一种利用甘蔗渣发酵产丁醇的预处理方法
【专利摘要】本发明公布了一种利用甘蔗渣发酵产丁醇的预处理方法，该方法包括机械粉碎、液态热水处理、微波处理、微生物分解、氨处理和酶解处理步骤，经过上述步骤后，可合并各步骤的分解产物进行分步糖化发酵和同步糖化发酵。该预处理方法可将主要抑制剂呋喃甲醛和羟甲基糠醛的含量控制在不影响发酵菌生长的浓度以下，并且基本不产生葡糖醛酸、对香豆酸、丁香酸和阿魏酸等其它抑制剂。该方法无需对预处理分解产物进行脱毒纯化处理，便可直接进行生物发酵产丁醇，具有可控制抑制剂产生、成本低、产量高和环境友好的优点。
【专利说明】一种利用甘蔗渣发酵产丁醇的预处理方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物质预处理领域，具体涉及一种利用甘蔗渣发酵产丁醇的预处理方 法。
【背景技术】
[0002] 目前，已有多种成熟的针对于纤维材料和半纤维材料的预处理方法以水解得到糖 分，所得的糖分可以用于发酵生产生物燃料。
[0003] 最近，这些方法在工业生物【技术领域】得了一些进展，为能经济有效的利用农业产 业废料提供了潜在的机会。例如，甘蔗渣是一种综合性材料，为甘蔗产业中的主要副产物， 也是主要农业废料之一,每年都富产于中国南方。甘蔗渣含有大约50%的纤维素、25%的半 纤维素和25%的木质素，用其生产生物丁醇是一种生产生物燃料的理想方法，因为丁醇相 比于传统的乙醇，具有更高的热值和更低的吸湿性。
[0004] 然而，利用甘蔗渣生产丁醇是否可行，取决包括预处理和脱毒纯化等多种因素。而 传统的预处理方法，如酸解，常产生严重抑制梭菌生长的毒性物质。
[0005] 许多研究报道了多种可用于富有纤维素和半纤维素的谷物残渣的预处理方法，包 括蒸汽爆破法或稀酸预处理法。酸解法是一种常用且有效的预处理方法，特别常用的是稀 硫酸。该方法不仅简单，而且成本低廉。然而，在酸解时，常产生一类微生物抑制剂，该抑制 剂可在发酵时抑制微生物的生长。呋喃甲醛和羟甲基糠醛是在生物发酵时产生的主要抑制 齐IJ。因此，在进行生物丁醇发酵前，水解产物必须首先进行脱毒纯化，以除去抑制剂。
[0006] 然而，预处理后的脱毒纯化是一个复杂的过程，尽管多种脱毒纯化方法已经得到 了研究，如石灰处理、蒸发法、离子交换柱层析法、活性炭和生物处理法，然而这些方法要么 脱毒纯化效果不好，要么成本太高。目前，主要通行的方法是利用化学法去除抑制剂，因为 化学法较为简单，成本也较低。然而，利用化学法时，由于抑制剂的化学结构的差异性，导致 该法无法对所有抑制剂进行清除。另外，化学法还会产生许多盐类，导致在发酵液中含有高 浓度的盐，而高浓度盐会对微生物发酵产生严重的抑制效果，从而导致生物丁醇产量的减 少。
[0007] 因此，选择合适的预处理方法就显得十分重要。选择预处理方法时，需考虑如下两 点：1、能最有效的破坏纤维结构，以产生充足的糖，并防止对糖的损耗，同时还能避免或减 少抑制剂的产生；2、预处理方法需成本低廉，简单易行。
[0008] 在现有技术中，还未有可避免或减少所有主要抑制剂产生的预处理方法。因此，亟 待开发一种既经济可行，又能控制所有主要抑制剂含量，以便对甘蔗渣进行发酵产丁醇的 预处理方法。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供一种利用甘蔗渣发酵产丁醇的预处理方法，该预处理方法 可以控制抑制微生物生长的毒素的产生。通过控制毒素的产生，使得经预处理后的甘蔗渣 无需后续的纯化脱毒处理，便能进行发酵生产丁醇，大大降低了生产成本。
