除草剂耐受性棉花事件pDAB4468.18.07.1的制作方法
【专利摘要】棉花事件pDAB4468.18.07.1包括编码AAD-12和PAT的基因，该事件为含有该事件的棉花作物提供了除草剂耐受性，并为作物保护方法提供了可能。ATCC PTA-1245620120123
【专利说明】除草剂耐受性棉花事件PDAB4468. 18. 07. 1
[0001] 优先权声明
[0002] 本专利申请要求获得于2012年1月23日提交的题为"除草剂耐受性棉花事件 PDAB4468. 18.07. 1"(HERBICIDE TOLERANT COTTON EVENT pDAB4468. 18.07. 1)美国临时专 利申请系列号61/589,602的申请日的利益。
[0003] 背景
[0004] 当在转基因植物中表达时，编码AAD_12(芳氧基链烷酸酯（aryloxyalkanoate)双 加氧酶-12)的基因能够引入针对苯氧基乙酸类除草剂2, 4-D和MCPA、和吡啶基氧基乙酸 除草剂绿草定和氟草烟的产业水平的耐受性。当在转基因植物中表达时，编码PAT (草铵膦 乙酰转移酶（phosphinothricin acetyltransferase))的基因能够引入针对除草剂草铵膦 (草胺膦）的耐受性。PAT已经成功地在棉花中表达，用作生产转基因作物的选择标志物并 用于在转基因植物中引入针对除草剂草胺膦的产业水平的耐受性。
[0005] 已知转基因在植物中的表达受到其在植物基因组中定位的影响，这可能是由于靠 近整合位点的染色质结构（例如异染色质）或者近邻转录调节元件（例如增强子）所致 (Weising et al.，Ann. Rev. Genet. 22:421-477, 1988)。与此同时，转基因在基因组的不同 位点中的存在会以不同的方式影响植物的整体表型。由于这个原因，经常需要筛选大量的 转基因事件，以便鉴定以所导入感兴趣的基因的最佳表达为特征的特定转基因事件。例如， 已经在植物和其它生物中观察到，在不同事件中导入基因的表达水平可能发生很宽泛的变 化。也可能存在空间或时间表达模式的差异,例如,转基因在各种植物组织中的相对表达的 差异，这可能与根据存在于所导入基因构建体的转录调控元件所预期的模式不对应。由于 这个原因，往往要产生数百至数千个不同的事件并对这些事件进行筛选，以便获得具有对 商业目的而言符合期望的转基因表达水平和模式的单一事件。具有期望的转基因表达水 平或模式的事件可用于使用传统的育种方法通过有性异交（outcrossing)将转基因渗入 (introgressing)到其它遗传背景中。这种杂交的后代保持原有转化子的转基因表达特征。 这一策略在许多已经良好适应局部生长条件的品种中被用于确保可靠的基因表达。
[0006] 理想的是，能够检测特定事件的存在，以便确定有性杂交的后代中是否含有感兴 趣的转基因或感兴趣的转基因群。此外，用于检测特定事件的方法将有助于遵从，例如，要 求上市前审批（pre-market approval)和对从重组作物衍生的食品或纤维进行标注的法 规，或者有助于进行环境监测，监测田间作物的性状，或者监测从作物的收获品衍生的产 品，以及用于确保相关方遵从有关法规或合同条款。
[0007] 有可能通过任何本领域已知的核酸检测方法来检测转基因事件的存在，包括但不 仅限于，聚合酶链式反应（PCR)或使用核酸探针的DNA杂交。这些检测方法一般聚焦于频繁 使用的遗传元件，例如启动子、终止子、标志物基因等，因为对于许多DNA构建体，编码区是 可以互换的。其结果是，这些方法并不能用于区分不同的事件，特别是那些使用相同的DNA 构建体或非常相似的构建体产生的事件，除非邻近所插入异源DNA的侧翼DNA的DNA序列 是已知的。例如，美国专利申请2006/0070139中描述了一种关于玉米事件DAS-59122-7的 事件特异性PCR测定法。建立一种用于鉴定棉花事件PDAB4468. 18. 07. 1的简单而有判别 力的方法是令人期待的。
[0008] 发明公开
[0009] 本发明的实施方案涉及一种新的抗除草剂的转基因棉花转化事件，其被命名为棉 花事件PDAB4468. 18. 07. 1，其包括插入到棉花细胞基因组内的特定位点的如本文所述的 aad-12和pat。代表性的棉花种子已保藏于美国典型培养物保藏中心（ATCC)，其登录号在 第[0032]段中示明。包含该事件的棉花植物的DNA包括本文中所述的、表征插入DNA在 棉花基因组内的位置的接点/侧翼序列。SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2能鉴别棉花事件 PDAB4468. 18. 07. 1。更具体地，SEQ ID NO: 1 的 bp 2885/2886 处的接点和 SEQ ID NO: 2 的 bp 147/148处的接点的周围序列能鉴别棉花事件pDAB4468. 18.07. 1。下面的段落[0012] 描述了包含这些接点的序列的实例，这些接点是含有棉花事件PDAB4468. 18.07. 1的棉花 植物的DNA的特征。
[0010] 在一个实施方案中，本发明提供了一种抗苯氧基乙酸类除草剂如2, 4-D和MCPA的 棉花植物或其部分。在另一个实施方案中，本发明提供了一种抗吡啶基氧基乙酸除草剂如 绿草定和氟草烟的棉花植物或其部分。在一个额外的实施方案中，本发明提供了一种在基 因组中包含选自下组的一个或多个序列的棉花植物：SEQ ID N0:1的bp 2867-2906 ;SEQ ID NO:1 的 bp 2837-2936 ;SEQ ID NO:1 的 bp 2787-2986 ;SEQ ID NO:1 的 bp 2737-3036 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 128-167 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 98-197 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 48-247;和 SEQ ID N0:2的bp 1-297,和其互补物。在另一个实施方案中，本发明提供了此类植物的种子。 [0011] 在另一个实施方案中，本发明提供了耐受如下化合物的棉花植物或其部分，该化 合物被转化成苯氧乙酸生长素除草剂如2, 4-D和MCPA (例如2, 4-DB、MCPB等）。在进一步 的实施方案中，本发明提供了耐受如下化合物的棉花植物或其部分，该化合物可以被转化 成吡啶基氧基乙酸除草剂如绿草定和氟草烟（例如绿草定B、氟草烟B等）。苯氧乙酸生 长素和吡啶基氧基乙酸除草剂中存在的丁酸部分可以通过P-氧化被转变成除草剂的植 物毒素形式。丁酸形式的除草剂本身是无除草活性的（nonherbicidal)。它们在易感植物 (例如棉花植物）内通过￠-氧化被转变成其各自的酸形式，正是乙酸形式的除草剂有植 物毒性。不能够进行快速3-氧化的植物不会受到丁酸除草剂的伤害。然而，能够进行快 速氧化并能够将丁酸除草剂转变成乙酸形式的植物可以随后被AAD-12保护。因此，本 发明提供了具有包含一个或多个选自下组的序列的基因组的棉花植物：SEQ ID N0:1的bp 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1 的bp 2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的bp 2787-2986 ;SEQ ID NO: 1 的 bp2737-3036 ;SEQ ID N0:2 的 bp 128-167 ;SEQ ID N0:2 的 bp 98-197 ;SEQ ID N0:2 的 bp 48-247;和SEQ ID N0:2的bp 1-297,和其互补物。在另一个实施方案中，本发明提供了这 类植物的种子。
[0012] 在另一个实施方案中，本发明提供了用于控制棉花作物中杂草的方法，包括向棉 花作物施用苯氧乙酸除草剂例如2, 4-D和MCPA，其中该棉花作物包括在基因组中含有一 个或多个选自下组的序列的棉花植物：SEQ ID NO: 1的bp 2867-2906 ;SEQ ID NO: UAbp 2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2787-2986 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2737-3036 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 128-167 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 98-197 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 48-247;和 SEQ ID NO: 2 的 bp 1-297,和其互补物，它们能鉴别棉花事件pDAB4468. 18. 07. I的存在。在另一个实施方案 中，本发明提供了用于控制棉花作物中杂草的方法，包括向棉花作物施用吡啶基氧基乙酸 除草剂如绿草定和氟草烟，其中该棉花作物包括在基因组中含有一个或多个选自下组的序 列的棉花植物：SEQ ID N0:1 的bp 2867-2906;SEQ ID N0:1 的bp 2837-2936;SEQ ID N0:1 的bp 2787-2986 ;SEQ ID N0:1 的bp 2737-3036 ;SEQ ID N0:2 的bp 128-167 ;SEQ ID N0:2 的 bp 98-197 ;SEQ ID NO:2 的 bp 48-247;和 SEQ ID NO:2 的 bp 1-297,和其互补物，它们 能鉴别棉花事件PDAB4468. 18. 07. I的存在。棉花事件pDAB4468. 18. 07. I中存在的aad-12 基因赋予对苯氧乙酸除草剂和吡啶基氧基乙酸除草剂的耐受性。
[0013] 在另一个实施方案中，本发明提供了用于控制棉花作物中杂草的方法，包括向棉 花作物施用草胺膦除草剂，所述棉花作物包括具有包含一个或多个选自下组的序列的基因 组的棉花植物：SEQ ID N0:1 的bp 2867-2906;SEQ ID N0:1 的bp 2837-2936;SEQ ID N0:1 的bp 2787-2986 ;SEQ ID N0:1 的bp 2737-3036 ;SEQ ID N0:2 的bp 128-167 ;SEQ ID N0:2 的 bp 98-197 ;SEQ ID NO:2 的 bp 48-247;和 SEQ ID NO:2 的 bp 1-297,和其互补物，它们 能鉴别棉花事件PDAB4468. 18. 07. I的存在。棉花事件pDAB4468. 18. 07. I中存在的pat基 因引入对草胺膦除草剂的耐受性。
[0014] 在另一个实施方案中，本发明提供了在含有棉花DNA的样品中检测棉花事件 PDAB4468. 18. 07. 1的方法，所述方法包括：
[0015] (a)使所述样品与第一引物和第二引物接触，第一引物的长度为至少IObp并且 选择性结合SEQ ID NO: 1的bp 1-2885内的侧翼序列或其互补物，第二引物的长度为至少 IObp并且选择性结合SEQ ID NO: 1的bp 2886-3205内的插入序列或其互补物；和
[0016] 对所述引物之间产生的扩增子进行测定；或
