中性pH糖化和发酵的制作方法

专利名称：中性pH糖化和发酵的制作方法
技术领域：
能够在5. 0-8. 0范围内的pH下有效水解淀粉底物的葡糖淀粉酶可用于同时糖化发酵(SSF)以生产终产品。
背景技术：
工业发酵主要利用糖作为原料来生产多种蛋白质、酶、醇和其他化工终产品。通常，葡萄糖是淀粉加工的产品，淀粉加工在常规上是催化淀粉降解的、涉及液化和糖化的两步酶促过程。在液化过程中，不溶性颗粒淀粉在水中调成浆液，经加热糊化，并被热稳定性a -淀粉酶水解。在糖化过程中，液化中产生的可溶性糊精进一步被葡糖淀粉酶水解，产生含有95%以上的葡萄糖的高葡萄糖糖浆。葡糖淀粉酶属外切作用糖酶，能够水解淀粉(例如直链淀粉和支链淀粉)的直链和支链糖苷键。在商业上，葡糖淀粉酶通常在酸性PH范围(小于5.0的pH)内使用，以从经酶液化的淀粉底物产生可发酵糖。可发酵糖，例如低分子量糖如葡萄糖，然后可通过其他酶(例如葡萄糖异构酶)转化为果糖；可进行结晶；或者可用于发酵以生产各种各样的终产品(例如醇、谷氨酸一钠、琥珀酸、维生素、氨基酸、1，3-丙二醇和乳酸)。一种将(I)糖化和(2)发酵组合在一起的系统被称为同时糖化发酵(SSF)。SSF取代经典的双步骤发酵，即首先生产可发酵糖，然后进行生产终产品的发酵过程。在SSF中，可将接种物随同淀粉水解酶一起加入，以并行地糖化淀粉底物和将糖化产物(即可发酵糖)转化为期望的终产品。接种物通常是能够产生终产品的微生物。SSF的好处包括但不限于以下I)通过提供连续的葡萄糖进料促进持续的微生物生长；2)通过降低渗透胁迫改善碳转化效率；3)通过容纳更高的干物质提升发酵能力；以及4)由于逆反应产物和非可发酵糖的生成减少而提升终产品产量和有利于下游加工。在小反应器体积中存在高浓度底物的情况中，SSF尤其有前景。参见例如John等人，《生物技术进展》(Biotechnol. Adv.)，第27卷，第145-152页，2009年。仍需要通过选择对糖化和发酵都最适合的条件例如温度、pH、酶等来优化SSF。例如，在使用谷物作为原料生产燃料醇的过程中，酵母发酵的PH与糖化的葡糖淀粉酶活性匹配。尤其对于最适在PH6.0以上进行的发酵而言，这个需要是明显的。大多数商业糖化酶类例如黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶(AnGA)仅在4. 2-5. 5的pH范围内表现出显著的糖化酶活性。葡糖淀粉酶在6. O以上的发酵pH下表现出显著降低的活性。当发酵和糖化的最适条件不一致时，采用了额外的步骤如预处理或预糖化来产生发酵原料。例如，如在WO 2003/066816中公开，使浆液在65°C下经历巴氏灭菌14小时，然后在34°C下进行SSF以生产1，3_丙二醇。类似地，可使产乳酸微生物在酸性pH下经历四十至五十次系列转移，然后应用于SSF以生产乳酸。参见WO 2003/095659。

发明内容
诸如灰腐质霉(Humicola grisea)葡糖淀粉酶(HgGA)、里氏木霉(Trichodermareesei)葡糖淀粉酶(TrGA)和米根霉/得氏根霉(Rhizopus oryzae/niveus.)葡糖淀粉酶(RhGA)的葡糖淀粉酶(GA)表现出与其他已知的葡糖淀粉酶不同的pH谱(pH profile),所述已知的葡糖淀粉酶例如来自黑曲霉(Aspergillus niger)的葡糖淀粉酶(AnGA)和来自埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)的葡糖淀粉酶(TeGA)。在6. 0或6. 0以上的pH下，HgGA和TrGA均相对于分别在pH4. 25或pH3. 75下的最大活性保持至少50%的活性。HgGA和TrGA均能够在5. 0-8. 0范围内的pH下有效糖化淀粉底物。这个性质使得HgGA和TrGA能够用于同时糖化发酵(SSF)以从淀粉底物生产终产品。本发明设想的实施方案提供了在pH5. 0-8. 0下处理淀粉产生可发酵糖的方法。可发酵糖是通过在这样的葡糖淀粉酶的存在下糖化淀粉底物产生的，该葡糖淀粉酶在PH6. 0或6. 0以上相对于其最大活性具有至少50%活性。糖化可在6. 0-7. 5或者任选地7. 0-7. 5范围内的pH下进行。糖化是在约300C至约600C或者任选地约30°C至约40°C范围内的温度下进行。在一个方面,淀粉底物来自玉米、小麦、黑麦、大麦、高粱、木薯(cassava)、木薯(capioca)、马铃薯以及它们的任何组合。在另一个方面，淀粉底物是颗粒淀粉或液化淀粉。在又一个方面，淀粉底物为约15% -50%、约15% -30%或约15% -25%干物质(DS)。在一个实施方 案中，该方法还包括在与进行糖化相同的pH下将可发酵糖发酵成终产品。终产品可选自甲醇、乙醇、丁醇、谷氨酸一钠、琥珀酸、1，3_丙二醇、维生素、氨基酸和乳酸。任选地，终产品为乙醇、1，3_丙二醇或琥珀酸。在另一个实施方案中，糖化和发酵作为同时糖化发酵(SSF)过程来进行，该过程通常在pH6. 5-7. 5下进行。在一个方面,葡糖淀粉酶选自包含SEQ ID NO :3的灰腐质霉(Humicola grisea)葡糖淀粉酶(HgGA)、包含SEQ ID NO :6的里氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶(TrGA)、包含SEQ ID NO : 9的根霉(Rhizopus p.)葡糖淀粉酶(RhGA)以及它们的变体。变体与亲本葡糖淀粉酶具有至少99%序列同一性。任选地，变体与亲本葡糖淀粉酶相比具有一个氨基酸修饰。在另一个方面，HgGA为SEQ ID NO :3，且任选地从里氏木霉(Trichodermareesei)宿主细胞产生。在又一个方面，TrGA为SEQ ID No :6。在又另一个方面，RhGA为SEQ ID NO:9。在一个实施方案中，葡糖淀粉酶以约0.1至约2. O、约0.2至约1.0或者0.5至1. OGAU/克干物质淀粉的范围加入。在另一个实施方案中，糖化还包括加入a-淀粉酶。a-淀粉酶为来自芽孢杆菌属(Bacillus)的物种，或为其变体。a-淀粉酶为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) a -淀粉酶(AmyE)、解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ct-淀粉酶、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) a -淀粉酶、脂肪嗜热芽孢杆菌(Bacillus stearothermophi lus) a-淀粉酶或其变体。在另一个实施方案中，本发明提供加工淀粉的方法，所述方法包括在葡糖淀粉酶和至少一种其他酶存在下在pH5. 0-8. 0下将淀粉底物糖化为可发酵糖，其中所述葡糖淀粉酶在pH6. 0或6. 0以上相对于其最大活性具有至少50%活性，其中所述葡糖淀粉酶选自包含SEQ ID NO 3的灰腐质霉(Humicola grisea)葡糖淀粉酶(HgGA)、包含SEQ ID NO 6的里氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶(TrGA)、包含SEQ ID NO :9的根霉属物种(Rhizopus sp.)葡糖淀粉酶(RhGA)以及它们的变体,其中所述变体与亲本葡糖淀粉酶具有至少99%序列同一性，并且其中所述其他酶选自蛋白酶、支链淀粉酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、环糊精糖基转移酶(glycotransferase)、脂肪酶、植酸酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角质酶、木聚糖酶和a -葡萄糖苷酶。在另一个实施方案中，本发明提供加工淀粉的方法，所述方法包括在葡糖淀粉酶和至少一种其他非淀粉多糖水解酶存在下在pH5. 0-8. 0下将淀粉底物糖化为可发酵糖，其中所述葡糖淀粉酶在PH6. 0或6. 0以上相对于其最大活性具有至少50%活性，其中所述葡糖淀粉酶选自包含SEQ ID NO :3的灰腐质霉(Humicola grisea)葡糖淀粉酶(HgGA)、包含SEQ ID NO 6 的里氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶(TrGA)、包含 SEQ ID NO 9 的根霉属物种(Rhizopus sp.)葡糖淀粉酶(RhGA)以及它们的变体,其中所述变体与亲本葡糖淀粉酶具有至少99%序列同一性，并且其中所述非淀粉多糖水解酶选自纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。


本说明书包括附图，附图提供各个实施方案的非限制性例证。在附图中图1示出32°C下HgGA、TrGA、AnGA和TeGA的pH谱。pH谱是按占实例I中描述的糖化条件下的最大活性的百分比作出。

图2示出在HgGA、TrGA和AnGA催化的48小时糖化反应后高级糖类的存在。糖化反应在实例4中描述。图3示出用HgGA和a -淀粉酶在pH6. 4下处理的玉米、小麦和木薯淀粉的扫描电子显微照片。各淀粉样品是在实例7中描述的条件下由HgGA和a-淀粉酶水解。