[0010] 该预处理方法包括如下步骤： 1) 机械粉碎：对甘蔗进行切段至长度为5-l〇Cm，在65±2°C下烘干2天，然后进行粉碎， 过20目筛，得到粒径小于830μm的甘蔗渣粉； 2) 液态热水处理：按固液质量体积比为250g/L，将步骤1)所得物于常温下在水中浸泡 12h,之后用蒸汽预加热45s,然后加入液态热水,在200±3°C下,反应Ih,反应后进行过滤， 收集滤液I和固体残余物I; 3) 微波处理：调整步骤2)所得固态残余物I的湿度为40%，并置于反应器中，然后通入 氮气排除氧气，于4 °C下放置8-12h，之后将反应器置于微波热解炉中，在120 °C下反应7 min，再将反应所得物降温至常温，用90%乙醇对反应所得物进行浸洗，之后进行过滤，收集 滤液II和固体残余物Π; 4) 微生物分解：烘干步骤3)所得固体残余物II，之后加入培养液进行混合，再于121 °C下进行灭菌，灭菌后，调整其湿度为30%，以质量百分比计，再加入10%的分解菌菌液，于 30°C下发酵10d，之后进行过滤，收集滤液III和固体残余物III; 所述培养液的配方为：30mgH3B03、20mgMnC12. 4H20、185mgZnS04*7H20、20mg Na2Mo04.2H20、280mgFeS04*H20、200mgCuS04、5gNH4NO3UgKH2P04、0. 15gMgS04*H20、 0· 11gCaCl2 和ILddH20,pH为 7. 0 ; 所述分解菌为 ATCC1015、fricAoofe/mareeseiATCC26921 和 PenicilliumjanthinelIum 中饱一种； 5) 氨处理：用CldH2O对步骤4)所得固体残余物III进行清洗，之后将其烘干，以固液质量 比为1:2,将烘干后的固体残余物III与氨水混合，在0.IMPa压强下，于90 °C反应30min，之 后进行过滤，收集滤液IV和固体残余物IV; 6) 酶解处理：将所述固体残余物IV于水中浸泡2h，调节pH为7. 0,浓缩后将其烘干， 然后配制酶解混合物，每500ml该酶解混合物由下述物质组成：50g烘干了的所述固体残 余物IV、10g纤维素酶、100mlOPTMSHBG、5mg氯霉素和2. 5mg卡那霉素；调整酶解混合 物的pH为5. 0,在温度为55°C，摇床转速为220rpm下，反应60h，之后进行过滤，收集滤液 V和固体残余物V; 7) 将滤液I、滤液II、滤液III、滤液IV和固体残余物IV合并，留待SSF发酵，或将所述滤 液I、滤液II、滤液III、滤液IV和滤液V合并并旋蒸浓缩，留待SHF发酵。
[0011] 优选的，在进行微生物分解时，所用的分解菌为reeseiJTTCr 26921〇
[0012] 在现有预处理方式中，单独使用某一种预处理方式时，不能充分降解甘蔗渣纤维 素，产糖率极低；如与稀酸法联用，虽然产糖率有所改善，但会对反应器产生腐蚀和出现污 染问题，同时，对抑制剂浓度的控制效果也不理想。
[0013] 本发明首先选择高热水处理，先通过在常温下在水中浸泡12h，之后用蒸汽预加热 45s，然后加入液态热水，在200±3°C下，反应lh，便可实现破坏纤维素与木质素间结合牢 固的分子结构。这是因为首先必须对甘蔗渣纤维素的结构进行破坏，使甘蔗渣处于"松散" 状态，以便进行下一步处理。在较为高压，且温度不太高的预处理条件下，蒸汽能与甘蔗渣 的表面充分接触，从而破坏纤维素与木质素间结合牢固的分子结构。
[0014] 虽然经过第一步预处理，甘蔗渣的结构呈现一定程度的"松散"状态，但是甘蔗渣 还是没有得到充分的降解，因此第二步采用微波预处理。在120°c下，将经第一步预处理的 甘蔗渣在微波下进行处理，可使得处于"松散"状态的甘蔗渣进一步的分解，但经微波预处 理后，可能会产生一些生物油、柴油等物质，用90%的乙醇洗涤，可洗脱产生的油类物质，便 于下一步微生物的分解生长。