[0017] (b)使所述样品与第一引物和第二引物接触，第一引物的长度为至少IObp并且选 择性结合SEQ ID N0:2的bp 1-147内的插入序列或其互补物，第二引物的长度为至少IObp 并且选择性结合SEQ ID N0:2的bpl48-1049内的侧翼序列或其互补物；和
[0018] (C)对所述引物之间产生的扩增子进行测定。
[0019] 在另一个实施方案中，本发明提供了检测棉花事件PDAB4468. 18. 07. 1的方法，包 括：
[0020] (a)使所述样品与第一引物和第二引物接触，第一引物与选自下组的侧翼序列选 择性结合：SEQ ID NO: 1的bp 1-2885和SEQ ID NO:2的bpl48-1049,和其互补物，第二引 物与SEQ ID NO:3或其互补物选择性结合；
[0021] (b)使所述样品进行聚合酶链式反应；和
[0022] (C)对所述引物之间产生的扩增子进行测定。
[0023] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种棉花植物育种的方法，包括：将第一植物 与第二棉花植物杂交产生第三棉花植物，所述第一植物包含如下的DNA，该DNA含有一个或 多个选自下组的序列：SEQ ID NO: 1 的 bp 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的bp 2787-2986 ;SEQ ID NO: 1 的bp 2737-3036 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 128-167 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 98-197 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 48-247;和 SEQ ID NO: 2 的 bp 1-297,和其互补 物；对所述第三棉花植物测定包含一个或多个选自下组的序列的DNA的存在：SEQ ID NO: I 的 bp 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2787-2986 ;SEQ ID N0:1 的 bp 2737-3036 ;SEQ ID N0:2 的 bp 128-167 ;SEQ ID N0:2 的 bp 98-197 ;SEQ ID NO:2 的 bp 48-247 ;和 SEQ ID NO:2 的 bp 1-297,和其互补物。
[0024] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的DNA分子，其能鉴别棉花事件 PDAB4468. 18. 07. 1。除了 SEQ ID N0S:1和2之外，这些分子还包括长度至少为40bp，并包 括跨越SEQ ID NO: 1的bp 2885/2886接点的多核苷酸序列的分子，和长度至少为40bp， 并包括跨越SEQ ID N0:2的bp 147/148接点的多核苷酸序列的分子。实例包括：SEQ ID NO: 1 的 bp 2867-2906 ;SEQ ID NO:1 的 bp 2837-2936 ;SEQ ID NO:1 的 bp 2787-2986 ;SEQ ID NO: I 的bp 2737-3036 ;SEQ ID NO: 2 的bp 128-167 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 98-197 ;SEQ ID NO:2 的 bp 48-247;和 SEQ ID NO:2 的 bp 1-297,和其互补物。
[0025] 在另一个实施方案中，本发明提供了棉花纤维、颗粒（grain)、种子、种子油或种子 柏，在所述棉花纤维、颗粒、种子、种子油或种子柏中含有棉花事件PDAB4468. 18.07. 1，表现 为该棉花纤维、颗粒、种子、种子油或种子柏的DNA中含有一个或多个选自下组的序列：SEQ ID NO:1 的 bp 2867-2906 ;SEQ ID NO:1 的 bp 2837-2936 ;SEQ ID NO:1 的 bp 2787-2986 ; SEQ ID N0:1 的 bp 2737-3036 ;SEQ ID N0:2 的 bp 128-167 ;SEQ ID N0:2 的 bp 98-197; SEQ ID NO:2 的 bp 48-247;和 SEQ ID NO:2 的 bp 1-297,和其互补物。
[0026] 本发明的实施方案还包括含有棉花事件pDAB4468. 18. 07. I的棉花植物细胞和植 物部分，包括但不仅限于，花粉、胚珠、花、芽（shoot)、根和叶，以及营养细胞的细胞核、花粉 细胞、种子、种子油和种子柏、及卵细胞（egg cell)。
[0027] 在一些实施方案中，棉花事件pDAB4468. 18. 07. 1可以和其它性状组合，其他性 状包括例如其它除草剂耐受基因和/或昆虫抑制蛋白和转录调节序列（例如RNA干扰、 dsRNA、转录因子等）。额外的性状可以通过植物育种、对含有棉花事件pDAB4468. 18. 07. 1 的转基因植物的再次转化、或同源重组介导的靶向整合添加新性状，而叠加到植物基因组 内。
[0028] 其它实施方案包括切离包含棉花事件PDAB4468. 18. 07. 1的多核苷酸序列，包括 例如pat基因表达盒。一旦切离多核苷酸序列，经过修饰的事件可以被重新靶定到特定的 染色体位点，在该位点中额外的多核苷酸序列与棉花事件PDAB4468. 18. 07. 1叠加。
[0029] 在一个实施方案中，本发明涵盖棉花染色体靶位点，其位于D亚基因组26号的染 色体上SEQ ID NOS: 1和2中表示的侧翼序列之间。
[0030] 在一个实施方案中，本发明包括制作转基因棉花植物的方法，包括将异源核酸插 入在D亚基因组26号染色体上SEQ ID NO: 1和2中表示的基因组序列之间的位置，即SEQ ID NO: 1 的 bp 1-2885 和 SEQ ID NO:2 的 bp 148-1049 之间的位置。
[0031] 此外，本发明的实施方案还提供了用于检测样品（例如棉花纤维的样品）中主题 事件之存在的测定法。该测定法可以基于插入到棉花基因组中的重组构建体的DNA序列， 并基于插入位点侧翼的基因组序列。还提供了可用于实施该测定法的试剂盒和条件。
[0032] 本发明的实施方案还部分地涉及对转基因棉花品系中由于插入来自PDAB4468的 T-DNA而产生的边界区域的DNA序列的克隆和分析。这些序列是唯一的。基于插入序列和 接点序列，可以生成且实际生成了事件特异性引物。PCR分析表明，这些事件可以通过分析 用这些事件特异性引物组所产生的PCR扩增子来加以辨识。因此，这些和其他相关的程序 可以用于唯一地辨识包含本发明事件的棉花品系。
[0033] -个实施方案提供了一种控制棉花作物中杂草的方法，包括向棉花作物施用苯氧 乙酸除草剂，所述棉花作物包括含有如下所述的DNA的棉花植物，所述DNA包含选自下组 的序列：SEQ ID NO: 1 的 bp 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2787-2986 ;SEQ ID NO: I 的 bp 2737-3036 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 128-167 ;SEQ ID NO: 2 的bp 98-197 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 48-247;和 SEQ ID NO: 2 的 bp 1-297。在本方法进一步的方面 中，苯氧乙酸除草剂是2, 4-D。在本方法进一步的方面中，苯氧乙酸除草剂是MCPA。
[0034] 一个实施方案提供了一种控制棉花作物中杂草的方法，包括向棉花作物施用吡啶 氧基乙酸除草剂，所述棉花作物包括含有如下所述的DNA的棉花植物，所述DNA包含选自下 组的序列：SEQ ID NO: 1 的 bp 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2787-2986 ;SEQ ID N0:1 的 bp 2737-3036 ;SEQ ID N0:2 的 bp 128-167 ;SEQ ID N0:2 的 bp 98-197 ;SEQ ID N0:2 的 bp 48-247;和 SEQ ID N0:2 的 bp 1-297。在本方法进一步 的方面中，吡啶氧基乙酸除草剂是绿草定。在本方法进一步的方面中，苯氧乙酸除草剂是氟 草烟。
[0035] -个实施方案提供了一种控制棉花作物中杂草的方法，包括向棉花作物施用草胺 膦除草剂，所述棉花作物包括含有如下所述的DNA的棉花植物，所述DNA包含选自下组的 序列：SEQ ID NO: 1 的 bp 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2787-2986 ;SEQ ID N0:1 的bp 2737-3036 ;SEQ ID N0:2 的bp 128-167 ;SEQ ID N0:2 的bp 98-197 ;SEQ ID N0:2 的 bp 48-247 ;和 SEQ ID N0:2 的 bp 1-297。
[0036] -个实施方案提供了一种分离的DNA序列，其包含一个或多个选自下组的序 列：SEQ ID NO: 1 的 bp 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2787-2986 ;SEQ ID N0:1 的bp 2737-3036 ;SEQ ID N0:2 的bp 128-167 ;SEQ ID N0:2 的bp 98-197 ;SEQ ID NO:2 的 bp 48-247 ;和 SEQ ID NO:2 的 bp 1-297。
[0037] -个实施方案提供了一种棉花植物育种的方法，包括：将第一植物与第二棉花植 物杂交产生第三棉花植物，所述第一植物包含含有一个或多个选自下组的序列的DNA :SEQ ID NO:1 的 bp 2867-2906 ;SEQ ID NO:1 的 bp 2837-2936 ;SEQ ID NO:1 的 bp 2787-2986 ; SEQ ID N0:1 的bp 2737-3036 ;SEQ ID N0:2 的bp 128-167 ;SEQ ID N0:2 的bp 98-197 ;SEQ ID NO:2的bp 48-247;和SEQ ID NO:2的bp 1-297,和其互补物；以及对所述第三棉花植 物测定包含一个或多个选自下组的序列的DNA的存在：SEQ ID NO: 1的bp 2867-2906 ;SEQ ID NO:1 的 bp 2837-2936 ;SEQ ID NO:1 的 bp 2787-2986 ;SEQ ID NO:1 的 bp 2737-3036 ; SEQ ID N0:2 的bp 128-167;SEQ ID N0:2 的bp 98-197;SEQ ID N0:2 的bp 48-247;和SEQ ID N0:2的bp 1-297,和其互补物。
[0038] -个实施方案提供了一种分离的DNA分子，其包含接点序列，所述接点序列包含 至少一个选自下组的序列：SEQ ID NO: 1 的 bp 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2837-2936 ; SEQ ID N0:1的bp 2787-2986;SEQ ID N0:1的bp 2737-3036;SEQ ID N0:2的bp 128-167; SEQ ID NO: 2 的 bp 98-197 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 48-247;和 SEQ ID NO: 2 的 bp 1-297,和其 互补物。