具体实施例方式本发明涉及能够在中性pH下(例如在pH5. 0-8. 0之间)有效糖化淀粉底物的葡糖淀粉酶。在6.0或6.0以上的pH下，葡糖淀粉酶相对于最大活性保持至少约50%活性。具有所述不寻常性质的葡糖淀粉酶可包括例如HgGA、TrGA和RhGA。本发明还包括使用该葡糖淀粉酶在中性PH下进行同时糖化发酵(SSF)以生产终产品例如1，3_丙二醇、琥珀酸、赖氨酸、谷氨酸一钠和乳酸的方法。在一些方面，本发明的实施方案依赖于遗传工程和分子生物学领域中使用的常规技术和方法。以下资料包括对可根据本发明使用的一般方法学的描述=Samtoook等人，《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning A Laboratory Manual)(第 2 版，I989 年)；Kreigler,《基因转移和表达实验指南》(Gene Transfer And Expression ；A LaboratoryManual), 1990年；以及Ausubel等人编辑，《分子生物学实验手册》(Current ProtocolsIn Molecular Biology), 1994年。除非本文另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。以下文献给技术人员提供本发明中使用的许多术语的一般词典Singleton等人，《微生物学和分子生物学词典》(Dictionary Of Microbiology And Molecular Biology),第 2 版,约翰威立父子出版公司，纽约(John Wiley and Sons, New York), 1994 年；以及 Hale & Markham,《哈普克林生物学词典》(he Harper Collins Dictionary Of Biology)Harper Perennial 出版社，纽约(Harper Perennial,N. Y.), 1991年。本文描述代表性的方法和材料,不过任何与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料都可用于实施或测试本发明。数值范围包括限定该范围的数值。本文提供的标题并非对各个方面或实施方案的限制，这些方面或实施方案可以通过参阅本说明书全文而获得。1.定义和缩写根据本“具体实施方式
”，应用下面的缩写和定义。应该指出的是，如本文所使用，除非上下文另有明确指明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指代物。因此，例如，提及“酶”则包括多个这种酶。1.1.定义 本文所用的“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况中，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义；在一些情况中，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。本文所用的“核苷酸序列”或“核酸序列”指基因组来源、合成来源或重组来源的序列，且不论代表正义链还是反义链都可以是双链的或单链的。如本文所用，术语“核酸”可以指基因组DNA、cDNA、合成DNA或RNA。核酸的残基可含有本领域中通常已知和使用的任何化学修饰。“分离的”意指该材料至少基本上不含有至少一种与其天然相关且天然存在的其它组分。“纯化的”指该材料处于相对纯的状态，例如至少约90%纯、至少约95%纯、至少约98%纯或者至少约99%纯。“寡糖”意指由3-20个单糖组成的碳水化合物分子。如本文所用，“转化的细胞”包括已通过使用重组DNA技术进行转化的细胞。通常通过向细胞插入一个或多个核苷酸序列而进行转化。所插入的核苷酸序列可以是异源核苷酸序列，即这样的序列，其对于待转化的细胞而言可以是并非天然的，如融合蛋白。本文所用的“淀粉”指任何由植物的复杂多糖碳水化合物构成的材料，由具有式(C6HltlO5)x(其中“X”可以是任何数字)的直链淀粉和支链淀粉构成。具体地讲，该术语指任何基于植物的材料，包括但不限于谷物、草、块茎和根，更具体地讲，指小麦、大麦、玉米、黑麦、稻米、高粱、糠、木薯(cassava)、小米、马铃薯、甘薯和木薯(tapioca)。本文所用的“颗粒淀粉”指未经过糊化的未蒸煮过(生)的淀粉。本文所用的“淀粉糊化”意指使淀粉分子增溶形成粘性悬浮液。本文所用的“糊化温度”指淀粉底物发生糊化时的最低温度。确切温度取决于具体的淀粉底物，还可取决于淀粉得自的植物物种的特定品种和生长条件。
“DE”或“葡萄糖当量”为用于度量总还原糖的浓度的行业标准，计算为已转化为还原糖的总固形物的百分比。尚未被水解的颗粒淀粉的DE为约零(0)，而D-葡萄糖的DE为约 100。本文所用的“淀粉底物”指使用精制淀粉、全磨谷粒或分级谷粒的颗粒淀粉或液化淀粉。本文所用的“液化淀粉”指已经历过增溶处理，例如常规的淀粉液化处理的淀粉。本文所用的“葡萄糖糖浆”指含有葡萄糖固形物的含水组合物。葡萄糖糖浆将具有至少约20的DE。在一些实施例中，葡萄糖糖浆可含有不超过约21%的水，而以葡萄糖计算含有至少约25 %的还原糖。在一个实施例中，葡萄糖糖浆可包含至少约90 %的D-葡萄糖，在另一个实施例中，葡萄糖糖浆可包含至少约95%的D-葡萄糖。在一些实施例中，术语葡萄糖和葡萄糖糖浆可互换使用。“聚合度(DP) ”是指给定糖中脱水吡喃葡萄糖单位的数目(n)。DPl的例子是单糖，如葡萄糖和果糖。DP2的例子是二糖，如麦芽糖和蔗糖。DP4+( > DP4)表示聚合度大于4的聚合物。本文所用的“可发酵糖”指能够在发酵条件下被代谢的糖类。这些糖类通常指葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖(DP1、DP2和DP3)。本文所用的“总糖含量”是指淀粉组合物中存在的总糖含量。本文所用的“ds”是指溶液中溶解的固形物。术语“干物质含量(DS) ”指以干重计浆液的总固体，单位％。术语“浆液”指含有不溶性固体的含水混合物。
`
本文所用的“淀粉液化酶”是指催化颗粒淀粉的水解或分解的酶。示例性的淀粉液化酶包括a -淀粉酶(EC 3. 2.1.1)。“淀粉酶”意指尤其是能够催化淀粉降解的酶。例如￠-淀粉酶、a-葡萄糖苷酶(EC3. 2. 1.20 ； a -D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC3. 2.1. 3 ； a -D-(I — 4)-葡聚糖葡萄糖水解酶)和产物特异性淀粉酶可从淀粉产生特定长度的麦芽寡糖。“a-淀粉酶(EC3. 2.1.1)”是指以随机方式切割淀粉分子内部的a-D-(l —4)0-糖苷键的内切作用酶。相反，外切作用淀粉分解酶如P -淀粉酶(EC3. 2. 1.2 ；a t-D-(l — 4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)和一些产物特异性淀粉酶如产麦芽糖a -淀粉酶(EC3. 2.1. 133)从底物的非还原端切割淀粉分子。这些酶也被描述成在含有l，4_a -连接的D-葡萄糖单位的多糖中实现l，4-a-D-糖苷键的外切水解或内切水解的酶。用于描述这些酶的另一术语是糖原酶。示例性的酶包括a-1，4-葡聚糖4-葡聚糖水解酶。本文所用的“葡糖淀粉酶”是指淀粉葡萄糖苷酶类的酶(EC3. 2.1. 3，葡糖淀粉酶，6 -1,4-D-葡聚糖葡糖水解酶)。这些酶是从直链淀粉和/或支链淀粉分子的非还原端释放葡萄糖残基的外切作用酶。这些酶也能够水解a-l，6和a-1，3键，但是水解速率要比a-1，4键的水解慢得多。本文所用的术语“非淀粉多糖水解酶”是能够水解复合碳水化合物聚合物如纤维素、半纤维素和果胶的酶。例如，纤维素酶(内切和外切葡聚糖酶、￠-葡萄糖苷酶)、半纤维素酶(木聚糖酶)和果胶酶是非淀粉多糖水解酶。本文所用的“最高活性”指在最有利的条件下例如在最佳pH下测量的酶活性。本文所用的“最佳pH”指在其他条件相等的情况下酶表现出最高活性时的pH值。
词语蛋白质或多肽的“成熟形式”指该蛋白质或多肽的最终功能形式。葡糖淀粉酶的成熟形式可例如缺乏信号肽和/或起始甲硫氨酸。葡糖淀粉酶的成熟形式可从其天然宿主例如通过内源表达来产生。或者,葡糖淀粉酶的成熟形式可从其非天然宿主例如通过外源表达来产生。外源表达的葡糖淀粉酶只要保持了葡糖淀粉酶活性，与内源表达的对等物相比可具有改变的糖基化模式。术语“亲本”或“亲本序列”指宿主细胞中天然的或自然存在的序列。本文所用的术语“变体”用来指与亲本葡糖淀粉酶序列具有一定程度的氨基酸序列同一性的葡糖淀粉酶。变体与亲本序列相似，但在其氨基酸序列中具有至少一个使其在序列上与亲本葡糖淀粉酶不同的置换、缺失或插入。在一些情况中，变体经过了操纵和/或工程改造以在其氨基酸序列中包括至少一个使其在序列上与亲本不同的置换、缺失或插入。另外，葡糖淀粉酶变体可保留亲本葡糖淀粉酶的功能特性，例如保持的葡糖淀粉酶活性达亲本葡糖淀粉酶活性的至少约50%、约60%、约70%、约80%或约90%。本文所用的“淀粉的水解”是指通过加入水分子来切割糖苷键。本文所用的“无蒸煮”指不用常规的高温淀粉液化过程，将颗粒淀粉底物例如生淀粉转化为可发酵糖的过程。本文所用的“终产品”或“期望的终产品”指酶和/或微生物将淀粉底物转化成的分子或化合物。本文所用的“接触”或“混合”指将相应的酶设置成与相应的底物充分靠近，使得该酶能够将该底物转化为终产品。本领域技术人员将认识到将酶溶液与相应底物混合可实现接触或混合。1. 2.缩写除非另有指明， 否则应用下述缩写AkAA 白曲霉(Aspergillus kawachii) a -淀粉酶AmyE 枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis) a -淀粉酶AmyL 地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis) a -淀粉酶AmyR SPEZYME XTRA 淀粉酶AmyS 嗜热脂肪地芽抱杆菌(Geobacillus stearothermophi lus) a -淀粉酶AnGA 黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶BAA 细菌a-淀粉酶cDNA 互补 DNADE葡萄糖当量DI 蒸馏的，去离子的DNA 脱氧核糖核酸DP3 具有三个亚单位的聚合度DPn 具有n个亚单位的聚合度DS或ds干物质dss 干物质淀粉EC 进行酶分类的酶学委员会g克
