钠/钾三磷酸腺苷酶及胆固醇相关的材料和方法

专利名称：钠/钾三磷酸腺苷酶及胆固醇相关的材料和方法
技术领域：
本发明涉及生物学、化学及医学领域。本发明具体涉及与心血管疾病相关的离子转运蛋白质、小的药物活性分子、研究工具、诊断学、试剂盒及处理方法。影响胆固醇介导的心血管疾病的强心类固醇拮抗剂及组合物在本发明领域内。其他领域，如物理学及生物化学也为本发明提供了框架。
背景技术：
本发明部分基于对钠/钾三磷酸腺苷合成酶(Na/K ATPase)的新结构构象及功能的阐明，尤其是对新的结合位点及相互作用的阐明。本发明提供了 Na/K ATPase及与Na/KATPase相互作用的化合物之间的惊人的结构及功能关系的应用。本发明提供了解决方案，其在化学上影响了 Na/K ATPase相互作用以及已知的上游和下游的调节子。Na/K-ATPase起初是作为位于质膜内的活性离子转运子发现的。功能性的Na/K-ATPase主要是由α和β亚基构成。α亚基为催化亚基，因为其包含配体及核苷酸结合位点。尽管其长期以离子转运子为人所知，近期的研究表明Na/K-ATPase除了其离子泵功能外，还能够进行多种其他功能。例如,发现Na/K-ATPase与Src激酶相互作用，形成功能性信号传导复合物，能够将细胞外信号转导进入而激活细胞内激酶级联。有趣的是，证明了进行信号传导的Na/K-ATPase主要位于专门的质膜微结构域(称为穴样内陷(“小窝”))并与穴样内陷标记物——窖蛋白-I蛋白质相互作用。窖蛋白-I蛋白质是一种 22-kD蛋白质，主要位于质膜中。除了其在穴样内陷的生物形成中的作用外，已知其在细胞胆固醇体内平衡中起作用。已经证明其与胆固醇以1:1的比率相结合，并参与胆固醇在质膜和细胞内细胞器之间的运输。进一步地，细胞胆固醇的耗尽使得窖蛋白-I重新分配至核周区域。在另一方面，Na/K-ATPase调控窖蛋白-I的细胞膜运输。Na/K-ATPase α I的梯度敲除导致窖蛋白-I在穴样内陷结构域内移动，并使得窖蛋白-I重新分配至核周区域。细胞胆固醇的耗尽使得Na/K-ATPase α I重新分配到穴样内陷之外。发明概述在其他广泛的实施方式中，提供了鉴定能够调制细胞内胆固醇浓度的测试组合物的方法，包括a.在胆固醇运输测试模型中将测试组合物与Na/K ATPase相接触；以及b.鉴定步骤a.是否产生细胞内胆固醇浓度的调制。还提供了鉴定能够调制质膜胆固醇浓度的测试组合物的方法，包括a.在胆固醇运输测试模型中将测试组合物与Na/K ATPase相接触；以及b.鉴定步骤a.是否产生细胞内胆固醇浓度的调制。优选的是上述权利要求的任何项，其中调制为细胞内胆固醇浓度的降低，其中测试模型为细胞培养物，其中测试模型为哺乳动物的，其中测试模型选自肝细胞；肾细胞；脑细胞；神经细胞；胰腺细胞；肺细胞；皮肤细胞；心脏细胞；啮齿动物细胞；人细胞；小鼠；大鼠；豚鼠；猴；以及人，其中测试模型选自以下的测试模型=NPCl病；病理性脂质积累；脉管疾病；心脏病；中风；超重；肥胖；糖尿病；代谢综合征；甲状腺功能紊乱；药物副作用；关节硬化；心力衰竭；心脏疾病；阿尔茨海默病；帕金森病；亨廷顿病；泰萨二氏病；以及神经退行性疾病。
·
还提供了鉴定能够调制胆固醇浓度的测试组合物的方法，包括a.将测试组合物与Na/K ATPase相接触；以及b.鉴定步骤a.是否产生对Na/K ATPase的α I亚基的CRAC结构域的结合。优选的那些方法中，步骤a.是以选自体外和体内的形式完成的。还提供了影响细胞中胆固醇转运的方法，包括影响Na/K ATPase的胆固醇结合活性。优选的是那些方法，其中Na/K ATPase的胆固醇结合活性以以下方式受到影响降低；增加；消除；阶段性破坏；以及阶段性增强。还提供了在需要这种改善的器官中改善由于病理性细胞内胆固醇累积导致的神经退行的方法,包括降低Na/K ATPase的胆固醇结合活性。还提供了治疗Cl型Neumann Pick病的方法,包括专门降低Na/K ATPase结合胆固醇的能力，其中降低是以选自以下的方式完成的拮抗Na/K ATPase的α I亚基的CRAC结构域；以及抑制Na/K ATPase的α I亚基的CRAC结构域。