸脱氢酶，并且其中所述丙氨酸脱氢酶来自枯草芽孢杆菌枯草亚种168株(Bacillus subtilissubsp.subtilis str.168)(数据库编号 NPJ917I)或是其变体。
17.权利要求12-16中任一项的全细胞催化剂，其中所述CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶具有肽序列LL(I/L) (V/I)GGNDTTRN和/或它是来自泊库岛食烷菌SK2的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶(数据库编号YP_691921)或其变体，并且所述铁氧还蛋白还原酶是来自泊库岛食烷菌SK2的铁氧还蛋白还原酶(数据库编号ΥΡ_691923)或其变体，并且所述铁氧还蛋白是来自泊库岛食烷菌SK2的铁氧还蛋白(数据库编号ΥΡ_691920)或其变体。
18.权利要求1-17中任一项的全细胞催化剂或方法，其中所述醇脱氢酶是NAD(P)+依赖的醇脱氢酶、葡萄糖-甲醇-胆碱-氧化还原酶家族的氧化还原酶或者含黄素的醇氧化酶，优选NAD (P) +依赖的醇脱氢酶，最优选来自大肠杆菌MS 187-1的NAD依赖的醇脱氢酶(数据库编号ZP_07145023)或其变体。
19.权利要求1-18中任一项的全细胞催化剂或方法，其中所述氨基转移酶是来自恶臭假单胞菌GB-1的氨基转移酶(数据库编号YP_001668026.1)或其变体。
20.权利要求1-19中任一项的全细胞催化剂或方法，其中所述脂肪酸是不饱和的或支化的脂肪酸。
21.权利要求1-20中任一项的全细胞催化剂或方法，其中以全细胞催化剂的形式重组提供选自CYP153家族的细胞色素Ρ450单加氧酶、醇脱氢酶、氨基转移酶、丙氨酸脱氢酶、铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶的至少一种酶，或者所述目的通过全细胞催化剂实现，其中所述全细胞催化剂是相对于细胞的野生型具有至少一种内源醛脱氢酶降低的活性的细胞。
22.权利要求12-21中任一项的全细胞催化剂用于氧化和/或胺化脂肪酸或其酯的用途，其中所述脂肪酸或其酯优选具有式(I)H3C-(CHi)ft-COOR (I), 其中R选自H、甲基、乙基、丙基和丁基， 其中η是0-30，优选6-24。
23.权利要求22 的全细胞催化剂的用途，其中所述氧化产生氧化产物的混合物，基于反应的脂肪酸或其酯的物质的量，所述混合物包含至少90%的对应的醇、少于1%的对应的醛和少于10%的对应的酸。
24.权利要求22-23中任一项的全细胞催化剂的用途，其中所述脂肪酸是不饱和的或支化的脂肪酸。
【文档编号】C12P13/00GK104169416SQ201380015945
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2013年3月12日 优先权日:2012年3月12日
【发明者】S.沙费尔, M.豪贝格, M.韦泽尔, H-G.亨内曼, J.C.普费弗, T.哈斯, H.赫格 申请人:赢创工业集团股份有限公司