gpm 加仑每分钟GAU 葡糖淀粉酶单位HGA 灰腐质霉(Humicola grisea)葡糖淀粉酶HgGA 灰腐质霉(Humicola grisea)葡糖淀粉酶HPLC 高压液相色谱法kg千克MOPS 3- (N-吗啉代)丙磺酸MT公吨MW 分子量NCBI 美国国家生物技术信息中心nm纳米OD光密度PCR 聚合酶链反应PEG 聚乙二醇pi等 电点ppm 份每一百万份RhGA 根霉属物种(Rhizopus sp.)葡糖淀粉酶RNA 核糖核酸RO 反渗透rpm 转每分钟slpm 标准升每分钟SSF 同时糖化和发酵TeGA 埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)葡糖淀粉酶TrGA 里氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶w/v 重量/体积w/w 重量/重量Wt野生型u L 微升2.淀粉加工中的酶2.1.葡糖淀粉酶2.1.1.结构和功能葡糖淀粉酶由细菌、真菌、酵母和植物的许多菌株(株系)产生。许多真菌葡糖淀粉酶是胞外产生的真菌酶，例如来自以下各属的菌株曲霉属(Aspergillus) (Svensson等人，《嘉士伯研究通讯》(Carlsberg Res. Commun.)，第 48 卷，第 529-544 页，1983 年；Boel等人，《欧洲分子生物学组织杂志》(EMB0 J.)，第3卷，第1097-1102页，1984年；Hayashida等人，《农业生物化学》(Agric. Biol. Chem ，第53卷，第923-929页，1989年；美国专利第5,024,941 号；美国专利第 4,794，175 号和 WO 88/09795);篮状菌属(Talaromyces)(美国专利第4，247，637号；美国专利第6，255，084号；和美国专利第6，620，924号);根霉属(Rhizopus) (Ashikari 等人,《农业生物化学》(Agric. Biol. Chem.)，第 50 卷，第 957-964 页，1986年；Ashikari等人，《应用微生物学和生物技术》(App. Microbio. Biotech.),第32卷，第 129-133 页，1989 年;和美国专利第 4，863，864 号);腐质霉属(Humicola) (WO 05/052148和美国专利第4，618, 579号)；以及毛霉属(Mucor) (Houghton-Larsen等人，《应用微生物学和生物技术》(App1. Microbiol. Biotechnol.)，第 62 卷，第 210-217 页，2003 年)。许多编码这些酶的基因已被克隆并在酵母、真菌和/或者细菌细胞中表达。在商业上，葡糖淀粉酶是非常重要的酶，已被用于许多需要水解淀粉(例如用于从淀粉产生葡萄糖和其他单糖)的应用中。葡糖淀粉酶被用来生产高果糖玉米甜味剂，其占美国甜味剂市场的50%以上。一般而言，葡糖淀粉酶可以并且通常与a-淀粉酶一起在淀粉水解过程中使用，以将淀粉水解成糊精，然后水解成葡萄糖。然后葡萄糖可通过其他酶(例如葡萄糖异构酶)转化为果糖；可进行结晶；或者可用于发酵以生产各种各样的终产品(例如乙醇、柠檬酸、琥珀酸、抗坏血酸中间体、谷氨酸、甘油、1，3-丙二醇和乳酸)。葡糖淀粉酶由多达三个不同的结构域组成，一个是在所有葡糖淀粉酶中结构上保守的、大约450个残基的催化域，通常接着是一个由30-80个残基组成的接头区域，该接头区域连接到一个大约100个残基的淀粉结合域。所有三个区域均完整的里氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶(TrGA)被测定至1. 8埃分辨率。参见WO 2009/048488和TO 2009/048487。采用测得的坐标，将结构与来自之前测定的泡盛曲霉(Aspergillusawamori)X100 的葡糖淀粉 酶的催化域的坐标(Aleshin, A. E. , Hoffman, C. , Firsov,L. M.和Honzatko R. B., “来自泡盛曲霉(Aspergillus awamori) XlOO变种的葡糖淀粉酶的精修晶体结构” (Refined crystal structures of glucoamylase from Aspergillus awamori^!■]100.)，《分子生物学杂志》0^01.8101.)，第238卷，第575-591页，1994年)进行比对。参见同上文献。这两个葡糖淀粉酶的催化域的结构重叠得非常紧密，可以基于这个结构重合来鉴定对等的残基。参见同上文献。还认为所有的葡糖淀粉酶都具有基本的结构。参见同上文献。鉴于各种葡糖淀粉酶的公知的结构和功能关系，已成功产生和表征了具有改变的性质的葡糖淀粉酶变体。所述变体与亲本葡糖淀粉酶相比可表现出改善的性质。改善的性质可包括但不限于提高的热稳定性和提高的比活性。例如，WO 2009/067218中描述了制备和表征具有改变的性质的TrGA变体的方法。2.1. 2.具有期望的PH谱的葡糖淀粉酶本发明的实施方案利用在中性pH下能够有效糖化淀粉底物的葡糖淀粉酶，所述中性 pH 例如在 pH5. 0-8. 0,5. 5-7. 5,6. 0-7. 5,6. 5-7. 5 或 7. 0-7. 5 之间。在 6. 0 或 6. 0 以上的pH下，该葡糖淀粉酶相对于最大活性保持至少约50%、约51 %、约52%、约53%、约54%或约55%的活性。具有期望的pH谱的葡糖淀粉酶包括但不限于灰腐质霉葡糖淀粉酶(HgGA)、里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)和根霉葡糖淀粉酶(RhGA)。HgGA可以是包含SEQ ID NO :3氨基酸序列的葡糖淀粉酶，其在美国专利第4，618，579号和第7，262，041号中详细描述。这个HgGA还被描述为颗粒淀粉水解酶(GSHE)，因为它能够水解颗粒形式的淀粉。编码来自灰腐质霉高温变种(Humicola griseavar. thermoidea)的HgGA的基因组序列以SEQ ID NO :1示出，其含有三个推定的内含子(位置233-307、752-817和950-1006)。来自灰腐质霉高温变种的天然HgGA具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列，其包括含有30个氨基酸残基的信号肽(SEQ ID NO 2的位置1_30)。切割信号肽即得到具有SEQ ID NO :3的氨基酸序列的成熟HgGA。本发明的实施方案还包括从木霉属(Trichoderma)宿主细胞例如里氏木霉细胞产生的HgGA。参见美国专利第7，262，041号。TrGA可以是来自里氏木霉QM6a(ATCC登记号13631)的葡糖淀粉酶。这个TrGA包含SEQ ID NO :6的氨基酸序列，其例如在美国专利第7，413，879号中描述。编码来自里氏木霉QM6a的TrGA的cDNA序列以SEQ ID NO :4示出。该天然TrGA具有SEQ ID NO 5的氨基酸序列，其包括含有33个氨基酸残基的信号肽(SEQ ID NO 4的位置1_33)。参见同上文献。切割信号肽即得到具有SEQ ID NO :6的氨基酸序列的成熟TrGA。参见同上文献。TrGA的催化域以SEQ ID N0:7示出。参见同上文献。本发明的实施方案还包括内源表达的TrGA。参见同上文献。RhGA可以是来自得氏根霉(Rhizopus niveus)或米根霉的葡糖淀粉酶。参见美国专利第4，514，496号和第4，092，434号。来自米根霉的天然RhGA具有SEQ ID NO :8的氨基酸序列，其包括含有25个氨基酸残基的信号肽(SEQ ID NO 8的位置1_25)。切割信号肽即得到具有SEQ ID N0:9的氨基酸序列的成熟RhGA。典型的RhGA可以是商品名为⑶.CONC(新日本化学株式会社，日本)或Ml (Biocon India，印度班加罗尔)的葡糖淀粉酶。本发明的实施方案的葡糖淀粉酶也可以是HgGA、TrGA或RhGA的变体。该变体与亲本葡糖淀粉酶具有至少99%序列同一性。在一些实施方案中，该变体与亲本葡糖淀粉酶具有至少98%、至少97%、至少96%、至少95%、至少94%、至少93%、至少92%、至少91%或至少90%序列同一性。任选地，该变体与亲本葡糖淀粉酶的成熟形式相比具有一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸修饰。任选地，该变体与亲本葡糖淀粉酶的成熟形式相比具有超过六个氨基酸(例如 7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55 或 60个)修饰。该变体在5. 0-8.0范 围内的pH下具有期望的pH谱和糖化淀粉底物的能力。在一些实施方案中，该变体可具有其他改进的性质，如改进的热稳定性和改进的特异性。2.1. 3.葡糖淀粉酶的产生适合于本发明的实施方案的葡糖淀粉酶可用重组DNA技术在各种宿主细胞中产生。在一些实施方案中，宿主细胞选自细菌细胞、真菌细胞、植物细胞和酵母细胞。术语宿主细胞包括用来产生根据本发明的变体葡糖淀粉酶的细胞、所述细胞的子代和从所述细胞产生的原生质体。在一些实施方案中，宿主细胞是真菌细胞，通常是丝状真菌宿主细胞。术语“丝状真菌”指真菌亚门的所有丝状形式(参见Alexopoulos，C.J.，1962年，《真菌学概论》(Introductory Mycology),威利出版社，纽约(Wiley, New York))。这些真菌的特征是其营养菌丝体的细胞壁由几丁质、纤维素和其他复合多糖组成。本发明的丝状真菌在形态学上、生理学上和遗传学上与酵母不同。丝状真菌的营养生长是通过菌丝伸长来进行，并且碳分解代谢是专性好氧的。在本发明的实施方案中，丝状真菌亲本细胞可以是以下各属(但不限于以下各属)的物种的细胞木霉属(Trichoderma)(例如里氏木霉(Trichoderma reesei)(其为之前归类为长梗木霉(T.1ongibrachiatum)的红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的无性形式)、绿色木霉(Trichoderma viride)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)) (Sheir-Neirs 等人，1984年，《应用微生物学和生物技术》(App1. Microbiol. Biotechnol)，第20卷，第46-53页；ATCCNo. 56765 和 ATCC No. 26921);青霉属(Penicillium sp.);腐质霉属(Humicola sp.)