[0039] -个实施方案提供了一种棉花种子，其在基因组中包含选自下组的DNA序列： SEQ ID NO: 1 的残基 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1 的残基 2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的残 基 2787-2986 ;SEQ ID N0:1 的残基 2737-3036 ;SEQ ID N0:2 的残基 128-167 ;SEQ ID NO: 2 的残基 98-197 ;SEQ ID NO: 2 的残基 48-247 ;SEQ ID NO: 2 的残基 1-297,和其互补 物。进一步的实施方案提供了一种棉花种子，其在基因组中包含AAD-12/PAT棉花事件 PDAB4468. 18.07. 1，并且其代表性棉花种子被保藏在美国典型培养物保藏中心，登录号 为No. PTA-12456。进一步的实施方案提供了一种通过种植这两个实施方案中任一个的 棉花种子产生的棉花植物。进一步的实施方案提供了通过该棉花植物生产的棉花种子， 其中所述种子在其基因组中含有AAD-12/PAT棉花事件pDAB4468. 18. 07. 1，其与以登录 号No. PTA-12456保藏在美国典型培养物保藏中心的棉花种子中存在的AAD-12/PAT棉花 事件PDAB4468. 18. 07. 1相同。进一步的实施方案提供了该棉花植物的部分，其中所述部 分选自下组：花粉、胚珠、花、棉铃、芽、根和叶，并且所述部分包含AAD-12/PAT棉花事件 PDAB4468. 18.07. 1。进一步的实施方案提供了从棉花植物或其部分衍生的组合物，其中所 述组合物是选自下组的商业产品：棉柏、棉纤维和棉籽油。
[0040] 在进一步的实施方案中，棉花植物包含与SEQ ID NO: 17的残基2, 886-9, 253具有 至少95%的序列同一性的DNA序列。一个实施方案提供了上述实施方案植物的后代棉花植 物，其中所述植物对苯氧基乙酸、吡啶基氧基乙酸和草胺膦除草剂显示耐受性，并且所述耐 受性是由于所述事件或所述基因组中编码的蛋白质的表达导致的。
[0041] 进一步的实施方案提供了一种棉花种子，包含含有如下所述的DNA序列的基因 组，所述DNA序列与SEQ ID N0:17具有至少95%的序列同一性。进一步的实施方案提供了 通过种植该棉花种子产生的植物。
[0042] 一个实施方案提供了一种含有棉花事件pDAB4468. 18. 07. 1的转基因棉花植物或 其部分，其中包含棉花事件PDAB4468. 18.07. 1的代表性棉花种子已经被保藏在美国典型 培养物保藏中心，登录号为No. PTA-12456。
[0043] 种子保藏
[0044] 作为本公开的一部分，至少2500粒含有棉花事件pDAB4468. 18. 07. 1的 棉花品系的种子被保藏在美国典型培养物保藏中心（ATCC) (10801University Boulevard, Manassas, VA, 20110)，公众可以无限制地获得（但是受专利权保护）。该保藏 被指定为ATCC登录号PTA-12456,是以陶氏益农公司（Dow AgroSciences LLC)的名义于 2012年1月23日保藏的。该保藏的实施和维持遵照布达佩斯条约关于专利程序目的的种 子保藏条款。
[0045] 序列简述
[0046] SEQ ID NO: 1是用于棉花事件pDAB4468. 18. 07. 1的Y DNA侧翼边界序列。核苷 酸1-2885是基因组序列。核苷酸2886-3205是插入序列。
[0047] SEQ ID NO: 2是用于棉花事件pDAB4468. 18. 07. 1的:V DNA侧翼边界序列。核苷 酸1-147是插入序列。核苷酸148-1049是基因组序列。
[0048] SEQ ID NO: 3是pDAB4468的T-链DNA序列，其在下面的表1中有注释。
[0049] SEQ ID N0:4是用于确认3'边界基因组DNA的寡核苷酸引物3endGl。
[0050] SEQ ID N0:5是用于确认3'边界基因组DNA的寡核苷酸引物3endG2。
[0051] SEQ ID N0:6是用于确认3'边界基因组DNA的寡核苷酸引物3endG3。
[0052] SEQ ID N0:7是用于确认5'边界基因组DNA的寡核苷酸引物5endGl。
[0053] SEQ ID N0:8是用于确认5'边界基因组DNA的寡核苷酸引物5endG2。
[0054] SEQ ID N0:9是用于确认5'边界基因组DNA的寡核苷酸引物5endG3。
[0055] SEQ ID NO: 10是用于确认5'边界基因组DNA的寡核苷酸引物5endG4。
[0056] SEQ ID NO: 11是用于确认5'边界基因组DNA的寡核苷酸引物5endTl。
[0057] SEQ ID NO: 12是用于确认Y边界基因组DNA的寡核苷酸引物5endT2。
[0058] SEQ ID NO: 13是用于确认5'边界基因组DNA的寡核苷酸引物5endT3。
[0059] SEQ ID NO: 14是用于确认:V边界基因组DNA的寡核苷酸引物3endTl。
[0060] SEQ ID NO: 15是用于确认3'边界基因组DNA的寡核苷酸引物3endT2。
[0061] SEQ ID NO: 16是用于确认3'边界基因组DNA的寡核苷酸引物3endT3。
[0062] SEQ ID N0:17是棉花事件pDAB4468. 18. 07. 1的预期序列，包括5'基因组侧翼序 列、PDAB4468T-链插入、和3'基因组侧翼序列。
[0063] 附图简述
[0064] 图1是含有aad-12和pat基因表达盒的pDAB4468的质粒图。
[0065] 图2描绘了用于确认棉花事件pDAB4468. 18. 07. 1的5'和3'边界序列的引物位 置。
[0066] 实施本发明的模式
[0067] 棉花事件pDAB4468. 18. 07. 1插入的两端均已被测序和表征。事件特异性测定法 已经得以开发。该事件已被定位（mapped)到棉花基因组中（D亚基因组的26号染色体）。 可以令该事件渗入到更多的优良品系中。
[0068] 如在上文"背景"部分提到的，将转基因引入并整合到植物基因组中涉及到一些随 机事件（故而将得到表达的给定插入命名为"事件"）。也就是说，由于转化技术众多，诸如 土壤杆菌转化、基因枪转化（即基因枪）和碳化硅介导的转化（即WHISKERS)等，无法预测 转基因将会插入在基因组中的何处。因此，鉴定插入物两侧的侧翼植物基因组DNA对于辨 识具有给定插入事件的植物而言是重要的。例如，可设计PCR引物使其产生跨越插入物和 宿主基因组的接点区的PCR扩增子。该PCR扩增子可用于鉴定插入事件的独特或不同的类 型。
[0069] 本文提供了定义和实施例，用以帮助描述本发明的实施方案，并指导本领域的普 通技术人员实践这些实施方案。除非另有说明，否则术语可以被相关领域的普通技术人员 根据常规的用法来理解。DNA碱基的命名根据37CFR § 1. 822所述。
[0070] 如这里所使用的，术语"后代"是指包含棉花事件pDAB4468. 18. 07. 1的任何一代 亲本植物的后代。
[0071] 转基因"事件"是通过用异源DNA，即包含感兴趣的转基因的核酸构建体转化植物 细胞，再生由于转基因插入到植物的基因组中而产生的植物群体，且选择特定基因组位置 中的插入为特征的特定植物而产生的。术语"事件"是指包含异源DNA的原始转化体以及 该转化体的后代。术语"事件"也指通过转化体与另一含有基因组/转基因DNA的品种之 间的有性异交产生的后代。即使经过与轮回亲本进行多次回交，插入的转基因DNA和来自 被转化亲本的侧翼基因组DNA (基因组/转基因DNA)仍存在于杂交后代的同一染色体位置 处。术语"事件"还指来自原始转化体和其后代的、包含插入的DNA和与插入的DNA紧邻的 侧翼基因组序列的DNA，该DNA预期会被转移给由于一个包含插入DNA的亲本品系（例如原 始转化体和通过自交产生的后代）与一个不包含插入DNA的亲本品系之间的有性杂交，而 接受包括感兴趣的转基因在内的插入DNA的后代。
[0072] "接点序列"或"边界序列"跨越下述二者的连接点：插入到基因组内的DNA ;和来 自位于该插入点侧翼的棉花天然基因组的DNA。鉴定或检测植物遗传材料中的任一接点序 列（one or the other junction sequences)足以用来鉴别该事件。跨越本文中描述的棉 花事件中的插入点、和相似长度的侧翼DNA的DNA序列被包括在内。本文中提供了这样的 鉴别性序列的具体实例；然而，其它与各插入物的接点、或各插入物与基因组序列的接点重 叠的序列，也能鉴别，并且可以根据本发明的实施方案加以使用。
[0073] 本发明的实施方案部分地涉及使用这些侧翼、接点和插入序列进行事件鉴定。相 关的PCR引物和扩增子也包含在本发明的实施方案中。根据本发明的实施方案，可以利用 使用跨越所插入的DNA和其边界的扩增子的PCR分析方法检测或鉴定从本专有权转基因棉 花品系衍生的商业化转基因棉花品系或品种。
[0074] 侧翼/接点序列能鉴别棉花事件PDAB4468. 18. 07. 1。基于这些序列，生成了事件 特异性的引物。PCR分析表明，通过分析用这些事件特异性引物组产生的PCR扩增子，可以 在不同棉花基因型中鉴定这些棉花品系。因此，这些和其他相关的程序可用于唯一地鉴定 这些棉花品系。本文中鉴定的序列是唯一的。
[0075] 本发明实施方案的检测技术可特别用于和植物育种相结合，用来在为了向后代中 引入一个或多个额外的感兴趣的性状而将包含感兴趣的事件的亲本植物与另一种植物品 系杂交之后，确定哪个后代植物包含给定的事件。这些PCR分析方法有利于棉花育种计划， 以及品质控制，尤其是对商业化的转基因棉花种子。现在还可以制作和使用用于这些转基 因棉花品系的PCR检测试剂盒。这也有利于产品注册和产品管理。
[0076] 进一步地，侧翼棉花/基因组序列可用于具体鉴定每一个插入物的基因组位置。 这个信息可用于制作特异针对每个事件的分子标志系统。这些可用于快速育种策略和建立 连锁数据。
[0077] 更进一步地，侧翼序列信息可用于研究和表征转基因整合过程、基因组整合位点 特征、事件分选（sorting)、转基因及其侧翼序列的稳定性、和基因表达（尤其是涉及基因 沉默、转基因的甲基化模式、位置效应、以及潜在的表达相关元件如MARS [基质结合区]，等 等）。
[0078] 根据本公开的所有内容，应该明确，本发明的实施方案包括基于在段落[0032]中 示明的ATCC登录号可获得的种子。本发明的实施方案还包括以在段落[0032]中示明的 ATCC登录号保藏的种子所种植出的除草剂耐受性棉花植物。本发明的实施方案还包括所述 植物的部分，例如叶、组织样品、由所述植物产生的种子、花粉等（其中植物的这些部分包 括 aad-12 和 pat，和 SEQ ID NO: 1 和 2)。
[0079] 更进一步，本发明的实施方案还包括从所保藏种子种植出的植物的子代和/或后 代植物，优选地是抗除草剂棉花植物，其中所述植物具有包含如本文中所述的可检测接点/ 侧翼序列的基因组。本文中所使用的术语"棉花"是指陆地棉（Gossypium hirsutum)，包括 其能够用棉花植物育种而得的所有品种。