[0015] 经过前两步预处理后，甘蔗渣可以进行第三步分解，即微生物分解。微生物主要利 用自身产生的酶系分解纤维素，在酶切割的情况下，纤维素得到再进一步的分解。可用的分 犧舊％AspergillusnigerKK￡VdMTrichodermareeseiΚΚ￡ 2明2\ 热Penicillium ATCC44750 中的一种，其中Ti-icAoofe/mareeseiATCC26921 的分解效果最 好，这可能是因为该菌更偏向对甘蔗渣的分解利用。
[0016] 然而以上几步主要在于分解性纤维素和半纤维素，但是某些木质素可能还没得到 充分的分解，因此，第四步采用氨水浸泡，氨水浸泡的目的在于使已经被破坏了的纤维素和 木质素得到分离，只有分离了木质素，下一步中的酶解才能使纤维素得到进一步的再分解。 在氨水浸泡中，浸泡时间、压力和温度较为重要，通过合适的设置，可提高甘蔗渣的分解效 率，并减少抑制剂的产生。经过以上几步预处理后，最后一步采用酶解。
[0017] 上述预处理步骤的顺序是固定的。通过上述步骤处理，不仅可以得到较高的产糖 率，而且水解液中所有主要的抑制物含量低于影响发酵菌生长的浓度，或低至检测不出。
[0018] 由于甘蔗渣的大小影响着分解的难易程度，一般而言，越小的甘蔗渣更易分解，但 考虑到能耗因素，将甘蔗渣的大小控制在860μm以下，不仅分解效果好，且能耗较低。
[0019] 液态热水法相比于稀酸法，无需添加酸试剂，不会对反应器造成腐蚀，产生的水解 液中的残留物也较少，是一种较为温和的预处理方法。然而，其甘蔗残余物回收率较低，单 独使用时无法达到有效分解甘蔗渣的目的。
[0020] 经过液态热水法处理后，再利用微波进行处理，可较大幅度的提高还原糖的产量、 并缩短反应时间和降低能耗。进行微波处理时，微波可加速对晶体结构的破坏，使微生物更 容易对甘蔗渣进行进一步分解。通过分解菌分解后，可再提高10%左右的甘蔗渣分解率。
[0021] 优选的，在利用分解菌分解甘鹿渔时，利用reeseiJTTCr激似7可实 现更好的分解效率。
[0022] 进行氨处理时，由于氨是木质素的良好溶剂，可将木质素和木质纤维素进行分离， 从而可提高后续纤维素酶对甘蔗渣的分解效率。
[0023] 经过上述处理后，再利用酶解处理，可最大化的水解甘蔗渣。
[0024] 本发明的有益效果： 1、 能够高效水解甘蔗渣，水解率可达到74. 41% ; 2、 可得到高浓度的葡萄糖，葡萄糖浓度可达到15. 21 ±1. 65g/L; 3、 预处理条件温和，能耗低、不腐蚀设备； 4、 无需后续纯化步骤，微生物发酵生产成本低； 5、 主要抑制剂呋喃甲醛和羟甲基糠醛含量低，不影响发酵微生物的生长，同时基本不 产生葡糖醛酸、对香豆酸、丁香酸和阿魏酸等其它抑制剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 1、图1所示为本发明预处理方法步骤的示意图； 2、 图2所示，为利用甘蔗渣水解产物(滤液)作为发酵底物时，发酵产物与发酵时间的关 系图；其中HAN表示为：在步骤4)采用Asper价7ΛΛ5 /?i职rATCC1015作为发酵菌，并将所 述滤液I、滤液II、滤液III、滤液IV和滤液V合并，用作SHF发酵；HTR表示为：在在步骤4) 采用reeseiATCC26921作为发酵菌，并将所述滤液I、滤液II、滤液III、滤液 IV和滤液V合并，用作SHF发酵；HPJ表示为：在在步骤4)采用 ATCC44750作为发酵菌，并将所述滤液I、滤液II、滤液III、滤液IV和滤液V合并，用作SHF发酵；HANNY表示为：在步骤4)采用/?i职rATCC1015作为发酵菌，并将滤 液I、滤液II、滤液III、滤液IV和固体残余物IV合并，用作SSF发酵；HTRNY表示为：在步 