专利名称：重组人寡腺苷酸合成酶-1的制备方法
技术领域：
本发明一般的涉及重组人寡腺苷酸合成酶的制备方法，特别的涉及重组人寡腺苷酸合成酶-1的制备方法。
背景技术：
慢性病毒性肝炎(HBV)是全球性的重大疾病，每年有50-120万人死于该病及由其引起的肝硬化和肝癌等。作为一线药物，虽然干扰素α (interferon α，IFNa)在HBV的治疗中具有抗病毒及免疫调节的双重作用，但临床上只有25% -50%的HBV患者使用IFNa 治疗有效。因此如何在早期通过IFNa作用原理预测IFNa治疗HBV的疗效，从而确定 IFNa适宜治疗HBV患者的对象，正确指导临床用药就显得十分关键。2，，-5，寡腺苷酸合成酶 0，，5，-Oligoadenylate synthetase，OAS)，简称寡腺苷酸合成酶(OAS)，是Kerr等在IFN α处理过的细胞提取液中发现的酶。经研究发现OAS的激活或生成是IFNa在治疗HBV的过程中发生药理作用的重要信号通路，因此其高低水平可用于判断IFNα是否适宜于特定HBV患者的治疗。IFNa 处理人细胞，主要诱导产生 OASl 0O/46kDa)、0AS2 (69/7IkDa)和 0AS3 (IOOkDa)三种类型OAS蛋白。在0AS1、0AS2、0AS3基因的5，区域，包含一个干扰素激活反应元件(ISRE)。OASl有两种亚型，分子量分别为40和46kDa，均具有相同的N端346个氨基酸，称为一个OAS单位。40kDa 0AS1C末端包含18个氨基酸，而46kDa蛋白则有M个氨基酸的延伸。0AS2有分子量分别为69和71kDa的两种亚型，它们N端有683个氨基酸的同源序列，包含两个OAS单位，与OASl的346个氨基酸OAS单位相比，分别有41 %和53 %的同源性，分别还有4和44个不同氨基酸序列延伸。干扰素剂量依赖性诱导，至少可能产生4. 5、 3. 9,3. 3,2. 8kb四种mRNA转录形式。其中3. 3kb mRNA编码7IkDa 0AS2，其他三种具有不同的3，末端，但同样编码69kDa0AS2。与OASl和0AS2不同的是，0AS3由7kb大小的mRNA编码，只有一种亚型，包含三个OAS单位，与OAS 1相比，有42 %，47 %和60 %的同源性。OAS基因家族簇生于人12号染色体上的一段1301Λ的区域内，它们具有相同的转录方向，按照5’-0ASl-0AS3-0AS2-3’的顺序排布。同时，在人12号染色体上还存在一段编码P59大小，与OASl序列具有同源性的蛋白，该蛋白与OASl和0AS2均可以和抗0AS3多克隆抗体发生交叉抗原抗体结合反应。但是该蛋白没有催化活性，称为OAS类似蛋白(OASL)。虽然，IFN α可诱导产生各种类型的OAS蛋白，但是，在不同的细胞中，可能存在不同的细胞因子调节各种类型及其亚型的表达，所以各类型及其亚型存在表达差异。但是总体来说，OASl在三种类型的OAS中在人体内表达量是最高的，分布也是最广的。在IFNCI和细胞膜上的受体作用下，细胞合成大量无活性的0AS，当有双链RNA或者具有微二级结构的单链RNA存在时，OAS被激活而具有催化活性，它以ATP为底物，催化合成2’ -5’寡腺苷酸(2-5A)，2-5A特异性结合并激活核酸内切酶(RNAse L)降解病毒的 mRNA及细胞的RNA，从而发挥抗病毒的作用。临床研究表明通过在用药前后检测OAS活性在一定程度上可以预测患者使用IFN治疗的疗效，从而指导临床合理用药。目前OAS的活性检测多采用放射免疫的方法，但该方法存在繁琐、费时、花费高的缺点，因此在临床推广应用上有一定的困难。而采用ELISA的方法，则可克服这些缺点，从而可通过检测患者体内OAS含量水平而推算体内OAS活性，从而为IFNa的临床用药提供切实的依据。ELISA检测中抗体的制备十分关键，而抗体的优劣很大程度上取决于所用抗原 OAS蛋白。