[0080] 本发明实施方案的除草剂耐受性棉花植物可以通过如下所述育种：首先使第一亲 本棉花植物与第二亲本棉花植物进行第一次有性杂交，其中第一亲本棉花植物由本文中提 到的任何一种品系的种子长成的棉花植物构成，从而产生多个第一子代植物；然后选择抗 草胺膦的第一子代植物；使该第一子代植物自交，从而产生多个第二子代植物；然后从这 些第二子代植物中选出抗草胺膦的植物。这些步骤可以进一步包括使所述第一子代植物或 所述第二子代植物与所述第二亲本棉花植物或第三亲本棉花植物回交。然后可以种植包含 本发明实施方案的棉花种子、或其后代的棉花作物。
[0081] 还应当理解，两个不同的转基因植物也可以交配而产生含有两个独立分离 (segregating)、加合的外源基因的后代。合适子代的自交可以产生对两个加合的外源基因 均为纯合的植物。还构想了与亲本植物的回交和与非转基因植物的异交，以及无性繁殖。其 他通常用于不同性状和作物的育种方法是本领域已知的。回交育种已经被用于基因转移， 以将简单遗传的、高度可遗传的性状引入到作为轮回亲本的期望纯合栽培品种中。待转移 性状的来源被称为供体亲本。得到的植物可望具有轮回亲本（例如栽培种）的属性和从供 体亲本转移而来的期望性状。最初的杂交之后，选择具有供体亲本表型的个体，并与轮回亲 本反复杂交（回交）。得到的植物可望具有轮回亲本（例如栽培种）的属性和从供体亲本 转移而来的期望性状。
[0082] 类似地，本发明一个实施方案的除草剂耐受性棉花植物可以使用本领域已知的方 法用额外的转基因进行转化。转化技术如土壤杆菌转化、基因枪转化（即基因枪）、和碳化 硅介导的转化（即WHISKERS)，可用于将额外的转基因导入到棉花事件pDAB4468. 18. 07. 1 的基因组中。可以进行对含有新插入的转基因的转基因植物的选择和表征，以鉴定含有除 本发明实施方案aad-12和pat基因之外的其他新型转基因的稳定整合体的植物。
[0083] 本发明实施方案的DNA分子可以用作分子标志辅助育种（MB)方法中的分子标 志。本发明实施方案的DNA分子可以在用于鉴定遗传连锁农艺有用性状的方法（例如AFLP 标志、RFLP标志、RAH)标志、SNP和SSR)中使用，如本领域已知的。可以使用MAB方法在与 本发明实施方案的棉花植物（或其后代和任何其他棉花栽培品种或变种）的杂交后代中跟 踪除草剂耐受性特性。这些DNA分子是此性状的标志，可以使用本领域众所周知的MB方 法在棉花植物--本发明实施方案的至少一种棉花品系或其后代在这些植物中是亲本或 祖先--中跟踪耐除草剂性状。本发明实施方案的方法可以用于鉴定具有主题事件的任何 棉花品种。
[0084] 本发明实施方案的方法包括产生抗除草剂的棉花植物的方法，其中所述方法包括 用根据本发明一个实施方案的植物育种。更具体地，所述方法可以包括使两个本发明实 施方案的植物杂交，或者使一个本发明实施方案的植物与任何其它植物杂交。优选的方 法进一步包括通过分析所该杂交的子代中可以根据本发明实施方案检测到的事件和有利 的品种性能（例如产量），来筛选所述杂交的后代。例如，本发明的实施方案可用于通过 使用包含其它期望性状（如农艺性状、疾病耐受性或抵抗性、线虫耐受或抵抗性和成熟日 期）的植物进行育种循环对主题事件进行跟踪。包含主题事件和期望性状的植物可以得 到检测、鉴定、筛选和快速利用，例如在更多轮的育种中利用。主题事件/性状也可以通过 育种与其他的抗昆虫性状和/或与其他的抗除草剂性状结合，并根据本发明的实施方案 的方法进行跟踪。后者的实施方案是包含与crylF和crylAc基因组合、或与具有编码对 除草剂麦草畏耐受性的基因组合的主题事件的植物，crylF和cryIAc基因赋予对豆夜蛾 (Pseudoplusia includens)(大豆尺蠖）、Anticarsia gemmatalis (绒毛豆毛虫）、Epinotia aporema、Omoides indicatus、Rachiplusia NU,草地夜蛾（Spodoptera frugiperda)、斜纹 夜蛾（Spodoptera cosmoides)、亚热带粘虫（Spodoptera eridania)、烟芽夜蛾（Heliothis virescens)、美洲棉铃虫（Heliocoverpa zea)、黄色灯蛾虫（Spilosoma virginica)和南美 玉米苗斑螟（Elasmopalpus lignosellus)的耐受性。
[0085] 因此，本方面的实施方案可以与编码下述抗性的性状组合：草甘膦抗性（例如抗 性植物或细菌的EPSPS，GOX，GAT)、草胺膦抗性（例如dsm-2, bar)，乙酰乳酸合酶（ALS)抑 制性除草剂（例如咪唑啉酮[如咪草烟]、磺酰脲类、三唑嘧啶磺苯胺类、嘧啶硫代苯甲酸 类&71'1111(1；[11711：11；[(^61^03丨68)，和其它化学品[081'1，511^等])抗性、溴苯腈抗性（例如 Bxn)、HPH) (4-羟苯基-丙酮酸-双加氧酶）酶抑制剂抗性、八氢番茄红素去饱和酶（PDS) 抑制剂抗性、光系统II型除草剂抗性（例如psbA)、光系统I型除草剂抗性、原卟啉原氧化 酶IX(PPO)抑制型除草剂抗性（例如PP0-1)、苯脲除草剂抗性（例如CYP76B1)、麦草畏降 解酶（见例如US 20030135879)，和其它可以被单独叠加或多重组合的性状，从而提供有效 控制或阻止杂草迁移和/或对任何前述类型的除草剂的抗性的能力。
[0086] 此外，棉花事件pDAB4468. 18.07. 1可以和一种或多种额外的输入（例如昆虫抗 性、病原体抗性或胁迫耐受性等）或输出（例如增加的产量、改善的油谱、提高的纤维品质 等）性状组合。因此，本发明的实施方案可用于提供一套完整的改良作物品质农艺包，其能 够灵活而成本高效地控制任意数量的农业害虫。
[0087] 通过同源重组将多核苷酸序列整合在植物细胞中的特定染色体位点上的方法，在 本领域中已有描述。例如，如在美国专利申请公开No. 2009/0111188 Al中描述的位点特 异性整合描述了利用重组酶或整合酶介导将供体多核苷酸序列引入到染色体靶中。此外， 国际专利申请No. WO 2008/021207描述了锌指介导的同源重组，用于将一个或多个供体多 核苷酸序列整合到基因组的特定位置。可以使用重组酶，例如在美国专利No. 6720475中 描述的FLP/FRT或在美国专利No. 5, 658, 772中描述的CRE/L0X，将多核苷酸序列整合到特 定的染色体位点上。最后，使用大范围核酸酶将供体多核苷酸靶定到特定的染色体位置，在 Puchta et al.，PNAS USA 93 (1996) pp. 5055-5060 中有描述。
[0088] 其它用于在植物细胞中进行位点特异性整合的方法通常是已知的并且是适用的 (Kumar et al.，Trends in Plant Sci. 6 (4) (2001) pp. 155-159)。进一步，已经在多种原 核和低等真核微生物中鉴定的位点特异性重组系统可以应用于植物中。这种系统的实例 包括，但不限于，来自鲁氏酵母PSRl质粒的R/RS重组酶系统（Araki et al. (1985)J.Mol. Biol. 182:191-203)和噬菌体 Mu 的 Gin/gix 系统（Maeser and Kahlmann(1991)Mol. Gen. Genet. 230:170-176)。
[0089] 在本发明的一些实施方案中，理想的是，在现有转基因事件的附近整合或叠加新 的转基因。基于独特的特征（例如单插入位点、正常的孟德尔分离和稳定的表达）和卓越 的功效组合（包括除草剂耐受性以及多种环境场所之内或跨越多种环境场所的农艺性能） 而选择的转基因事件，可以认为是优选的基因组位点。新整合的转基因应当保持现有的转 化体的转基因表达特征。而且，由于基因组侧翼序列和新整合事件的染色体位置已经被确 定，开发用于检测和确认新整合事件的测定法将不是问题。最后，新的转基因整合到与现有 转基因连锁的特定染色体位置中，将加快通过使用常规育种方法的有性异交将转基因向其 它遗传背景的基因渗入。
[0090] 在本发明的一些实施方案中，理想的是从转基因事件切出多核苷酸序列。例如，如 在美国专利申请公开No. 2011/0191877中所述的转基因切出，采用锌指核酸酶从染色体整 合的转基因事件中除去由基因表达盒构成的多核苷酸序列。被去除的多核苷酸序列可以是 可选择标志。一旦切出并去除多核苷酸序列，可以通过插入多核苷酸序列来重新靶定该经 过修饰的转基因事件。多核苷酸序列的切出和后续经修饰转基因事件的重靶定可以提供许 多好处，例如重复使用可选择标志物、或能够克服由于特定基因的表达导致的对植物转录 组的意外改变。
[0091] 本文公开了棉花基因组中D亚基因组的26号染色体上的特定位点，其对于异源核 酸的插入是极为理想的。因此，本发明的实施方案提供了将感兴趣的异源核酸导入到该预 先建立的目标位点或该目标位点附近的方法。本发明的实施方案还包括一种棉花种子和/ 或棉花植物，其包含插入在所公开的目标位点中或该位点附近的任何异源核苷酸序列。实 现这种靶向整合的一个选项是，切出本文中示例的pat表达盒和/或用不同的插入物代替 之。在此可以根据本发明的实施方案使用例如靶向同源重组，但不局限于此。
[0092] 如本文中所使用的，基因、事件或特征"叠加"是指将期望的性状组合到一个转基 因品系中。植物育种者通过将各自具有期望性状的亲本进行杂交，然后鉴定同时具有这些 期望性状的后代，来叠加转基因性状。另一种叠加基因的方式是在转化期间同时向植物的 细胞核内转移两个或多个基因。另一种叠加基因的方式是用另一个感兴趣的基因再次转化 转基因植物。例如，基因叠加可用于组合两种或更多种不同的特征，包括例如，两种或更多 种不同的昆虫性状、昆虫抗性性状和疾病抗性性状，两种或更多种除草剂抗性性状，和/或 昆虫抗性性状和除草剂抗性性状。在感兴趣的基因的基础上使用可选择标志物也可以视为 基因置加。
[0093] "同源重组"是指任何在相应位置处含有相似核苷酸序列的一对核苷酸序列之间 的反应，通过该反应，这两个核苷酸序列能够相互作用（重组）形成一个新的重组DNA序 列。相似核苷酸序列的位点在本文中分别称为"同源序列"。一般来说，同源重组的频率随 着同源序列长度的增加而增大。因此，尽管同源重组可以在两个不完全相同的核苷酸序列 之间发生，但是重组的频率（或效率）随着两个序列之间差异性的增加而降低。重组可以 用每个供体上的一个同源序列和靶分子实现，从而产生"单交换"重组产物。或者，可将两 个同源序列放置在每个靶标和供体核苷酸序列上。供体上的两个同源序列与靶标上的两个 同源序列之间的重组会产生"双交换"重组产物。如果供体分子上的同源序列位于待操作 序列（例如感兴趣的序列）的两侧，则与靶分子的双交换重组将产生这样的重组产物，其中 感兴趣的序列代替了原本位于靶分子上的同源序列之间的DNA序列。通过双交换重组事件 实现的靶标与供体之间的DNA序列交换被称为"序列替代。"
[0094] 本发明实施方案的优选植物或种子在其基因组中含有如本文所鉴定的起作用的 aad-12和pat核苷酸序列，以及如本文所鉴定的位于该插入物两侧的至少20-500个或更多 个毗邻的侧翼核苷酸。除非另有说明，否则提到"侧翼序列"是指相对于SEQ ID N0:1和2 鉴定的那些。这些侧翼序列的全部或一部分可以预期被转移给由于含有该事件的亲本品系 的有性杂交而接收被插入的DNA的后代。
[0095] 本发明的实施方案包括本发明一个实施方案的植物的可再生细胞的组织培养物。 此外，还包含从这种组织培养物再生的植物，特别是当所述植物能够表达一个示范品种的 所有形态学和生理学特征时。本发明实施方案的优选植物具有从所述保藏种子种植的植物 的所有生理学和形态学特征。本发明的实施方案进一步包括这种种子的后代和具有感兴趣 的品质性状的种子的后代。