骤4)米用reeseiATCC26921作为发酵菌，并将滤液I、滤液II、滤液III、 滤液IV和固体残余物IV合并，用作SSF发酵；HPYNY表示为：在步骤4)采用 ATCC44750作为发酵菌，并将滤液I、滤液II、滤液III、滤液IV和固体残余物IV合并并旋蒸浓缩，用作SSF发酵； 3、 图3所示，为利用甘蔗渣水解产物(滤液)作为发酵底物时，在SSF和SHF发酵过程中 pH的变化图；其中，HAN、HTR、HPJ、HANNY、HTRNY、HPJNY的含义与图2中的一致；a为SSF发 酵；b为SHF发酵； 4、 图4所示，为SSF和SHF发酵过程中，对不同糖成分的转化使用情况；其中a、b、c为 SHF发酵，b、d、f为SSF发酵，HAN、HTR、HPJ、HANNY、HTRNY、HPJNY的含义与图 2 中的一致； 5、 图5所示，为在发酵终点，由不同发酵底物产生的总残余物碳水化合物；其中，HAN、 HTR、HPJ、HANNY、HTRNY、HPJNY的含义与图 2 中的一致； 6、 图6所示，为利用纯葡萄糖作为发酵底物时，在发酵过程中，不同参数的变化图； 7、 图7所示，为利用糖组合物作为发酵底物时，不同产物、糖和pH的变化图。
【具体实施方式】
[0026] 下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用 于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练 人员根据上述
【发明内容】
所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0027] 实施例1 : 1) 将500g甘蔗进行切段至长度为5-lOcm，在65 ± 2°C下烘干2天，然后进行粉碎，过 20目筛，得到粒径小于830μm的甘蔗渣粉； 2) 将步骤1)所得物于常温下在2L的水中浸泡12h，之后用蒸汽预加热45s，然后加入 液态热水，在200±3°C下，反应lh，反应后进行过滤，收集滤液I和固体残余物I; 3) 调整步骤2)所得固态残余物的湿度为40%，并置于三颈圆底烧瓶中，然后通入氮气 排除氧气，于4 °C下放置12h，之后将反应器置于微波热解炉中在120 °C下反应7min，排 出热气，待温度降到室温后，用90%乙醇对反应所得物进行浸洗，之后进行过滤，收集滤液 Π和固体残余物II; 4) 烘干步骤3)所得固体残余物，之后加入培养液进行混合，再于121 °C下进行灭菌， 灭菌后，调整混合物的湿度为30%，再加入20mlAsper价7ΛΛ5 /?i职rATCC1015菌液，于 30°C下发酵10d，之后进行过滤，收集滤液III和固体残余物III; 培养液的配方为：30mgH3B03、20mgMnC12. 4H20、185mgZnS04*7H20、20mg Na2MoO4CH2O, 280mgFeS04*H20, 200mgCuSO4, 5gNH4NO3,IgKH2PO4,0. 15g MgS04.H20，0· 11gCaCl2andILddH20，pH为 7.0 ; 5) 用CldH2O对步骤4)所得固体残余物进行清洗，之后将其烘干，以固液质量比为1: 2， 将烘干后的固体残余物III与氨水混合，在高压下（O.IMPa)，于90°C反应30min，之后进行 过滤，收集滤液IV和固体残余物IV; 6) 将步骤5)所得固体残余物IV于900ml的双蒸水中浸泡2h，用1%的H2SO4调节 PH为7. 0,用旋转蒸发仪对其进行浓缩，再于60°C下将其烘干。然后配制酶解混合物，每 500ml该酶解混合物由下述物质组成：50g烘干了的固体残余物IVUOg纤维素酶、100ml OPTMSHBG、5mg氯霉素和2. 5mg卡那霉素；调整酶解混合物的pH为5.0,在温度为55°C， 摇床转速为220rpm下，反应60h，之后进行过滤，收集滤液V和固体残余物V。