(例如特异腐质霉(H.1nsolens)、柔毛腐质霉(H. lanuginosa)和灰腐质霉(H. grisea);金孢子菌属(Chrysosporium sp.)(例如 C.1ucknowense);粘帚霉属(Gliocladium sp.);曲霉属(Aspergillus sp.)(例如米曲霉(A. oryzae)、黑曲霉(A. niger)、酱油曲霉(A sojae)、日本曲霉(A. japonicus)、构巢曲霉(A. nidulans)和泡盛曲霉(A. awamori) (Ward等人,1993年，《应用微生物学和生物技术》(App1. Microbiol. Biotechnol.)，第39卷，第738-743页；以及Goedegebuur等人,2002年，《遗传学》(Genet),第41卷,第89-98页);镰刀菌属(Fusarium sp.)(例如粉红色镰刀菌(F. roseum)、禾谷镰刀菌(F. graminum)、F. cerealis、尖孢镰刀菌(F. oxysporuim)和F. venenatum);脉胞菌属(Neurospora sp.)(粗糙脉胞菌(N. crassa));肉座菌属(Hypocrea sp.);毛霉属(Mucor sp.)(米黑毛霉(M. miehei));根霉属物种(Rhizopus sp.)和裸孢壳属(Emericella sp.)(另参见Innis等人，1985年,《科学》(Sc1.),第 228 卷,第 21-26 页)。术语木霉属(“Trichoderma”或“Trichoderma sp. ”或“Trichoderma spp. ”)指之前或目前被归类为木霉的任何真菌属。在其他实施方案中，宿主细胞将是经遗传工程改造的宿主细胞，其中天然基因已例如通过在真菌细胞中进行缺失而被失活。在期望获得具有一个或多个失活的基因的真菌宿主细胞的情况中，可使用已知的方法(例如美国专利第5，246，853号和第5，475，101号以及WO 92/06209中公开的方法)。可通过完全或部分缺失、通过插入失活或者通过任何其他能使基因对其预定目的而言无功能的手段(使得防止该基因表达功能蛋白)，来实现基因失活。在一些实施方案中，当宿主细胞是木霉属细胞尤其是里氏木霉宿主细胞时，cbhl基因、cbh2基因、egll基因和egl2基因将被失活和/或通常被缺失。代表性地，具有quad缺失蛋白的里氏木霉宿主细胞在美国专利第5，847，276号和WO 05/001036中给出并描述。在其他实施方案中，宿主细胞是蛋白酶缺陷株或蛋白酶欠缺株。为用重组DNA技术产生本发明的实施方案的葡糖淀粉酶，可构建包含编码该指定葡糖淀粉酶的氨基酸序列的核酸的DNA构建体，并例如转移到里氏木霉宿主细胞中。载体可以是任何当被引入到里氏木霉宿主细胞中时能整合到宿主细胞基因组中并能被复制的载体。有关载体名单可参见真菌遗传学原种中心(Fungal Genetics Stock Center,FGSC，〈WWW.fgsc.net>)菌株目录。合适的表达和/或整合载体的另外的例子在以下文献和专利中提供Sambrook等人，1989年，出处同上；Ausubel, 1987年，出处同上；和van denHondel等人，1991年，载于Bennett和Lasure编辑,“真菌中的更多基因操纵”(More GeneManipulations In Fungi),学术出版社(Academic Press),第 396-428 页；以及美国专利第5，874，276号。可将编码葡糖淀粉酶的核酸有效连接到在里氏木霉宿主细胞中显示转录活性的合适启动子。该启动子可衍自编码该宿主细胞的同源或异源蛋白质的基因。启动子的合适的非限制性例子包括cbhl、cbh2、egll、egl2。在一个实施方案中，启动子可以是天然的里氏木霉启动子。通常，启动子可以是里氏木霉cbhl，其是诱导型启动子并已寄存在GenBank中，登记号为D86235。“诱导型启动子”可指在环境调节或发育调节下有活性的启动子。在另一个实施方案中，启动子可以是里氏木霉宿主细胞的异源启动子。有用的启动子的其他例子包括来自泡 盛曲霉和黑曲霉葡糖淀粉酶基因的启动子(参见例如Nunberg等人，1984年，《分子与细胞生物学》(Mol. Cell Biol.)，第4卷，第2306-2315页；和Boel等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》(EMBO J.)，第3卷，第1581-1585页)。另外，里氏木霉xlnl基因和纤维二糖水解酶I基因的启动子也是有用的(EPA 13f280Al)。在一些实施方案中，可将葡糖淀粉酶编码序列有效连接到信号序列。信号序列可以是葡糖淀粉酶的天然信号肽(例如，对于HgGA而言为SEQ ID NO 2的残基1_20 ;对于TrGA而言为SEQ ID NO :5的残基1_33)。或者，信号序列可与天然信号序列具有至少90%或至少95 %序列同一性。在另外的实施方案中，构成待引入到里氏木霉宿主细胞中的DNA构建体或载体的信号序列和启动子序列衍自相同的来源。例如，在一些实施方案中，信号序列可以是有效连接到cdhl启动子的cdhl信号序列。在一些实施方案中，表达载体也可包括终止序列。在一个实施方案中，终止序列和启动子序列可衍自相同来源。在另一个实施方案中，终止序列可以对宿主细胞而言是同源的。特别合适的终止子序列可以是衍自里氏木霉的cbh7。其他示例性的真菌终止子包括来自黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的终止子。在一些实施方案中，表达载体可包括选择性标记。代表性的选择性标记的例子包括赋予抗微生物抗性(例如潮霉素和腐草霉素)的选择性标记。营养选择性标记也可用于本发明，包括本领域已知的amdS、argB和pyr4标记。在用于木霉属的转化的载体系统中有用的标记是本领域已知的(参见例如Finkelstein，《丝状真菌的生物技术》(Biotechnology Of Filamentous Fungi)第 6 章，Finkelstein 等人编辑，马萨诸塞州波士顿 Butterworth-Heinemann 出版社(Butterworth-Heinemann, Boston, Mass.), 1992 年，第6章；和Kinghorn等人，1992年，《丝状真菌的应用分子遗传学》(APPLIED MOLE⑶LARGENETIC S OF FILAMENTOUS FUNGI)，伦敦 Chapman and Hall 出版社(Blackie Academicand Professional)。在一个代表性的实施方案中，选择性标记可以是编码乙酰胺酶的amdS基因，从而使转化的细胞能以乙酰胺作为氮源生长。使用构巢曲霉amdS基因作为选择性标记在例如以下文献中有描述=Kelley等人，1985年，《欧洲分子生物学组织杂志》(EMBO J.)，第4卷，第475-479页；和Penttila等人，1987年，《基因》(Gene)，第61卷，第155-164页。包含具有编码葡糖淀粉酶的多核苷酸的DNA构建体的表达载体，可以是任何能够在给定的真菌宿主生物中自主复制或能够整合到宿主的DNA中的载体。在一些实施方案中，表达载体可以是质粒。在典型的实施方案中，设想到两种类型的用于获得基因的表达的表达载体。第一个表达载体可包含这样的DNA序列，其中启动子、葡糖淀粉酶编码区和终止子均来源于待表达的基因。在一些实施方案中，可通过缺失掉不需要的DNA序列(例如编码不想要的结构域的DNA)以留下待在其自身的转录和翻译调控序列控制下表达的结构域，来获得基因截短。第二种类型的表达载体可以是预先装配的，含有高水平转录所需的序列并含有选择性标记。在一些实施方案中，可将葡糖淀粉酶基因的编码区或其部分插入到这个通用表达载体中，使得它处于表达构建体启动子和终止子序列的转录控制下。在一些实施方案中，可将基因或其部分插入在强启动子如强cbhl启动子的下游。用于连接包含编码葡糖淀粉酶的多核苷酸、启动子、终止子和其他序列的DNA构建体并将它们插入到合适的载体中的方法是本领域公知的。连接通常可通过在便利的限制位点处的连接来完成。如果不存在此类位点，那么根据常规做法使用合成的寡核苷酸接头。(参见Sambrook, 1989年，出处同上 ；以及Bennett和Lasure,《真菌中的更多基因操纵》(More Gene Manipulations In Fungi),学术出版社，圣地亚哥(Academic Press, SanDiego), 1991年，第70-76页)。另外，可用已知的重组技术构建载体(例如InvitrogenLife Technologies, Gateway Technology)。将DNA构建体或载体引入到宿主细胞中包括诸如以下的技术转化；电穿孔；核显微注射；转导；转染(例如脂转染介导的和DEAE-Dextrin介导的转染)；与磷酸钙DNA沉淀一起温育；用包被DNA的微粒高速轰击；及原生质体融合。一般的转化技术是本领域知道的(参见例如Ausubel等人，1987年，出处同上,第9章；Sambrook, 1989年出处同上；以及Campbell等人，1989年，《当代遗传学》(Curr. Genet.),第16卷，第53-56页)。异源蛋白在木霉属中的表达在以下专利和文献中有描述美国专利第6，022，725号；第6, 268, 328 号；Harkki 等人，1991 年，《酶微生物技术》(Enzyme Microb. Technol.)，第 13 卷，第227-233页；Harkki等人，1989年，《生物技术》(Bio Technol.)，第7卷，第596-603页；EP244, 234 ；EP215, 594 ;以及Nevalainen等人，“木霉属的分子生物学及其在表达同源和异源基因中的应用” (“The Molecular Biology of Trichoderma and its Application tothe Expression of Both Homologous and Heterologous Genes”)，载于《分子工业真菌学》(Molecular Industrial Mycology), Leong和Berka编辑，马塞尔 德克尔公司，纽约(Marcel Dekker Inc.