[0096] 如这里所使用的，"品系"是指个体之间就至少一个性状而言显示很小或没有遗传 变异的一群植物。这些品系可以通过数代的自花授粉和选择，或者通过使用组织或细胞培 养技术从单个亲本无性繁殖而获得。
[0097] 如这里所使用的，术语"栽培种"和"品种"是同义的，是指用于商业生产的品系。 [0098] "稳定性"或"稳定的"是指，相对于给定的组分，该组分在代与代之间得以保持，优 选为至少三代。
[0099] "商业效用"被定义为具有良好的植物活力和高生育力，使得作物能够被农民用 传统的种植设备生产，并且能够使用常规的破碎和提取设备从种子中提取具有所述组分的 油。
[0100] "农艺学优良"是指某个品系除了由主题事件导致的除草剂耐受性之外，还具有理 想的农艺性状，如产量、成熟度、抗病性等。这些农艺学特性和数据点中的任何一个或全部 均可用于辨识这样的植物，无论是作为一个点还是位于用于限定此类植物的特征范围的任 一端或两端。
[0101] 本领域技术人员根据本公开内容会想到，检测试剂盒的优选实施方案例如可以包 括针对和/或包含"接点序列"或"过渡序列"（棉花基因组侧翼序列在此处与插入序列相 接）的探针和/或引物。例如，这包括被设计用于鉴定一个或全部两个接点序列（插入物 在此处与侧翼序列相接）的多核苷酸探针、引物、和/或扩增子。一种常见的设计是，一个 引物与侧翼区杂交，一个引物与插入物杂交。这些引物的长度通常是每个约至少?15个残 基。利用这种设置，可以利用引物生成/扩增可检测的扩增子，该扩增子指示本发明实施方 案的事件的存在。这些引物可用于产生跨越（并包括）如上文所指出的接点序列的扩增子。
[0102] 在侧翼序列中"触地（touching down) "的引物通常不被设计为在超出接点多于大 约1200个碱基之处杂交。因此，典型的侧翼引物将被设计为包括任一链上从插入物起点开 始向侧翼序列中延伸1200个碱基以内的至少15个残基。也就是说，包含来自（或者杂交 于）SEQ ID NO: 1的碱基对2000-3205和/或SEQ ID NO: 2的碱基对1-1049的大小合适的 序列的引物，在本发明实施方案的范围之内。插入物的引物可以类似地设计于插入物上的 任何地方，但SEQ ID NO:3的碱基对1-6368可以非排他性地用于例如此类引物的设计。
[0103] 本领域的技术人员还将会认识到，引物和探针可被设计成在一定范围内的标准杂 交和/或PCR条件下进行杂交，其中引物或探针与示例序列不是完美互补。也就是说，某种 程度的错配或简并是可以容忍的。例如，对于约20个核苷酸的引物，通常一个或两个左右 的核苷酸不需要与相反链结合，如果错配的碱基在内部或者在引物的相对于扩增子的末端 的话。下面提供了各种合适的杂交条件。合成的核苷酸类似物，如肌苷，也可以用在探针中。 肽核酸（PM)探针、以及DNA和RNA探针，也可以使用。重要的是，这些探针和引物能鉴别 (能够唯一地鉴定和区分）本发明实施方案的事件的存在。
[0104] 应当注意的是，PCR扩增可能会出现错误，这可能导致例如轻微的测序错误。也就 是说，除非另有说明，本文中所列出的序列是通过从棉花基因组DNA生成长扩增子，然后对 扩增子进行克隆和测序而确定的。这种方式产生和确定的多个序列中发现细微的不同和 次要的差异并非罕事，考虑到需要多轮扩增才能从基因组DNA产生足够的用于测序的扩增 子。本领域的技术人员应当会意识到并且注意到，由于这些类型的常见测序错误或差异而 需要进行的任何调整都在本发明实施方案的范围之内。
[0105] 还应当注意，某些基因组序列被删除并不罕见，例如当创建事件的过程中插入某 一序列时。因此，本主题侧翼序列与例如GENBANK中列出的基因组序列之间也可能出现一 些差异。
[0106] 附图中列举了 DNA序列"插入物"的组分，并在下面的实施例中进行了更详细的讨 论。这些组分或其片段的DNA多核苷酸序列可以用作本发明实施方案的方法的DNA引物或 探针。
[0107] 在本发明的一些实施方案中，提供了用于检测植物和种子等中来自棉花植物的转 基因/基因组插入区的存在的组合物和方法。提供了这样的DNA序列，它们包括本文中提 供的主题5'转基因/基因组插入区域接点序列（SEQ ID NO: 1的碱基对2885/2886之间）、 其区段、和示例序列和其任意区段的互补物。提供了这样的DNA序列，其包括本文中提供的 主题3'转基因/基因组插入区域接点序列（SEQ ID NO:2的碱基对147/148之间）、、其区 段、和示例序列和其任意区段的互补物。插入区接点序列跨越下述二者之间的接点：插入到 基因组中的异源DNA，和来自棉花细胞的位于插入位点侧翼的DNA。这些序列可能能够鉴别 给定的事件。
[0108] 根据这些插入物和边界序列，可以生成事件特异性的引物。PCR分析表明，可以通 过分析用这些事件特异性的引物组所产生的PCR扩增子，可以在不同棉花基因型中鉴定出 本发明实施方案的棉花品系。这些和其他相关程序可用于唯一地鉴定这些棉花品系。因此， 从这样的引物对衍生的PCR扩增子是唯一的，并可用于鉴定这些棉花品系。
[0109] 在一些实施方案中，包含新的转基因/基因组插入区域的毗邻片段的DNA序列是 本发明的一个方面。包括这样的DNA序列，其包含一段足够长度的转基因插入序列的多核 苷酸和一段足够长度的来自一个或多个前述棉花植物的棉花基因组序列的多核苷酸，和/ 或这样的序列，它们可用作引物序列，用来产生能鉴别一种或多种这些棉花植物的扩增子 产物。
[0110] 相关实施方案涉及如下的DNA序列，其包含在本文中鉴定的DNA序列的转基因部 分（例如 SEQ ID NO: 1 及其区段）的至少 10,11，12,13,14,15,16,17,18,19, 20, 21，22, 23， 24, 25或更多个毗邻核苷酸，或其互补物，和类似长度的来自这些序列的侧翼棉花DNA序 列，或其互补物。这些序列可以在DNA扩增方法中用作DNA引物。使用这些引物产生的扩 增子能鉴别本文中提到的任何棉花事件。因此，本发明的实施方案还包括由这样的DNA引 物产生的扩增子。
[0111] 本发明的实施方案还包括用于检测样品中对应于本文中提到的棉花事件的DNA 的存在的方法。这些方法可以包括：（a)使包含DNA的样品与引物组接触，该引物组当被用 于在使用来自这些棉花事件中的至少一个的DNA进行的核酸扩增反应中时，产生能鉴别该 事件的扩增子；(b)进行核酸扩增反应，从而产生扩增子；和（c)检测该扩增子。
[0112] 本发明实施方案进一步的检测方法包括检测样品中对应于所述事件的DNA的存 在的方法，其中所述方法包括：(a)使包含DNA的样品与探针接触，该探针在严格杂交条件 下会与来自所述棉花事件的DNA杂交，并且在严格杂交条件下不会与对照棉花植物（非感 兴趣的事件DNA)杂交；(b)将该样品和该探针置于严格的杂交条件下；和（c)检测该探针 与所述DNA的杂交。
[0113] 在更进一步的实施方案中，本发明包括产生包含本发明的一个实施方案的棉花事 件PDAB4468. 18. 07. 1的棉花植物的方法，其中所述方法包括如下的步骤：（a)将第一亲本 棉花品系（包含本发明的一个实施方案的表达盒，该表达盒赋予所述品系的植物对2, 4-D 和草胺膦的耐受性）和第二亲本棉花品系（其缺少上述除草剂耐受性性状）有性杂交，从 而产生多个后代植物；和（b)通过使用分子标志物对所述后代植物进行选择。这些方法可 以任选地包括使所述后代植物与第二亲本棉花品系回交，从而产生包含抗除草剂性状的纯 育（true-breeding)棉花植物的额外步骤。
[0114] 根据本发明的另一个方面，提供了用于确定与所述事件的杂交的后代的合子型 (zygosity)的方法。所述方法可以包括使包含棉花DNA的样品与本发明实施方案的引物组 接触。所述的引物当被用于与来自所述棉花事件的基因组DNA进行核酸扩增反应时，可产 生能鉴别所述棉花事件的第一扩增子。这些方法进一步包括进行核酸扩增反应，从而产生 所述第一扩增子；检测所述第一扩增子；和使包含棉花DNA的样品与第二引物组接触（所 述第二引物组当被用于与来自棉花植物的基因组DNA进行核酸扩增反应时，可产生第二 扩增子，该第二扩增子含有天然棉花基因组的内源序列，且不含有所述事件的多核苷酸序 列）；和进行核酸扩增反应，从而产生所述第二扩增子。该方法还包括检测第二扩增子，并 比较样品中的第一和第二扩增子，其中两个扩增子的存在表明转基因插入的合子型。
[0115] 可以使用本文公开的组合物和DNA检测领域公知的方法开发DNA检测试剂盒。该 试剂盒可用于鉴定样品中的主题棉花事件，并可应用于含有该DNA的棉花植物的育种方 法。该试剂盒含有与例如本文所公开的扩增子互补的DNA序列，或者含有与和主题事件的 转基因遗传元件中所含有的DNA互补的DNA序列互补的DNA序列。这些DNA序列可以用于 DNA扩增反应或者作为DNA杂交方法中的探针。该试剂盒还可以含有实施该检测方法必需 的试剂和材料。
[0116] "探针"是一种分离的核酸分子，其附接有常规的可检测标记物或报告分子（例如 放射性同位素、配体、化学发光剂或酶）。这种探针能够与靶核酸的链杂交，在本发明实施 方案的情况下，能够与来自所述棉花事件之一（不管是来自棉花植物还是来自含有该事件 DNA的样品）的基因组DNA的链杂交。根据本发明实施方案的探针不仅包括脱氧核糖核酸 或核糖核酸，还包括特异结合靶DNA序列并能够用于检测该靶DNA序列之存在的聚酰胺和 其它探针材料。
[0117] "引物"是分离的/合成的核酸，其通过核酸杂交与靶DNA链退火，从而形成引物和 靶DNA链之间的杂交体，然后在聚合酶，例如DNA聚合酶的作用下沿着靶DNA链延伸。本发 明实施方案的引物对，是指它们用于扩增靶核酸序列，例如通过聚合酶链式反应（PCR)或 其它常规的核酸扩增方法对扩增靶核酸序列的用途。
[0118] 探针和引物的长度通常为 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11，12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21，2 2, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31，32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41，42, 43, 44, 45, 46, 47， 48, 49, 50, 51，52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61，62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71，72, 73 ，74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81，82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91，92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 9 9, 100, 101，102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111，112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 ，119, 120, 121，122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131，132, 