[0028] 各步骤的固体回收率见表1。
【权利要求】
1. 一种利用甘蔗渣发酵产丁醇的预处理方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤： 1) 机械粉碎：对甘蔗进行切段至长度为5-lOcm，在65±2°C下烘干2天，然后进行粉碎， 过20目筛，得到粒径小于830 的甘蔗渣粉； 2) 液态热水处理：按固液质量体积比为250g/L，将步骤1)所得物于常温下在水中浸泡 12h,之后用蒸汽预加热45s,然后加入液态热水，在200±3°C下，反应lh,反应后进行过滤， 收集滤液I和固体残余物I; 3) 微波处理：调整步骤2)所得固态残余物I的湿度为40%，并置于反应器中，然后通入 氮气排除氧气，于4 °C下放置8-12h，之后将反应器置于微波热解炉中，在120 °C下反应7 min，再将反应所得物降温至常温，用90%乙醇对反应所得物进行浸洗，之后进行过滤，收集 滤液II和固体残余物II ; 4) 微生物分解：烘干步骤3)所得固体残余物II，之后加入培养液进行混合，再于121 °C下进行灭菌，灭菌后，调整其湿度为30%，以质量百分比计，再加入10%的分解菌菌液，于 30°C下发酵10 d，之后进行过滤，收集滤液III和固体残余物III ; 所述培养液的配方为：30 mg H3B03、20 mg MnC12. 4H20、185 mg ZnS04*7H20、20 mg Na2Mo04.2H20、280 mg FeS04*H20、200 mg CuS04、5 g NH4N03、1 g KH2P04、0. 15 g MgS04*H20、 0? 11 g CaCl2 和 1 L ddH20, pH 为 7. 0 ; 所述分解菌为 ATCC 1015、fricAoofe/ma reesei ATCC 26921 和 Penicillium janthinellum 中饱一种； 5) 氨处理：用ddH20对步骤4)所得固体残余物III进行清洗，之后将其烘干，以固液质量 比为1:2,将烘干后的固体残余物III与氨水混合，在O.IMPa压强下，于90 °C反应30 min，之 后进行过滤，收集滤液IV和固体残余物IV ; 6) 酶解处理：将所述固体残余物IV于水中浸泡2 h，调节pH为7. 0,浓缩后将其烘干， 然后配制酶解混合物，每500 ml该酶解混合物由下述物质组成：50 g烘干了的所述固体残 余物1￥、108纤维素酶、100 11110?1嫩51186、5 11^氯霉素和2.5 11^卡那霉素；调整酶解混合 物的pH为5. 0,在温度为55 °C，摇床转速为220rpm下，反应60 h，之后进行过滤，收集滤液 V和固体残余物V; 7) 将滤液I、滤液II、滤液III、滤液IV和固体残余物IV合并，留待SSF发酵，或将所述滤 液I、滤液II、滤液III、滤液IV和滤液V合并并旋蒸浓缩，留待SHF发酵。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法中，步骤4)中所用的分解菌为 Trichoderma reesei ATCC 26921 〇
【文档编号】C12R1/80GK104357491SQ201410744063
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年12月9日 优先权日:2014年12月9日
【发明者】谭芙蓉, 苏海锋, 何明雄, 胡启春 申请人:农业部沼气科学研究所