，NY)，1992 年，第 129-148 页)。在一些实施方案中，可用可据以将编码葡糖淀粉酶的核酸稳定整合到宿主菌株染色体中的载体系统来构建遗传上稳定的转化株。然后可通过已知的技术纯化转化株。在一个非限制性例子中，包含amdS标记的稳定转化株与不稳定转化株的区别在于它们生长速度较快，并且在含有乙酰胺的固体培养基上形成光滑轮廓而不是粗糙轮廓的圆形菌落。此外，在一些情况下，通过以下方式进行进一步的稳定性测试使转化株在固体非选择性培养基(即缺乏乙酰胺的培养基)上生长，从这个培养基收获孢子，并测定随后在含有乙酰胺的选择性培养基上萌发和生长的这些孢子的百分比。或者，可使用本领域知道的其他方法来选择转化株。DNA向里氏木霉属菌株宿主中的摄取取决于钙离子浓度。通常，在摄取溶液中可使用约IOmM CaCl2至50禮CaCl20摄取溶液中除了需要钙离子外，其他通常包括的化合物是缓冲系统如TE缓冲液(IOmM Tris, pH7. 4 ；lmM EDTA)或IOmM MOPS, pH6. 0缓冲液(吗啉丙磺酸)和聚乙二醇(PEG)。据认为，聚乙二醇的作用是融化细胞膜，从而让该介质的内容物得以递送到里氏木霉属菌株的细胞质中，并且质粒DNA得以转移到细胞核。这种融化在很多情况下使质粒DNA的多个拷贝整合到宿主染色体中。通常，在转化中使用含有密度为IO5至107/mL、通常2X IO6AiL的经历过渗透性处理的里氏木霉属原生质体或细胞的悬浮液。将这些原生质体或细胞在适当的溶液(例如，1.2M山梨糖醇；50mM CaCl2)中的100 y L体积与所需DNA混合。通常，可将高浓度的PEG加入到摄取溶液。可向原生质体悬浮液加入0. 1-1体积的25% PEG4000。还通常向原生质体悬浮液加入约0. 25体积。也可向摄取溶液加入添加剂例如二甲基亚砜、肝素、亚精胺、氯化钾等，帮助转化。有类似的程序可用于其他的真菌宿主细胞。参见例如，美国专利第6，022，725 号和第 6，268，328 号。通常，然后可将混合物在大约(TC下温育10-30分钟的时间。然后可向混合物加入另外的PEG以进一步增强所需 的基因或DNA序列的摄取。25% PEG4000的加入体积通常可为转化混合物的体积的5-15倍；但是，更大和更小的体积都可以是适合的。25% PEG4000通常可为转化混合物的体积的约10倍。在加入PEG后，接着可将转化混合物在室温下或在冰上进行温育，然后再加入山梨糖醇/CaCl2溶液。然后可将原生质体悬浮液进一步加到生长培养基的熔化等分试样。该生长培养基仅允许转化株的生长。通常，在含有生理盐和营养物的标准培养基中培养细胞(参见例如，Pourquie,J.等人，《纤维素降解的生物化学和遗传学》(Biochemistry And Genetics Of CelluloseDegradation), Aubert, J. P.等人编辑，学术出版社(Academic Press),第 71-86 页，1988年；以及Ilmen, M.等人，1997,《应用环境微生物学》(App1. Environ. Microbiol.),第63卷，第1298-1306页)。常见的商业制备的培养基(例如酵母麦芽浸膏(YM)肉汤、LuriaBertani (LB)肉汤和Sabouraud右旋糖(SD)肉汤也可用于本发明的实施方案。培养条件也是标准的(例如，培养物在摇瓶培养或发酵罐中在适当培养基中于大约28°C下进行温育，直到达到所需的葡糖淀粉酶表达水平)。在真菌生长建立后，使细胞暴露于能有效促使或允许葡糖淀粉酶的表达的条件。在葡糖淀粉酶编码序列处于诱导型启动子的控制下的情况中，可将诱导剂(例如糖、金属盐或抗微生物剂)以能有效诱导葡糖淀粉酶表达的浓度加到培养基。通常，细胞培养物中产生的葡糖淀粉酶可分泌到培养基中，并可例如通过将不想要的组分从细胞培养基中去除来进行纯化或分离。在一些情况中，葡糖淀粉酶可以细胞形式产生，这就需要从细胞切割物中回收在此类情况下，使用本领域的技术人员通常采用的技术从产生该酶的细胞纯化该酶。这些技术的例子包括但不限于亲和层析(Tilbeurgh等人，1984年，FEBS Lett.，第16卷，第215页)、离子交换色谱方法(Goyal等人，1991年，《生物资源技术》(Biores. Technol.),第36卷,第37页；Fliess等人，1983年，《欧洲应用微生物学与生物技术杂志》(Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol.),第17卷,第314页;Bhikhabhai等人，1984年，《应用生物化学杂志》(J. Appl. Biochem.),第6卷,第336页；和Ellouz等人，1987年,《色谱》(Ch`romatography),第396卷,第307页)，包括使用具有高拆分能力的材料进行的离子交换(Medve等人，1998年,《色谱杂志A》(J. Chromatography A),第808卷,第153页)、疏水相互作用色谱(参见Tomaz和Queiroz, 1999年，《色谱杂志A》(J. Chromatography A)，第 865 卷，第 I23 页)、两相分配(参见 Brumbauer 等人，1999 年，《生物分离》(Bioseparation),第7卷，第287页)、乙醇沉淀、反相HPLC、在二氧化娃上或在阳离子交换树脂如DEAE上进行的色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀和凝胶过滤(例如Sephadex G-75)。2. 2. Q-淀粉酶a -淀粉酶构成一组存在于微生物和来自动植物的组织中的酶。它们能够水解糖原、淀粉、相关多糖和一些寡糖的a-l，4-糖苷键。尽管所有a-淀粉酶都具有相同的催化功能，但是它们的氨基酸序列有很大差异。不同的淀粉酶之间的序列同一性可能实质上是不存在的，例如低于25 %。尽管存在相当大的氨基酸序列变异，但是a -淀粉酶具有共同的整体拓扑学模式，该拓扑模式是在测定了来自不同物种的a -淀粉酶的三维结构后得到确定的。该共同的三维结构揭示了三个结构域(I)称为结构域A的“ TIM”桶，(2)称为结构域B的长环区域，其插入于结构域A中，和(3)称为结构域C的接近C端的区域，其含有具有Greek-key基序的特征性P _结构。
“Termamyl样” a-淀粉酶是指一组广泛用于淀粉加工行业的a -淀粉酶。具有美国专利第6，440，716号的SEQ ID NO :2氨基酸序列的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis) a -淀粉酶以商品名Termamyl 市售。Termamyl样a -淀粉酶通常指
芽孢杆菌属(Bacillus spp.)产生的一组高度同源的a-淀粉酶。该组的其他成员包括来自嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophi lus)(之前称为脂肪嗜热芽孢杆菌(Bacillus stearothermophi lus);这两个名称在本说明书中可互用)和解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的a -淀粉酶以及衍自芽抱杆菌属NCIB12289、NCIB12512、NC皿2513和DSM9375的a -淀粉酶，所有这些在美国专利第6，440，716号和W095/26397中有详细描述。尽管a-淀粉酶普遍含有上述的三个结构域，但是一些a-淀粉酶(如来自枯草芽孢杆菌的AmyE)的三维结构不同于Termamyl样a -淀粉酶。这些酶统称为非Termamyl样a-淀粉酶。出于本发明的目的，“AmyE”意指来自枯草芽孢杆菌的天然a -淀粉酶(EC3. 2.1.1 ;1，4- a -D-葡聚糖葡聚糖水解酶)。代表性的AmyE酶及其变体在2009年6月4日提交的美国专利申请12/478，266和12/478，368以及2009年6月5日提交的美国专利申请12/479,427中公开。可使用其他市售的淀粉酶，例如TERMAMYL# 120-L、LC和SCSAN SUPER 、 SUPRA 及LIQUEZYME SC (可获自诺和诺德公司(Novo NordiskA/s))，FUELZYME FL(可获自戴维萨公司(Diversa))，以及 CLARASE L、SPEZYME FRED,SPEZYME ETHYL、GC626 和GZYME G997 (可获自丹尼斯克美国公司杰能科分公司(Danisco, US, Inc.，Genencor Division))。2. 3.其他酶和酶组合在本发明的实施方案中，在淀粉处理中的糖化和/或发酵过程中也可加入其他的酶作为补充。这些辅助性的酶可包括蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、环糊精糖基转移酶、脂肪酶、植酸酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角质酶、木聚糖酶和/或a-葡萄糖苷酶。参见例如WO 2009/099783。本领域技术人员熟知使用以上所列的酶的方法。本文公开的葡糖淀粉酶可与任何其他酶组合使用。例如，葡糖淀粉酶可与淀粉酶(例如a -淀粉酶)组合使用。在一个实施方案中，糖化和/或发酵或者同时糖化发酵(SSF)过程使用葡糖淀粉酶和一种或多种非淀粉多糖水解酶。这些酶能够水解复合碳水化合物聚合物如纤维素、半纤维素和果胶。非限制性例子包括纤维素酶(例如内切和外切葡聚糖酶、