133, 134, 135, 136, 137， 138, 139, 140, 141，142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151，152, 153, 154, 155, 156, 1 57, 158, 159, 160, 161，162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171，172, 173, 174, 175, 17 6, 177, 178, 179, 180, 181，182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191，192, 193, 194, 195 ，196, 197, 198, 199, 200, 201，202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211，212, 213, 214， 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221，222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231，232, 233, 2 34, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241，242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251，252, 25 3, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261，262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271，272 ，273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281，282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291， 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301，302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 3 11，312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321，322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 33 0, 331，332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341，342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349 ，350, 351，352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361，362, 363, 364, 365, 366, 367, 368， 369, 370, 371，372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381，382, 383, 384, 385, 386, 387, 3 88, 389, 390, 391，392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401，402, 403, 404, 405, 406, 40 7, 408, 409, 410, 411，412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421，422, 423, 424, 425, 426 ，427, 428, 429, 430, 431，432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441，442, 443, 444, 445， 446, 447, 448, 449, 450, 451，452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461，462, 463, 464, 4 65, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 48 4,485,486,487,488,489,490,491,492,493,494,495,496,497,498,499,500,或 1000,或 2000,或5000个多核苷酸或者更长。这些探针和引物在严格杂交条件下特异性杂交于靶序 列。优选地，根据本发明实施方案的探针和引物与靶序列具有完全的序列相似性，尽管通过 常规方法也可以设计出与靶序列不同但保持与靶序列杂交的能力的探针。
[0119] 用于制备和使用探针和引物的方法在例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版，第 1-3 卷，Sambrook 等编辑，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.，1989中有描述。PCR引物对可以使用例如用于该目的的 计算机程序从已知的序列产生。
[0120] 基于本文中公开的侧翼DNA和插入序列的引物和探针可用于通过常规方法确认 (并且，如果需要的话，修正）公开的序列，例如，通过对这些序列进行重克隆和测序。
[0121] 本发明实施方案的核酸探针和引物在严格条件下与靶DNA序列杂交。任何常规的 核酸杂交或扩增方法均可用于鉴定样品中来自转基因事件的DNA的存在。在特定情况下， 核酸分子或其片段能够与其他的核酸分子特异性杂交。如本文所使用的，如果两个分子能 够形成反平行的双链核酸结构，则可以说这两个核酸分子能够彼此特异性杂交。如果两个 核酸分子显示出完全的互补性，则称一个核酸分子是另一个核酸分子的"互补物"。如本文 所使用的，当一个分子的每一个核苷酸都与另一个分子的核苷酸互补时，则可以说分子表 现出"完全互补性"。显示完全互补性的分子通常会以足够的稳定性彼此杂交，稳定性足以 允许它们在常规的"高严格性"条件下保持彼此退火。常规的高严格性条件如Sambrook et al.，1989 所述。
[0122] 如果两个分子能够彼此杂交并且在至少常规的"低严格性"条件具有足够的稳定 性以允许它们保持彼此退火，则称两个分子显示"最小互补性"。常规的低严格性条件如 Sambrook et al.，1989所述。核酸分子只需要表现出序列的最小互补性，以便能够在所用 的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构，就能够用作引物或探针。
[0123] 术语"严格条件"或"严格性条件"是关于核酸探针与靶核酸杂交（即，与感兴趣 的特定核酸序列杂交）的功能性定义，该杂交通过Sambrook et al.，1989在9. 52-9. 55中 讨论的特定杂交程序实施。另外见Sambrook et al.，1989的9. 47-9. 52和9. 56-9. 58。
[0124] 取决于预期的应用，可以使用不同条件的严格条件或探针或引物的多核苷酸序列 简并性，以实现对靶序列不同程度的杂交选择性。对于要求高选择性的应用，通常会采用相 对严格的条件来杂交一个多核苷酸序列与第二个多核苷酸序列，例如，会选择相对低盐和/ 或高温条件，例如大约〇. 02M-大约0. 15M NaCl和大约50°C -大约70°C的温度。严格条件， 例如，可能涉及用高严格性清洗缓冲液（0. 2 X SSC，0. 1% SDS，65°C )至少清洗杂交滤膜两 次。促进DNA杂交的合适严格条件，例如，6. OX柠檬酸钠/氯化铵（SSC)，大约45°C，随后 用50°C的2. OXSSC清洗，是本领域技术人员已知的。例如，在清洗步骤中的盐浓度可以从约 2. OX SSC，50°C的低严格性到大约0. 2X SSC，50°C的高严格性中进行选择。另外，清洗步骤 中的温度可以从低严格条件的室温、大约约22°C增加到高严格条件的大约65°C。可以变化 温度和盐二者，或者可以保持温度或盐浓度恒定，而改变另一个变量。这种选择条件可容忍 探针与模板或靶链之间的很小的（如果有的话）错配。通过杂交检测DNA序列是本领域技 术人员众所周知的，美国专利Nos. 4, 965, 188和5, 176, 995的教导是杂交分析方法的实例。
[0125] 在一个特别优选的实施方案中，本发明一个实施方案的核酸会在高严格度条件下 与一个或多个本文举例或建议的引物（或扩增子或其他序列），包括其互补物或片段，特异 性杂交。在本发明的一个方面中，本发明一个实施方案的标志物核酸分子具有本文在一个 或多个示例序列中表示的核酸序列，或其互补物和/或片段。
[0126] 在本发明的另一个方面中，本发明一个实施方案的标志物核酸分子与这样的核酸 序列具有80% -100%或90%和100%的序列同一性。在本发明进一步的方面中，本发明一 个实施方案的标记核酸分子与这样的序列具有95% -100%的序列同一'丨生。这样的序列可 以在植物育种方法中用作标志物，以鉴定遗传杂交的后代。探针与靶DNA分子的杂交可以 通过本领域技术人员已知的许多方法中的任一种进行检测；包括但不限于，荧光标签、放射 性标签、基于抗体的标签和化学发光标签。
[0127] 关于使用特定扩增引物对的靶核酸序列的扩增（例如通过PCR)，"严格条件"是允 许引物对仅与这样的靶核酸序列杂交的条件：具有相应野生型序列（或其互补物）的引物 会与该靶核酸序列结合，并优选地产生独特的扩增产物--扩增子。
[0128] 术语"对…（靶序列）特异性"是指，探针或引物在严格杂交条件下仅与包含靶序 列的样品中的靶序列杂交。