目前关于OAS抗原的制备方法，一类是使用真核表达系统，虽然可不带标签表达OAS蛋白，但表达量较低，且纯化方法繁琐，花费高，费时长且所得OAS蛋白纯度不高 ’另一类是使用原核表达系统，一般表达带标签的OAS蛋白，虽然通过一步或少数几步纯化就可得到纯度较高的OAS蛋白，但是标签的存在会对纯化得到的OAS的免疫原性产生影响， 且会影响抗体的筛选。例如2008年12月第12卷第12期的《中国实验诊断学》杂志上在 1491-1493页发表的文章“2’ -5’寡腺苷酸合成酶的表达及其单克隆抗体的制备与应用”就公开了带His Tag标签的OAS蛋白的纯化方法。中国专利申请200780035985. X公开了一种利用原核包涵体表达系统表达OAS蛋白及其突变体并对表达的OAS蛋白及其突变体进行纯化的方法，虽然可以不使用标签表达纯化OAS蛋白，但是由于变复性过程对OASl蛋白的纯度提高有限，因此在之后的层析纯化中至少需要两步层析，例如先用肝素柱层析，再用Wienyl FF HP层析。这样表达纯化的结果是步骤依然复杂，整个过程收率低。
发明内容
本发明的目的是提供一种OASl的制备方法，以在不添加有利于纯化的标签的情况下通过一步纯化原核表达系统表达的OASl蛋白，使其纯度达到95%以上，更好的符合免疫与筛选抗体的需要。为了实现上述目的，本发明采取的技术方案是1)化学合成OASl蛋白基因表达序列；2)用适宜的表达载体和上述OASl蛋白表达基因序列构建重组表达载体，并通过适宜的手段转入基因工程工程菌构建表达OASl蛋白的重组工程菌；3)发酵培养上述重组工程菌，通过适宜的方式产生包涵体形式表达的OASl ；4)对发酵培养收获的工程菌进行破碎处理后获得包涵体，对包涵体依次用含从低到高浓度的l-8mol/L的尿素的溶液进行洗涤，含每种浓度的尿素的溶液洗涤1次，共洗涤 2-4次后用含6-8mol/L盐酸胍与同下步阳离子交换层析相同缓冲溶液体系的溶液进行变性处理；5)变性液上阳离子交换层析柱进行纯化处理，洗脱后得到纯度在95%以上的 OASl变性蛋白。在重组工程菌的构建过程中所述的表达载体优选pET表达质粒，并更优选 pET23b(+)表达质粒，所述的基因工程工程菌优选大肠杆菌工程菌，并更优选大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS0
在发酵培养过程中培养基优选LB培养基，或在LB培养基的基础上进一步添加或优化成分组成的培养基，如F. William Studier在Protein expression and purification 2005 年第 41 卷第 27-34 页发表的文献 Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures 中 艮道的自动诱导培养基(Auto-induction medium)包涵体的破碎处理可以选择超声波破碎法、高压勻浆法、球磨法等，优选超声破碎法以减少细菌染色体内物质在破碎过程中的释放。在包涵体洗涤过程中，洗涤用的溶液中除含有l-8mol/L的尿素外，还优选含有去垢剂、螯合剂和/或还原剂等成分来增强洗涤效果。所述的去垢剂例如可选SDS、Triton X-100、吐温20、吐温80、NP-40等中的一种或几种的组合，优选Triton X-100 ；所述的螯合剂例如可选EDTA、EGTA等中的一种或几种的组合，优选EDTA ；所述的还原剂例如可选二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙醇、半胱氨酸等中的一种或几种的组合，优选DTT。包涵体的含尿素溶液洗涤应至少先用含l-2mol/L的低浓度的尿素的溶液洗涤1 次，洗涤时间0. 5-2小时，并最后用含6-8mol/L的高浓度的尿素的溶液洗涤1次，洗涤时间0. 2-0. 5小时，各步的洗涤时间随着洗涤溶液中尿素浓度的提高而缩短。优选在用含 l-2mol/L的低浓度的尿素的溶液先洗涤与在用含6-8mol/L的尿素的溶液最后洗涤之间再增加1-2步含中间浓度的尿素的溶液的洗涤，其洗涤时间应长于用含l-2mol/L的尿素的溶液的洗涤时间，但短于用含6-8mol/L的尿素的溶液的洗涤时间，且随洗涤用的含尿素溶液中尿素浓度的提高而减少洗涤时间。