葡萄糖苷酶)、半纤维素酶(例如木聚糖酶)和果胶酶。在另一个实施方案中，糖化和/或发酵或者SSF过程使用葡糖淀粉酶、a -淀粉酶和一种或多种非淀粉多糖水解酶。在另一个实施方案中，糖化和/或发酵或者SSF过程使用葡糖淀粉酶与植酸酶、蛋白酶、异淀粉酶和支链淀粉酶。在一些实施方案中，糖化和/或发酵或者SSF过程可使用至少两种非淀粉多糖水解酶。在一些实施方案中，糖化和/或发酵或者SSF过程可使用至少三种非淀粉多糖水解酶。纤维素酶是能水解纤维素(P-l，4-D-葡聚糖键)和/或其衍生物(如磷酸溶胀纤维素)的酶组合物。纤维素酶包括如下分类外切纤维二糖水解酶(CBH)、内切葡聚糖酶(EG)和P -葡萄糖苷酶(BG) (EC3. 2. 191、EC3. 2.1. 4和EC3. 2.1. 21)。纤维素酶的例子包括来自以下各属微生物的纤维素酶青霉属(Penicillium)、木霉属(Trichoderma)、腐质霉属(Humicola)、镰刀菌属(Fusarium)、高温单孢菌属(Thermomonospora)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、肉座菌属(Hypocrea)、梭菌属(Clostridium)、高温单孢菌属(Thermomonospore)、芽抱杆菌属(Bacillus)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)和曲霉属(Aspergillus)。为饲料应用而出售的市售纤维素酶的非限制性例子有ROVABIO (安迪苏公司(Adisseo))、NATUGRAIN (巴斯夫公司(BASF))、MULTTFECT bgl(丹尼斯克杰能科公司(Danisco Genencor))和JECONASEti (AB酶制剂公司(AB Enzymes))。一些商业纤维素酶包括AGGELERASE气也可使用US20060193897A1中描述的纤维素酶和内切葡聚糖酶。3 -葡萄糖苷酶(纤维二糖酶)能将纤维二糖水解为单个单糖。各种3 -葡聚糖酶可在本发明中与植酸酶组合使用。P -葡聚糖酶(内切纤维素酶分类EC3. 2.1. 4)也称内切葡聚糖酶1、II和III，其能攻击纤维素纤维以释放较小的纤维素片段，后者进一步被外切纤维素酶攻击以释放葡萄糖。可用于本发明方法的商业P -葡聚糖酶包括aPT_lM./\SH@BG和OPTIMASH TBG (丹尼斯克美国公司杰能科分公司)。半纤维素酶是能降解半纤维素的酶。半纤维素涵盖植物细胞壁中存在的多种比糖复杂但不如纤维素复杂的多糖。在一些实施方案中，木聚糖酶可在本发明方法中用作补充酶。任何合适的木聚糖酶都可用于本发明。水解木聚糖主链的木聚糖酶(例如内切-￠-木聚糖酶(E. C. 3. 2.1. 8))可来自细菌来源(例如芽孢杆菌属、链霉菌属(Streptomyces)、梭菌属(Clostridium)、热酸菌属(Acidothermus)、小四抱菌属(Microtetrapsora)或高温单孢菌属(Thermonospora))或者来自真菌来源(曲霉属、木霉属、链孢霉属、链孢霉属、腐质霉属、青霉属或镰刀菌属(参见例如EP473545 ;美国专利第5，612，055号；W0 92/06209 ；和TO 97/20920))。可用于本发明的木聚糖酶包括商业制剂(例如MULT1FECT*和FEEDTREAT Y5 (丹尼斯克杰能科公司(Danisco Genencor) )、RONOZYME WX (诺和诺德公司(Novozymes A/S))和 NATUGRAIN WTTEAT* (巴斯夫公司(BASF))。在一些实施方案中，木聚糖酶是来自里氏木霉的木聚糖酶或者是来自里氏木霉的变体木聚糖酶，或者是EP1222256B1中描述的天生热稳定性木聚糖酶，以及是来自以下各属微生物的其他木聚糖酶黑曲霉(Aspergillus flavus)、白曲霉(Aspergillus kawachii)、塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)、环状芽抱杆菌(Bacillus circulans)、短小芽抱杆菌(Bacillus pumilus)、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)、Neocallimastixpatriciarum、青霉属的物种、变铅青链霉菌(Streptomyces Iividans)、热紫链霉菌(Streptomyces thermoviolaceus)、褐色高温单抱菌(Thermomonospora fusca)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和绿色木霉(Trichodermaviridae)。

可使用的植酸酶包括那些能够从肌醇六磷酸释放至少一个无机磷酸的酶。植酸酶根据其对植酸分子上起始水解的磷酸酯基团的特定位置的偏好性进行分类(例如，分为3-植酸酶(EC3. 1.3.8)或分为6-植酸酶(EC3. 1.3. 26))。植酸酶的一个典型例子是肌醇-六磷酸-3-磷酸水解酶。植酸酶可获自微生物如真菌和细菌(例如曲霉属(例如黑曲霉、土曲霉(A. terreus)和烟曲霉(A. fumigatus))、毁丝霉属(Myceliophthora)(嗜热毁丝霉(M. thermophila))、篮状菌属(Talaromyces)(嗜热篮状菌(T. thermophilus))、木霉属(里氏木霉)和嗜热真菌属(Thermomyces)(参见例如W099/49740))。植酸酶还可获自青霉属的物种(例如P. hordei (参见例如ATCC No. 22053)、桧状青霉(P. piceum)(参见例如ATCC No. 10519)或者短密青霉(P. brev1-compactum)(参见例如ATCCNo. 48944)(参见例如美国专利第6，475，762号)。另外的可用于本发明的植酸酶可获自隔孢伏革菌属(Peniophora)、大肠杆菌(E. coli)、枸橼酸杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterbacter)和布丘氏菌属(Buttiauxella)(参见例如2005年10月17日提交的W02006/043178)。另外的可用于本发明的植酸酶可从商业来源获得(例如NATlfPHOS (巴斯夫公司(BASF))、RONOZYME P (诺维信公司(Novozymes A/S))、PHZYME (丹尼斯克公司(Danisco A/S)、戴维萨公司(Diversa))和F1NASE (AB酶制剂公司(ABEnzymes))。各种酸性真菌蛋白酶(AFP)也可用作该组合的一部分。酸性真菌蛋白酶包括例如那些获自曲霉属、木霉属、毛霉属和根霉属如黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉和米黑毛霉的蛋白酶。AFP可衍自细菌、植物和真菌来源的异源或内源蛋白质表达。可使用从木霉属的菌株分泌的IAFP。合适的AFP包括天然野生型AFP以及变体AFP和遗传工程突变AFP。一些可用于本发明的商业AFP酶包括FERMGEN (丹尼斯克美国公司杰能科分公司(DaniscoUS, Inc.，Genencor Division))和FORMASE 200。蛋白酶也可与葡糖淀粉酶和任何其他酶的组合一起使用。可使用任何合适的蛋白酶。蛋白酶可衍自细菌来源或真菌来源。细菌蛋白酶的来源包括来自芽孢杆菌属(例如解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)、迟缓芽孢杆菌(B.1entus)、地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)和枯草芽孢杆菌(B. subtilis))的蛋白酶。示例性的蛋白酶包括但不限于枯草杆菌蛋白酶，如可获自解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶(美国专利第4，760，025号)o合适的商业蛋白酶包括MULTIFECT P3000 (丹尼斯克杰能科公司(Danisco Genencor))和SUMIZYME FP (新日本公司(Shin Nihon))。合适的真菌蛋白酶的来源包括但不限于 例如木霉属、曲霉属、腐质霉属和青霉属。也可将脱支酶如异淀粉酶(EC3. 2.1. 68)或支链淀粉酶(EC3. 2.1. 41)与葡糖淀粉酶组合用于本发明的糖化和/或发酵或者SSF过程。可使用的支链淀粉酶的非限制性例子是 Pn)mo/:ynic. 03.淀粉加工3.1.淀粉底物和原料本领域技术人员熟知可供用于制备在本文公开的过程中使用的淀粉底物。例如，可用的淀粉底物可获自块茎、根、茎、豆类、谷类或全谷。更具体而言，颗粒淀粉来自能生产大量淀粉的植物。例如，颗粒淀粉可获自玉米、小麦、大麦、黑麦、买罗高梁、西米、木薯(cassava)、木薯(tapioca)、高梁、大米、豌豆、豆(bean)、香蕉或马铃薯。玉米含有约60-68%淀粉；大麦含有约55-65%淀粉；小米含有约75-80%淀粉；小麦含有约60-65%淀粉；精白米含有约70-72%淀粉。具体设想到的淀粉底物有玉米淀粉、小麦淀粉和大麦淀粉。来自谷类的淀粉可以是磨碎的或者是完整的，包括玉米固形物，如玉米籽粒、麩皮和/或穗轴。淀粉可以是来自淀粉精制过程的高度精制的生淀粉或原料。各种淀粉也可市售获得。例如，玉米淀粉可获自Cerestar公司、西格玛公司(Sigma)和日本片山化学工业株式会社(Katayama Chemical Industry Co.);小麦淀粉可获自西格玛公司(Sigma);甘薯淀粉可获自日本的和光纯药工业株式会社(Wako Pure Chemical Industry Co.);马铃薯淀粉可获自日本的 Nakaari Chemical Pharmaceutical Co.。3. 2.碾磨淀粉底物可以是来自经碾磨的全谷的粗淀粉，全谷含有非淀粉级分例如残胚和纤维。碾磨可包括湿磨或干磨。在湿磨中，可将全谷浸泡在水或稀酸中，以将谷粒分离为其组分，例如淀粉、蛋白质、胚芽、油、籽粒纤维。湿磨能有效地分离胚芽和粗粉(即淀粉颗粒和蛋白质)，并可尤其适合于生产糖浆。在干磨中，将全籽粒研磨成细粉并在不将谷粒分级为其组分的情况下进行加工。干磨谷粒因此除了包含淀粉外还将包含大量的非淀粉碳水化合物。大部分的乙醇来自干磨。或者，待加工的淀粉可以为高度精制的淀粉质量，例如至少约90%、至少约95%、至少约97%或至少约99. 5%纯。3. 3.糊化和液化在本发明的一些实施方案中，可使用糊化和/或液化。本文所用的术语“液化”意指将淀粉转化为粘性较小且链长较短的可溶性糊精的过程。在一些实施方案中，这个过程涉及在进行淀粉糊化的同时添加a-淀粉酶或者或随后添加a-淀粉酶。