[0129] 如本文中所使用的，"扩增的DNA"或"扩增子"是指，作为核酸模板一部分的靶核酸 序列的核酸扩增产物。例如，为了确定由于有性杂交而产生的棉花植物是否含有来自本发 明实施方案的棉花植物的转基因事件基因组DNA，可以对从棉花植物组织样品提取的DNA 进行核酸扩增方法，其使用的引物对包括来自植物基因组中与所插入异源DNA的插入位点 相邻的侧翼序列的引物，和来自所插入异源DNA的第二引物，从而产生能鉴别该事件DNA的 存在的扩增子。扩增子的长度及其具有的序列也能鉴别该事件。扩增子的长度可以改变， 从长度等于引物对的总长加一个核苷酸碱基对，到长度等于引物对的总长加上大约2, 3, 4， 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11，12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21，22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31，3 2, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41，42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51，52, 53, 54, 55, 56, 57， 58, 59, 60, 61，62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71，72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81，82, 83 ，84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91，92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101，102, 103, 104, 105, 106， 107, 108, 109, 110, 111，112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121，122, 123, 124, 125, I 26, 127, 128, 129, 130, 131，132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141，142, 143, 144, 14 5, 146, 147, 148, 149, 150, 151，152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161，162, 163, 164 ，165, 166, 167, 168, 169, 170, 171，172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181，182, 183， 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191，192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201，202, 2 03, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211，212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221，22 2, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231，232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241 ，242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251，252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260， 261，262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271，272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 2 80, 281，282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291，292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 29 9, 300, 301，302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311，312, 313, 314, 315, 316, 317, 318 ，319, 320, 321，322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331，332, 333, 334, 335, 336, 337， 338, 339, 340, 341，342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351，352, 353, 354, 355, 356, 3 57, 358, 359, 360, 361，362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371，372, 373, 374, 375, 37 6, 377, 378, 379, 380, 381，382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391，392, 393, 394, 395 ，396, 397, 398, 399, 400, 401，402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411，412, 413, 414， 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421，422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431，432, 433, 4 34, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441，442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451，452, 45 3, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461，462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471，472 ，473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481，482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491， 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, or 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000 或更多个核 苷酸碱基对（加上或减去任意上述列举的增量）。或者，引物对可以来自于插入DNA两侧的 侧翼序列，从而产生一个包含整个插入核苷酸序列的扩增子。从植物基因组序列衍生的引 物对的成员可能位于与插入的DNA序列有一定距离之处。这个距离的范围可以从1个核苷 酸碱基对到大约两万个核苷酸碱基对。使用的"扩增子"一词，明确排除可能在DNA热扩增 反应中形成的引物二聚体。
[0130] 核酸扩增可以通过任何本领域已知的各种核酸扩增方法实现，包括聚合酶链反 应（PCR)。多种扩增方法是本领域已知的，并且特别在美国专利No. 4683195和美国专利 No. 4, 683, 202中有描述。PCR扩增方法已经被发展用来扩增高达22kb的基因组DNA。这些 方法以及DNA扩增领域中已知的其它方法可用于本发明实施方案的实施。来自主题棉花事 件的异源转基因DNA插入物的序列或侧翼基因组序列可以如下进行验证（以及，如果有必 要，校正）：使用从本文提供的序列衍生的引物从该事件扩增此类序列，随后对PCR扩增子 或克隆的DNA进彳丁标准DNA测序。
[0131] 通过这些方法产生的扩增子可以通过多种技术来检测。琼脂糖凝胶电泳和溴化 乙锭染色是检测DNA扩增子的公知方法。另一种这样的方法是遗传位分析（Genetic Bit Analysis)，其中设计一个与相邻的侧翼基因组DNA序列和插入的DNA序列均重叠的DNA寡 核苷酸。将该寡核苷酸固定在微孔板的孔中。对感兴趣的区域进行PCR(使用插入序列中 的一个引物和相邻侧翼基因组序列中的一个引物）之后，单链PCR产物可以和该固定的寡 核苷酸杂交，并作为模板，使用DNA聚合酶和特异针对所预期的下一个碱基的标记ddNTP进 行单碱基延伸反应。通过对荧光信号的量进行定量，可以完成对结合产物的分析。荧光信 号指示由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸造成的插入/侧翼序列的存在。
[0132] 另一种方法是焦磷酸测序技术，如 Winge(Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000) 所述。在该方法中，设计与相邻的基因组DNA和插入DNA的接点重叠的寡核苷酸。该寡核 苷酸被设计成与来自感兴趣的区域的单链PCR产物杂交（一个引物位于插入序列中，一个 引物位于侧翼基因组序列中），并在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷 酸酶（apyrase)、腺苷5'磷酰硫酸和荧光素的存在下进行温育。分别添加dNTP，掺入导致 光信号，光信号被测量。光信号指示由于成功的扩增、杂交和单或多碱基延伸造成的转基因 插入/侧翼序列的存在。
[0133] 荧光偏振是另一种可用于检测本发明的实施方案的扩增子的方法。根据这种方 法，设计成与基因组侧翼和插入DNA接点重叠的寡核苷酸。该寡核苷酸与来自感兴趣的区 域的单链PCR产物杂交（一个引物位于插入DNA中，一个引物位于侧翼基因组序列中），并 在DNA聚合酶和荧光标记的ddNTP的存在下进行温育。单碱基延伸导致ddNTP的掺入。荧 光标记的ddNTP的掺入可以作为偏振变化用荧光仪加以测量。偏振的变化指示由于成功的 扩增、杂交、和单碱基延伸造成的转基因插入/侧翼序列的存在。
[0134] TaqMan? (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.)是检测和定量DNA序 列的存在的方法。简要地说，设计与基因组侧翼和插入DNA接点重叠的FRET寡核苷酸探针。 将FRET探针和PCR引物（一个引物位于插入DNA序列中，一个位于侧翼基因组序列中）在 热稳定的聚合酶和dNTP的存在下循环。在特定的扩增期间，Taq DNA聚合酶的校对机构从 FRET探针的淬灭部分上释放出荧光部分。荧光信号指示由于成功的扩增和杂交造成的侧翼 /转基因插入序列的存在。
[0135] 分子信标（Molecular Beacon)已经被描述用于多核苷酸序列的检测。简要地说， 设计与侧翼基因组和插入DNA接点重叠的FRET寡核苷酸探针。FRET探针的独特结构导致 其含有二级结构，该二级结构保持荧光部分和淬灭部分紧密接近。将FRET探针和PCR引物 (一个引物位于插入DNA序列中，一个位于侧翼基因组序列中）在热稳定的聚合酶和dNTP 的存在下进行循环。在成功的PCR扩增之后，FRET探针与靶序列的杂交导致探针二级结构 的除去和荧光部分和淬灭部分在空间上的分离。结果产生荧光信号。荧光信号指示由于成 功的扩增和杂交造成的侧翼基因组/转基因插入序列的存在。
[0136] 在公开了棉花基因组中的一个非常适于插入的位置的基础上，本发明的实施方案 还包括在该基因组位置附近的区域内含有至少一个非棉花事件PDAB4468. 18. 07. 1插入物 的棉花种子和/或棉花植物。一个选择是用其他不同的插入物代替来自本文例举的棉花事 件PDAB4468. 18.07. 1的插入物。一般情况下，在特定的实施方案中采用，例如，靶向同源 重组。此类技术是，例如，WO 03/080809A2及相应公布的美国申请（US20030232410)的主 题。因此，本发明的实施方案包括如下的植物和植物细胞，其含有异源插入物（代替或连同 aad-12或pat基因的多个拷贝），异源插入物的两侧是本文所鉴定的全部侧翼序列的或可 识别的部分（SEQ ID NO: 1 的 bp 1-2885 和 SEQ ID NO: 2 的 bp 148-1049)。aad-12 或 pat 基因的一个额外拷贝（或多个额外拷贝）也可以通过这种/这些方式作为插入用的靶标。