如果上述含尿素溶液洗涤所用的最后一种溶液中含有对之后盐酸胍变性及阳离子交换层析有影响的成分，则为了消除影响，优选用与之后变性处理和阳离子交换层析上样所使用的缓冲体系相同的缓冲溶液体系对洗涤后的包涵体溶液再洗涤1-2次。在包涵体变性用的溶液中除含有6-8mol/L的盐酸胍外，还优选含有同下步阳离子交换层析相同的缓冲溶液体系。例如下一步阳离子交换层析选择PH7. 5的Tris-HCl上样缓冲溶液体系，则在包涵体变性用的溶液中也应含有相同浓度的PH7. 5的Tris-HCl缓冲溶液体系，以省去变性后为了适应层析要求还需要对变性样品进行进一步的换缓冲液处理的步骤。在阳离子交换层析纯化过程中，由于OASl的等电点为8. 6，因此应选择低于此pH 的缓冲溶液体系进行层析操作以使OASl蛋白在层析过程中带正电荷，使其在上样过程中能吸附在层析填料上；而通过增加盐浓度或改变PH的梯度洗脱或分步洗脱可以纯化得到纯度在95%以上的OASl蛋白。所述低于等电点pH的缓冲溶液体系的pH可在5. 0-8. 0之间，优选在6. 0-8. 0之间，并最优选在7. 0-7. 5之间，这样的缓冲溶液体系的种类包括但不局限于Tris-HCl、PB(磷酸盐缓冲液)、HEPES、AAB (醋酸盐缓冲液)等，浓度在5-200mmol/ L之间。所述阳离子交换层析所用的填料包括但不局限于CM Sepharose FF,SP Sepharose FF、Source 15S、Source30S、SP Sepharose HP、Toyopearl CM650M、Toyopearl SP650M 等。 所述梯度洗脱可选择本领域技术人员公知的线性梯度、指数梯度、分段梯度等，优选线性梯度。在增加盐浓度的梯度洗脱中，构成梯度的为分别含有上样缓冲溶液体系但含不同浓度NaCl的两种溶液，其中一种不含有NaCl或含有0-0. lmol/L低浓度的NaCl，另一种含有 0. 5-lmol/L的NaCl，梯度洗脱时间在10-200分钟之间。在改变pH的梯度洗脱中，构成梯度的为分别含有不同PH的缓冲溶液体系的两种溶液，其中一种溶液就是上样缓冲溶液，另一种为PH比上样缓冲溶液低1-3的缓冲溶液，梯度洗脱时间在30-200分钟之间。在改变盐浓度的分步洗脱中在上样后可用含有上样缓冲溶液体系和0. 2-0. 5mol/L之间浓度NaCl 的溶液进行一步洗脱；在改变PH的分布洗脱中在上样后可用含有比上样缓冲溶液体系PH 低1-3的pH的缓冲溶液体系进行一步洗脱·。整个阳离子交换层析纯化过程使用的溶液中都应含有6-8mol/L的盐酸胍。阳离子交换层析纯化得到的OASl蛋白根据实际情况需要可直接用于免疫和检测，也可进行进一步的复性与复性后层析纯化处理。复性方法可以在本领域技术人员公知的稀释复性法、透析复性法或柱上复性法中选择一种。复性后的层析纯化主要是去除多聚体与异构体，可选择的层析种类包括离子交换层析、疏水层析、分子排阻层析等，优选疏水层析，所选择的填料包括但不局限于Phenyl Sepharose 6FF、Butyl Sepharose 4FF、 Source 15PHE,Source 15ETH、TSKgel Ether_5PW、TSKgel Phenyl_5PW 等，上样后用含两种不同浓度硫酸铵的缓冲溶液体系构成的梯度进行洗脱，收集峰面积最大的主峰即得单一结构的OASl复性蛋白。复性液的基本组成是pH在7. 0-10. 0之间的缓冲溶液，以保证复性所需的基本碱性环境，可以满足这种要求的缓冲溶液包括但不局限于Tris-HCl、硼酸钠缓冲液。为了防止复性过程中复性速度过快形成多聚体与异构体，需要在复性液中加入一些氧化型和还原型巯基试剂组成的氧化还原试剂对物质，如氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽组成的氧化还原试剂对。在此基础上还可进一步添加一些其它物质，如精氨酸、EDTA、金属离子及各种分子伴侣物质等。这些物质的选择及加量是本领域技术人员的公知常识，在现有技术中有很多报道，这里不再赘述。纯化得到的OASl蛋白可用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测纯度，以确定纯化的效果。