可任选添加另外的液化促进酶，如植酸酶。在一些实施方案中，不使用糊化。在其他实施方案中，不使用单独的液化步骤。可在进行糖化和/或发酵的同时使淀粉转化为较短的链。在一些实施方案中，淀粉被直接转化为葡萄糖。在其他实施方案中，在糖化之前使用单独的液化步骤。在一些实施方案中，可将如上所述制备的淀粉底物用水调成浆液。淀粉浆液含有的淀粉以干物质重量百分比计可为约10-55 %、约20-45%、约30-45%、约30-40%或约30-35%。在一些实施方 案中，淀粉浆液为至少约5%、至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%或至少约55%。为优化a-淀粉酶稳定性和活性，可将浆液的pH调整至a-淀粉酶的最适pH。液化后在浆液中剩余的a -淀粉酶可通过在后一反应步骤中降低pH或者通过从浆液移除钙来使其失活。当使用本发明的葡糖淀粉酶时，应将浆液的PH调整至中性pH (例如pH5. 0-8. 0及这个范围内的任何pH)。可将淀粉加a -淀粉酶的浆液连续泵送经过喷射蒸煮器，该喷射蒸煮器可被蒸汽加热到约85°C至最高约105°C。在这些条件下糊化发生得非常快，并且酶活性与极大的剪切力相结合开始淀粉底物的水解。在喷射蒸煮器中的停留时间可非常短暂。可使经部分糊化的淀粉穿过维持在约85-105°C下的一系列保温管并保温约5分钟以完成糊化过程。这些罐可具有挡板以阻止回流混合。本文所用的术语“第二液化”指跟在第一液化后面的液化步骤，此时让浆液冷却到室温。这个冷却步骤可为约30分钟至约180分钟，例如约90分钟至120分钟。经碾磨和液化的谷粒也被称为糊料(mash)。3.4.糖化在液化后，可将糊料通过糖化进一步进行水解以产生在下游应用中可容易使用的可发酵糖。本发明实施方案的糖化可通过使用如上所述的葡糖淀粉酶在5. 0-8. 0,5. 5-7. 5、
6.0-7. 5、6. 5-7. 5或7. 0-7. 5范围内的pH下进行。在其他实施方案中，所用的pH可为5. 0、
5.25、5. 50、5. 75、6. 0、6. 50、7. 0、7. 50 或 8. O。在一个实施方案中，在pH6. 0或6. 0以上，葡糖淀粉酶相对于其在最适pH下的最大活性具有至少约50%、约51%、约52%、约53%、约54%或约55%活性。在另一个实施方案中，对于6. 0-7. 5的pH范围，HgGA相对于其最大活性可具有至少53%活性。在另一个实施方案中，在pH6. 0下，TrGA相对于其最大活性可具有至少50%活性。在一个实施方案中，葡糖淀粉酶(例如HgGA)在pH7.0下具有最大活性的67%。在另一个实施方案中，葡糖淀粉酶(例如TrGA)在pH5. 25下具有最大活性的66%。在一个实施方案中，葡糖淀粉酶的用量可在约0. 2-2. OGAU/g dss (干物质淀粉)、约0. 5-1.5GAU/g dss或1.0-1.5GAU/g dss的范围内。在一个实施方案中，葡糖淀粉酶(例如TrGA)可以按约l-5GAU/g dss的用量使用。在另一个实施方案中，葡糖淀粉酶(例如TrGA)可以按约 lGAU/gdss、 2GAU/g dss、3GAU/g dss、4GAU/g dss 或 5GAU/g dss 的用量使用。在一个实施方案中，葡糖淀粉酶(例如HgGA)可以按约0. 25-lGAU/g dss的用量使用。在另一个实施方案中，葡糖淀粉酶(例如HgGA)可以按约0. 25GAU/g dss、0. 5GAU/g dss、0. 75GAU/g dss或IGAU/g dss的用量使用。糖化可在约30至约60°C或约40至约60°C下进行。在一些实施方案中，糖化在32°C、pH7.0下进行。在其他实施方案中，糖化在58°C、pH6. 5下进行。完整的糖化步骤通常可在24-96小时、24-72小时或24-48小时的范围内。在一些实施方案中，糖化在约 2、4、6、7. 7、8、110、14、16、18、20、22、23. 5、24、26、28、30、31. 5、34、36、38、40、42、44、46或48小时后进行。在一些实施方案中，糖化步骤和发酵步骤组合在一起，这个过程被称为同时糖化发酵(SSF)。认识到，通常随着时间的推移，酶(葡糖淀粉酶加上或不加上其他其他酶如a -淀粉酶或非淀粉多糖水解酶)将高级糖还原为低聚合度(DP)糖(如DPI)。可通过使用不同的参数来改变糖谱(sugar profile),所述参数例如但不限于起始淀粉底物、温度、葡糖淀粉酶的量、葡糖淀粉酶的类型和pH。例如，在一个实施方案中，对于HgGA，在32摄氏度和pH7. 0下，糖化过程过程中的糖或寡糖分布可为约0. 36%至约96. 50% DP1、约3. 59%至约11.80%DP2J4 0. 12%至约7.75%、和/或约2. 26%至约88. 30%高级糖。在另一个实施方案中，对于TrGA，在32摄氏度和pH7. 0下，糖化过程过程中的糖分布可为约0. 36%至约 79. 19% DP1、约 3. 59%至约 9. 92% DP2、约 0. 17%至约 9. 10% DP3 和 / 或约 17. 15%至约88. 30%高级糖。因此，在一个实施方案中，使用HgGA，在24小时后DPl含量可达到超过90%。在45小时后，DPl含量可达到超过96%，而高级糖的含量可降低到低于3%。使用TrGA，可在24小时后获得超过70% DPI。在45小时后，DPl含量可达到约80%，而高级糖的含量可下降到低于20%。在另一个实施方案中，对于HgGA，在58摄氏度和pH6. 5下，糖化过程过程中的糖分布可为约 60. 66%至约 93. 67% DP1、约1. 49%至约 8. 87% DP2、约 0. 33%至约1. 93%DP3和/或约4. 51%至约28. 17%高级糖。在其他实施方案中，对于TrGA，在58摄氏度和PH6. 5下，糖化过程过程中的糖或寡糖分布可为约37. 08%至约75. 25% DP1、约5. 48%至约10. 19% DP2、约0. 46%至约5. 06%、和/或约18. 37%至约47. 47%高级糖。因此，在一个实施方案中，使用HgGA，在24小时后DPl含量可达到超过90%。在48小时后，DPl含量可达到超过93%，而高级糖的含量可降低到低于5 %。使用TrGA，可在24小时后获得超过70% DPl0在45小时后，DPl含量可达到约75%，而高级糖的含量可下降至约18%。在又另一个实施方案中，在58摄氏度和pH6. 5下，本文公开的葡糖淀粉酶可用来糖化其中高级糖(例如DP4+)减少的淀粉底物。在一些实施方案中，对于TrGA，糖化过程过程中的糖或寡糖分布可为约81. 10%至约90. 36% DP1、约1. 99%至约3. 96% DP2、约0. 49%至约0.61% DP3、约4. 48%至约16. 13% DP4+。在其他实施方案中，对于HgGA，糖化过程过程中的糖或寡糖分布可为约93. 15%至约95. 33% DP1、约2. 10%至约3. 94% DP2,约 0. 53%至约1. 00% DP3、约 0. 94%至约 3. 76% DP4+。在又另一个实施方案中，对于HgGA,在58摄氏度和pH6. 4下,糖化过程过程中的糖或寡糖分布可为约93. 79%至约96. 9% DP1、约1. 55%至约3. 02% DP2、约0. 2%至约0. 49% DP3和约0%至约3. 98% DP4+。在一些情况中，在24小时内可达到约93%溶解度和约96. 9%葡萄糖产量。继续糖化可在约48小时后达到99%溶解度和约96. 8%葡萄糖。在另一个实施方案中，在58摄氏度和pH6. 4下，糖化过程过程中的糖或寡糖分布可为约 75. 08%至约 96. 5% DP1U. 57%至约 9. 16% DP2、0. 67%至约 15. 76% DP3+。在一些情况中，HgGA在pH6. 4下可维持大量的葡糖淀粉酶活性长达约52小时，以持续地产生DPl产物、DP2产物和提高可溶性固形物的百分比。增加HgGA的量可导致溶解百分比和DPl生成的速率提闻。3.5.发酵在本发明的一些实施方案中`，可使可发酵糖经历分批或连续发酵条件。传统的分批发酵是在封闭系统中进行，其中培养基的组成在发酵开始时设定，并且在发酵过程中不进行人为改变。因此，在发酵开始时，可用所需的生物体接种培养基。在这个方法中，可在不向系统中添加任何组分的情况下让发酵进行。通常，分批发酵是就添加碳源而言谓之“分批”，而常常会尝试对诸如PH和氧浓度的因素进行控制。直到发酵停止之时，分批系统的代谢物和生物量组成都不断地变化。在分批培养物内，细胞经静息迟滞期进入高速对数生长期，最终到达生长速率降低或停止的稳定期。稳定期的细胞如果不加以处理就会最终死亡。一般而言，是对数期的细胞导致终产品的大量产生。标准分批系统的一种变型是“补料分批发酵”系统，其可在本发明的一些实施方案中使用。在典型的分批系统的这个变型中，可随着发酵的进行以增量的形式(inincrements)添加底物。在分解代谢物阻遏倾向于抑制细胞的代谢时和在需要在培养基中具有有限量的底物的情况下，补料分批系统特别有用。补料分批系统中实际底物浓度的测量可能是困难的，因此根据诸如pH、溶氧、废气(如CO2)分压的可测量因素的变化进行估计。分批发酵和补料分批发酵都是本领域普通且公知的。另一方面，连续发酵是开放系统，其中限定的发酵培养基可连续添加到生物反应器，并可同时移取等量的经调理的培养基进行加工。连续发酵通常以恒定的高密度维持培养物，其中细胞主要处于对数生长期。连续发酵使得可以调节影响细胞生长和/或终产品浓度的一个因素或多个因素。例如，在一个实施方案中，可以以固定的速率维持限制性营养物如碳源或氮源，同时让所有其他参数调节。在其他系统中，可连续地改变多个影响生长的因素，同时可保持细胞浓度(通过培养基浊度测量)恒定。连续系统旨在维持稳态生长条件。因此，必须使由于移取培养基导致的细胞损失与发酵中的细胞生长速率保持平衡。调节连续发酵过程的营养物和生长因子的方法以及使产物形成速率最大化的技术是工业微生物学领域公知的。在另外的实施方案中，通过使用本领域知道的适当发酵微生物，发酵终产品可包括但不限于酒精、1，3-丙二醇、琥珀酸、乳酸、氨基酸、蛋白质、功能寡糖以及它们的衍生物。