[0137] 下面的实施例被包括用于举例说明用于实施本发明实施方案的程序，和证明本发 明的某些优选实施方案。这些实施例不应被理解为具有限制意义。本领域的技术人员应当 意识到，下面实施例中公开的技术只是代表用于例证其实践的优选模式的特定方法。然而， 本领域的技术人员应当，根据本公开，认识到，在不背离本发明精神和范围的前提下，可以 对这些具体实施方案进行许多变化，而仍然能够获得相同或类似的结果。除非另有说明，否 则所有的百分比都是按重量计，所有溶剂混合物的比例均为体积比。
[0138] 下面的实施例被包括用于举例说明用于实施本发明实施方案的程序，和证明本发 明的某些优选实施方案。这些实施例不应被理解为具有限制意义。本领域的技术人员应当 意识到，下面实施例中公开的技术只是代表用于例证其实践的优选模式的特定方法。然而， 本领域的技术人员应当，根据本公开，认识到，在不背离本发明精神和范围的前提下，可以 对这些具体实施方案进行许多变化，而仍然能够获得相同或类似的结果。除非另有说明，否 则所有的百分比都是按重量计，所有溶剂混合物的比例均为体积比。
[0139] 除非另有说明，使用如下的缩写。
[0140] bp 碱基对
[0141] V 摄氏度
[0142] DNA 脱氧核糖核酸
[0143] EDTA 乙二胺四乙酸
[0144] kb 千碱基
[0145] u g 微克
[0146] u L 微升
[0147] mL 毫升
[0148] M 摩尔量（molar mass)
[0149] PCR 聚合酶链式反应
[0150] PTU 植物转录单元或表达盒
[0151] SDS 十_烧基硫酸纳
[0152] SSC 含有氯化钠和柠檬酸钠混合物的缓冲溶液，pH 7. 0
[0153] TBE 含有Tirs碱、硼酸和EDTA混合物的缓冲溶液，pH 8. 3 实施例
[0154] 实施例I :aad_12和Dat棉花事件DDAB4468. 18. 07. 1的转化和筛诜
[0155] 通过土壤杆菌介导的转化、并使用含有草胺膦的培养基进行选择，产生含有棉 花事件pDAB4468. 18. 07. 1的转基因棉花（陆地棉Gossypium hirsutum)。使用去甲 (disarmed) 土壤杆菌菌株EHAlOl (Hood et al.，1993)启动棉花植物品种Coker 310的转 化，上述菌株携带双元载体PDAB4468 (图1)，该载体在T-链DNA区中含有可选择标志物pat 和感兴趣的基因aad-12。pDAB4468的DNA T-链序列在SEQ ID N0:3中示出，且在下面表 1中有注释。
[0156] 表1 :位于pDAB4468上的基因元件
[0157]
【权利要求】
1. 一种分离的DNA序列，包括一个或多个选自下组的序列：SEQ ID N0:1的bp 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2787-2986 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2737-3036 ;SEQ ID NO: 2 的bp 128-167 ;SEQ ID NO: 2 的bp 98-197 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 48-247 ;和 SEQ ID NO:2 的 bp 1-297。
2. -种棉花植物育种方法，包括： 使第一植物与第二棉花植物杂交产生第三棉花植物，所述第一植物包含这样的DNA， 其包含一个或多个选自下组的序列：SEQ ID NO: 1的bp 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1的bp 2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2787-2986 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2737-3036 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 128-167 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 98-197 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 48-247;和 SEQ ID NO: 2 的 bp 1-297,及其互补物；和对所述第三棉花植物测定包含一个或多个选自下组的序列的DNA的 存在：SEQ ID NO: 1 的 bp 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2787-2986 ;SEQ ID N0:1 的bp 2737-3036 ;SEQ ID N0:2 的bp 128-167 ;SEQ ID N0:2 的bp 98-197 ;SEQ ID NO:2 的 bp 48-247 ;和 SEQ ID NO:2 的 bp 1-297,和其互补物。
3. -种分离的DNA分子，其包含接点序列，所述接点序列包含至少一个选自下组的 序列：SEQ ID NO: 1 的 bp 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2787-2986 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2737-3036 ;SEQ ID NO: 2 的bp 128-167 ;SEQ ID NO: 2 的bp 98-197 ;SEQ ID N0:2 的 bp 48-247;和 SEQ ID N0:2 的 bp 1-297,和其互补物。
4. 一种棉花种子，该种子在其基因组中含有选自下组的DNA序列：SEQ ID N0:1的残基 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1 的残基2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的bp 2787-2986 ;SEQ ID NO: 1 的 残基 2737-3036 ;SEQ ID N0:2 的残基 128-167 ;SEQ ID N0:2 的残基 98-197 ;SEQ ID N0:2 的残基48-247 ;和SEQ ID NO: 2的残基1-297,和其互补物。
5. -种棉花种子，该种子在其基因组中含有AAD-12/PAT棉花事件pDAB4468. 18. 07. 1， 且其代表性的棉花种子以登录号PTA-12456保藏在美国典型培养物保藏中心。
6. -种通过种植权利要求4或权利要求5的种子产生的棉花植物。
7. -种由权利要求6的植物产生的棉花种子，其中所述种子在其基因组中含有 AAD-12/PAT棉花事件pDAB4468. 18. 07. 1，该事件也存在于以登录号PTA-12456保藏在美国 典型培养物保藏中心的棉花种子中。
8. -种权利要求6的棉花植物的部分，其中所述部分选自下组：花粉、胚珠、花、棉铃、 芽、根和叶，并且所述部分包含所述事件。
9. 一种从权利要求6的棉花植物或权利要求8的部分衍生的组合物，其中所述组合物 是选自下组的商业产品：棉柏、棉纤维和棉籽油。
10. 权利要求6的植物的后代棉花植物，其中所述植物对苯氧基乙酸、吡啶氧基乙酸和 草胺膦除草剂显示耐受性，并且所述耐受性是由于在所述事件或所述基因组中编码的蛋白 质的表达导致的。
11. 权利要求6的棉花植物，其中所述棉花植物包含与SEQ ID N0:17的残基 2, 886-9, 253具有至少95 %序列同一性的DNA序列。
12. -种棉花种子，其包含含有与SEQ ID NO: 17具有至少95%的序列同一性的DNA序 列的基因组。
13. 通过种植权利要求12的种子产生的植物。
14. 一种包含棉花事件pDAB4468. 18. 07. 1的转基因棉花植物或其部分，其中包含棉花 事件PDAB4468. 18.07. 1的代表性棉花种子已被保藏在美国典型培养物保藏中心，登录号 为 PTA-12456。
15. -种控制棉花作物中的杂草的方法，包括向棉花作物施用苯氧乙酸除草剂，所述棉 花作物包括含有如下所述DNA的棉花植物，该DNA包含选自下组的序列：SEQ ID NO: 1的bp 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2787-2986 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2737-3036 ;SEQ ID NO: 2 的bp 128-167 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 98-197 ;SEQ ID NO: 2 的bp 48-247 ;和 SEQ ID NO:2 的 bp 1-297。
16. 权利要求15的方法，其中所述苯氧乙酸除草剂是2, 4-D。
17. 权利要求15的方法，其中所述苯氧乙酸除草剂是MCPA。
18. -种控制棉花作物中的杂草的方法，包括向棉花作物施用吡啶氧基乙酸除草剂，所 述棉花作物包括含有如下DNA的棉花植物，该DNA包含选自下组的序列：SEQ ID NO: 1的bp 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1 的bp 2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的bp 2787-2986 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2737-3036;SEQ ID N0:2 的bp 128-167;SEQ ID N0:2 的bp 98-197;SEQ ID N0:2 的bp 48-247 ;和 SEQ ID NO:2 的 bp 1-297。
19. 权利要求18的方法，其中所述吡啶氧基乙酸除草剂是绿草定。
20. 权利要求18的方法，其中所述吡啶氧基乙酸除草剂是氟草烟。
21. -种控制棉花作物中的杂草的方法，包括向棉花作物施用草胺膦除草剂，所述棉 花作物包括含有如下DNA的棉花植物，该DNA包含选自下组的序列：SEQ ID NO: 1的bp 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2787-2986 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2737-3036;SEQ ID N0:2 的bp 128-167;SEQ ID N0:2 的bp 98-197;SEQ ID N0:2 的bp 48-247 ;和 SEQ ID NO:2 的 bp 1-297。
【文档编号】C12N15/29GK104427862SQ201380016010
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年1月23日 优先权日:2012年1月23日
【发明者】Y·C·崔, R·金, T·M·凯泽, A·E·鲁宾逊, D·佩尔迪, S·G·托莱多, L·B·布拉克斯顿, D·M·安德森 申请人:陶氏益农公司