图1表示酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图谱。自左到右的泳道分别为酶切回收目的基因片段，Ikb Ladder DNA marker, DNA marker 的大小从上到下依次为 10000，8000，7000， 6000，5000，4000，3000，2000 和 IOOObp0图2表示构建pET2!3b(+)-OASl重组质粒的琼脂糖凝胶电泳图谱。自左到右的泳道分别为 Ikb Ladder DNA marker, pET23b (+) -OASl 重组质粒。DNA marker 的大小从上到下依次为 10000，8000，7000，6000，5000，4000，3000，2000 和 IOOObp0
具体实施例方式通过如下的实施例对本发明的实施作进一步说明，但本发明的实施方式并不局限于这些实施例。实施例1 表达载体的构建将上海生工生物工程技术服务有限公司合成的pBluescript II SK(+)_0AS1以 Nde I、EcoRI双酶切，酶切产物进行的琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。用Agarose Gel DNA Purification Kit回收目的基因，然后与经过相同酶切的表达载体pET23b (+) 连接，连接反应条件为IOx T4 buffer 2μ1，Τ4 DNA Ligase 1 μ 1，目的片段5 μ 1，载体12μ 1，16°C过夜连接。由此构建得到pET2!3b(+)-OASl重组质粒。该重组质粒用Nde I、 EcoRI双酶切后的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果如图2所示。实施例2 感受态大肠杆菌BL21 (DE3) pLys的转化及筛选将l-2ng 超螺旋重组质粒 pET23b (+) -OASl 加入 100 μ 1 大肠杆菌 BL21 (DE3) pLys 感受态细胞中，轻轻旋转混勻，冰浴静置30s，42°C热激60-90s，冰浴静置冷却2-3min，加入 900 μ 1 LB培养基(不含抗生素)，37°C振荡培养45min，混勻后吸取100 μ 1涂布于LB平板 (含1 μ g/ml氨苄西林钠)，37°C倒置培养12-16h。挑取单菌落进行培养，酶切及表达检测鉴定为阳性的克隆，以T7通用引物通过 ABI377测序仪进行全自动序列测定，测序结果与理论序列一致。实施例3 =OASl的LB培养基发酵培养与包涵体的获得将筛选得到的阳性工程菌经涂平板活化后挑选单菌落接种于含氨苄青霉素的LB 培养基中(每升用蛋白胨log、酵母粉5g、NaCl IOg配制，调节pH为7.0)，37°C、220转/ 分摇床摇瓶培养至OD6tltlnm达到0. 6-0. 8。然后以5%的体积接种量接种于50L的LB培养基中，在80L发酵罐中进行发酵培养(每升含0. 1 %的氨苄青霉素)，培养温度为37°C，培养过程中用氨水调节PH在6. 5-7. 5之间，用调节搅拌转速的方法控制溶氧值在3-5%之间。在 OD600nm达到1. 0后按质量体积比1 5000的比例加入IPTG IOg继续诱导培养3小时，诱导培养温度为35°C，并在此过程中向发酵罐中适当的补加LB培养基。诱导培养时间到后放罐室温5000转/分离心20分钟收集菌体，所得菌体用TE缓冲液(50mmol/L Tris-HCl, 5mmol/L EDTA, pH8. 0)洗涤离心两次以除去菌体粘附的发酵液中的杂质。取上述处理得到的菌体40g以1 15的质量体积比加入600ml TE缓冲液置超声波破碎仪上进行超声破碎，条件为打5秒，歇5秒，共60分钟，所得破碎液室温6000转/分离心20分钟弃上清，沉淀以1 10的质量体积比加入TE缓冲液洗涤离心两次得分离包含体。