参见例如WO 2008/086811(甲醇、乙醇、丙醇和丁醇发酵)；W0 2003/066816、美国专利第5，254，467号和第6，303，352号(1，3_丙二醇发酵)；美国专利第RE37，393号、第6，265，190号和第6，596，521号(琥珀酸发酵);美国专利第5，464，760号、W02003/095659、Mercier等人，《化工技术与生物技术杂志》(J. Chem. Tech. Biotechnol.)，第55卷，第111-121 页、Zhang 和 Cheryan,《生物技术通讯》(Biotechnol. Lett.),第 13 卷，第 733-738页，1991 年、Linko 和 Javanainen,《酶微生物技术》(Enzyme Microb. Technol.),第 19 卷，第118-123页，1996年、以及Tsai和Moon，《应用生物化学与生物技术》(Appl. Biochem.Biotechnol.,第70-72卷,第417-428页，1998年(乳酸发酵);美国专利第7，320, 882号、第7，332，309号、第7，666，634号、以及Zhang等人，《应用微生物学与生物技术》(Appl.Microbiol. Biotechnol.)，第77卷，第355-366页，2007年(各种氨基酸的发酵)。以上列举的名单仅为例子，本领域技术人员会知道多种可适当地用于获得所需的终产品的发酵微生物。3.6.同时糖化发酵(SSF)在SSF过程中，将水 解酶随同终产品生产者(通常为微生物)一起加入。酶从淀粉底物释放可发酵的较低分子量糖类，即可发酵糖DP1-3，同时微生物利用可发酵糖进行生长和产生终产品。通常，选定发酵条件，所述条件能提供用于促进生产者即宿主细胞株的最佳生长动力学的最适pH和温度，并提供针对培养物所产生的酶的催化条件。参见例如Doran等人,《生物技术进展》(Biotechnol. Progress)，第9卷，第533-538页，1993年。表I显示了示例性的发酵微生物和它们的最适发酵pH。由于本文公开的葡糖淀粉酶在中性pH和高温下具有显著的活性，它们将可在SSF中用于那些具有在5. 5-7. 5范围内的最适发酵pH的微生物。
_6] 表1.示例性的发酵微生物及其最适pH。
权利要求
1.一种加工淀粉的方法，所述方法包括在葡糖淀粉酶存在下在PH5. 0-8. 0下将淀粉底物糖化成可发酵糖，其中所述葡糖淀粉酶在PH6. 0或6. 0以上相对于其最大活性具有至少50%活性,其中所述葡糖淀粉酶选自包含SEQ ID NO :3的灰腐质霉(Humicola grisea)葡糖淀粉酶(HgGA)、包含SEQ ID NO :6的里氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶(TrGA)、包含SEQ ID NO :9的根霉属物种(Rhizopus sp.)葡糖淀粉酶(RhGA)以及它们的变体，其中所述变体与亲本葡糖淀粉酶具有至少99%序列同一性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述变体与所述亲本葡糖淀粉酶相比具有一个氨基酸修饰。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述HgGA为SEQID NO :3。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述HgGA从里氏木霉宿主细胞产生。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述TrGA为SEQID No :6。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述RhGA为SEQID NO :9。
7.根据权利要求1所述的方法，其中糖化在6.0-7. 5范围内的pH下进行。
8.根据权利要求1所述的方法，其中糖化在7.0-7. 5范围内的pH下进行。
9.根据权利要求1所述的方法，其还包括将所述可发酵糖发酵成终产品，且其中糖化和发酵在相同的PH下进行。
10.根据权利要求9所述的方法，其中糖化和发酵作为同时糖化发酵(SSF)过程进行。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述SSF过程在7.0-7. 5之间的pH下进行。
12.根据权利要求1所述的方法，其中糖化在约30°C至约60°C范围内的温度下进行。
13.根据权利要求12所述的方法，其中糖化在约40°C至约60°C范围内的温度下进行。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述淀粉底物为约15%-50%干物质(DS)。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述淀粉底物为约15%-30%干物质(DS)。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述淀粉底物为约15%-25%干物质(DS)。
17.根据权利要求9所述的方法，其中所述终产品选自甲醇、乙醇、丁醇、谷氨酸一钠、琥珀酸、1，3_丙二醇、维生素、氨基酸和乳酸。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述终产品为乙醇。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述终产品为1，3_丙二醇。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述终产品为琥珀酸。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述淀粉底物为颗粒淀粉或液化淀粉。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶的用量在约0.1至约2. OGAU/克干物质淀粉的范围内。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶的用量在约0.2至约1. OGAU/克干物质淀粉的范围内。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶的用量在约0.5至1. OGAU/克干物质淀粉的范围内。
25.根据权利要求1所述的方法，其还包括加入a-淀粉酶。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述a-淀粉酶为来自芽孢杆菌属(Bacillus)的物种，或为其变体。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述a-淀粉酶为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) a -淀粉酶(AmyE)、解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) a _ 淀粉酶、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) a -淀粉酶、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus) a -淀粉酶或其变体。
28.根据权利要求1所述的方法，其中所述淀粉底物来自玉米、小麦、黑麦、大麦、高粱、木薯(cassava)、木薯(tapioca)、马铃薯以及它们的任何组合。
29.—种加工淀粉的方法，所述方法包括在葡糖淀粉酶和至少一种其他酶存在下在PH5. 0-8. 0下将淀粉底物糖化成可发酵糖， 其中所述葡糖淀粉酶在PH6. 0或6. 0以上相对于其最大活性具有至少50%活性，其中所述葡糖淀粉酶选自包含SEQ ID NO 3的灰腐质霉葡糖淀粉酶(HgGA)、包含SEQ ID NO 6的里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)、包含SEQ ID NO :9的根霉属物种葡糖淀粉酶(RhGA)以及它们的变体，其中所述变体与亲本葡糖淀粉酶具有至少99%序列同一性，且 其中所述其他酶选自蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、环糊精糖基转移酶、脂肪酶、植酸酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角质酶、木聚糖酶和a -葡萄糖苷酶。
30.一种加工淀粉的方法，所述方法包括在葡糖淀粉酶和至少一种其他非淀粉多糖水解酶存在下在PH5. 0-8. 0下将淀粉底物糖化成可发酵糖， 其中所述葡糖淀粉酶在PH6. 0或6. 0以上相对于其最大活性具有至少50%活性，其中所述葡糖淀粉酶选自包含SEQ ID NO :3的灰腐质霉葡糖淀粉酶(HgGA)、包含SEQ ID NO 6的里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)、包含SEQ ID NO :9的根霉属物种葡糖淀粉酶(RhGA)以及它们的变体，其中所述变体与亲本葡糖淀粉酶具有至少99%序列同一性，且 其中所述非淀粉多糖水解酶选自纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。
全文摘要
本发明的实施例涉及通过糖化和/或发酵从淀粉底物生产下游产品如可发酵糖和终产品的过程。糖化由葡糖淀粉酶在5.0-8.0范围内的pH下有效催化。在pH6.0或6.0以上，葡糖淀粉酶相对于其最大活性具有至少50％活性。糖化和发酵可作为同时糖化发酵(SSF)过程进行。
文档编号C12P7/06GK103068997SQ201180039681
公开日2013年4月24日 申请日期2011年8月5日 优先权日2010年8月6日
发明者M·H·贝里斯玛, G·K·肖塔尼, W·A·奎瓦斯, 段钢, S·H·李, 钱莹, V·夏尔马, J·K·谢蒂, B·A·斯托姆, P·J·M·特伊尼森, H·徐 申请人:丹尼斯科美国公司