获得的包涵体经SDS-PAGE检测OASl蛋白表达量占菌体总蛋白量的11%左右。实施例4 =OASl的自动诱导培养基发酵表达与包涵体的获得将筛选得到的阳性工程菌经涂平板活化后挑选单菌落以6%的体积接种量接种 140L的自动诱导培养基于200L发酵罐中后进行发酵培养，发酵与后续包涵体获得条件如实施例3。获得的包涵体经SDS-PAGE检测OASl蛋白表达量占菌体总蛋白量的34%左右。上述自动诱导培养基每600ml的组成与配制方法如下1)配制 20mL lmol/L 的 MgSO4 MgSO4 · 7H204. 93g蒸馏水加至20mL2)配制 2OOmL 50X5052
权利要求
1.一种OASl蛋白的制备方法，其特征是依次包括如下步骤1)化学合成OASl蛋白基因表达序列；2)用适宜的表达载体和上述OASl蛋白表达基因序列构建重组表达载体，并将重组表达载体通过适宜的手段转入基因工程工程菌构建表达OASl蛋白的重组工程菌；3)发酵培养上述重组工程菌，通过适宜的方式产生包涵体形式表达的OASl；4)对发酵培养收获的工程菌进行破碎处理后获得包涵体，对包涵体依次用含从低到高浓度的l-8mol/L的尿素的溶液进行洗涤，含每种浓度的尿素的溶液洗涤1次，共洗涤2-4 次后用含6-8mol/L盐酸胍与同下步阳离子交换层析相同缓冲溶液体系的溶液进行变性处理；5)变性液上阳离子交换层析柱进行纯化处理，洗脱后得到纯度在95%以上的OASl变性蛋白。
2.如权利要求1制备方法，其特征是在用含从低到高浓度的l-8mol/L的尿素的溶液进行洗涤时至少先用含1-2 mol/L的低浓度的尿素溶液洗涤1次，洗涤时间0. 5-2小时，并最后用含6-8mol/L的高浓度的尿素溶液洗涤1次，洗涤时间0. 2-0. 5小时，各步的洗涤时间随着洗涤溶液中尿素浓度的提高而缩短。
3.如权利要求2制备方法，其特征是在用含1-2mol/L的低浓度的尿素溶液洗涤与在用含6-8 mol/L的高浓度的尿素溶液洗涤之间还有1-2步含中间浓度的尿素溶液的洗涤。
4.如权利要求1的制备方法，其特征是所述的含从低到高浓度的l-8mol/L的尿素的溶液中还含有去垢剂、螯合剂和/或还原剂。
5.如权利要求4的制备方法，其特征是所述的去垢剂为SDS、TritonX-100、吐温20、 吐温80、ΝΡ-40中的一种或几种的组合。
6.如权利要求4的制备方法，其特征是所述的螯合剂为EDTA、EGTA中的一种或两种的组合。
7.如权利要求4的制备方法，其特征是所述的还原剂为二硫苏糖醇、巯基乙醇、半胱氨酸中的一种或几种的组合。
8.如权利要求1-7之一的制备方法，其特征是对阳离子交换层析纯化得到的变性状态下的OASl蛋白进一步进行复性及复性后的纯化处理。
9.如权利要求1-7之一的制备方法，其特征是所述发酵培养选择自动诱导培养基。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，涉及重组人寡腺苷酸合成酶-1(OAS1)的制备方法，依次包括步骤1)化学合成OAS1蛋白基因表达序列；2)构建表达OAS1蛋白的重组工程菌；3)发酵培养产生包涵体形式表达的OAS1；4)获得包涵体并对其依次用含从低到高浓度的1-8mol/L的尿素的溶液进行洗涤，含每种浓度的尿素的溶液洗涤1次，共洗涤2-4次后用含6-8mol/L盐酸胍与同下步阳离子交换层析相同缓冲溶液体系的溶液进行变性处理；5)变性液上阳离子交换层析柱进行纯化处理，洗脱后得到纯度在95%以上的OAS1变性蛋白。采用该方法可在不添加有利于纯化的标签的情况下通过一步纯化原核表达系统表达的OAS1蛋白，使其纯度达到95%以上，更好的符合免疫与筛选抗体的需要。
文档编号C12N15/54GK102358897SQ20111033775
公开日2012年2月22日 申请日期2011年10月31日 优先权日2011年10月31日
发明者刘金毅, 周敏毅, 徐晨, 李孜, 程永庆 申请人:北京三元基因工程有限公司, 北京毕艾欧科技发展有限责任公司