还提供了鉴定能够治疗胆固醇相关疾病状态的组合物的方法，包括a.将测试组合物与Na/K ATPase相接触；以及b.鉴定步骤a.是否产生对胆固醇结合Na/K ATPase的α I亚基的CRAC结构域的能力的拮抗。优选的是所描述的那些方法，其中疾病状态选自NPCl ;病理性脂质积累；脉管疾病；心脏病；中风；超重；肥胖；糖尿病；代谢综合征；甲状腺功能紊乱；药物副作用；关节硬化 ’心力衰竭;心脏疾病；阿尔茨海默病；帕金森病；亨廷顿病；泰萨二氏病；以及神经退行性疾病。还提供了在胆固醇运输测试模型中下调Na/K ATPase的方法，包括在测试模型中耗尽质膜胆固醇浓度。还提供了在胆固醇运输测试模型中将Na/K ATPase的α I亚基重新分配到细胞内区室的方法，包括在测试模型中耗尽质膜胆固醇浓度。还提供了在胆固醇运输测试模型中影响窖蛋白-I的运输和表达的方法，包括下调质膜的Na/K ATPase的α I亚基。还提供了治疗NPCl病的方法，包括改变Na/K ATPase的α I亚基的表达，以改善NPCl病的症状。本领域技术人员在参考附随的图示并阅读以下优选实施方式的详述本发明的多个方面后将清楚本发明的多个方面。附图简述本专利或申请文件可以包含一个或多个彩色图片及/或一张或多张照片。带有彩色图片及/或照片的本专利或专利申请出版物的副本将由美国专利商标局在收到请求及必要的支付费用时进行提供。
图I. Μβ -⑶引起的膜胆固醇的急性耗尽下调了 Na/K-ATPase α I。在无血清培养基中用IOmM M β-⑶处理LLC-PKl细胞，在37°C进行lh，洗涤，并在洗涤后的细胞于无血清培养基中培养0、6和24h后收集细胞。

图1A.测量不同时间点的细胞裂解物中胆固醇含量，根据蛋白质水平进行调整并比较。图1B.代表性的Western印迹显示了 Na/K-ATPase α I、胰岛素受体β亚基及α-微管蛋白(用作上样对照)的水平。结合四次独立的实验得出定量数据，表示为平均值土SE. *，Ρ〈0. 05。图1C.显示了未处理细胞及Μβ-⑶处理的细胞中Na/K-ATPase α I的细胞内分布的代表性共聚焦图像。图2.慢性胆固醇耗尽下调了 Na/K-ATPase α I。将LLC-PK1细胞在含有10%FBS(对照)或10%无血清或10%无脂蛋白FBS的DMEM中培养48h，裂解并测量α I亚基以及α -微管蛋白，如图2Α的图所示，胆固醇情况在图2Β中显示。结合四次独立的实验得出定量数据，表示为平均值土 SE. *，Ρ〈0. 05。图3.化合物U18666A耗尽质膜胆固醇并特异性下调Na/K-ATPase α I。图3Α.将LLC-PKl细胞以不同剂量的U18666A处理24h，然后进行菲律宾菌素处理(上图)及α I免疫染色(下图)。代表性的图片显示了 U18666A化合物对胆固醇及Na/K-ATPase α I的细胞分配的剂量依赖性影响。图3Β.三次独立实验的代表性Western印迹显示了细胞处理48h后，U18666A对Na/K-ATPase α I、窖蛋白-I以及α -微管蛋白的影响(上图)。三次独立实验的代表性Western印迹分别显示了细胞受U18666A处理24h和48h后，U18666A对Na/K-ATPase α I、胰岛素受体β亚基及α -微管蛋白的蛋白质水平的影响(下图)。标尺20 μ m。U，U18666A。图3C.细胞表面的Na/K-ATPase通过3H-乌本苷结合进行定量。图4.膜胆固醇耗尽导致对Na/K-ATPase α I的细胞内吞。图4Α.将LLC-PK1细胞以10 μ g/ml的U18666A处理24h。如本文所描述的方法提取总RNA并进行定量RT-PCR以探测α I和GAPDH的mRNA。数据来自三次独立实验。图4B.在暴露于不同剂量的U18666A以24小时之前，将LLC-PKI细胞以IO μ g/ml放线菌酮处理Ih。然后固定细胞并就Na/K-ATPasea I进行免疫染色。显示了代表性的共聚焦图像。CHX，放线菌酮。U，U18666A。图4C.在暴露于5 μ g/ml U18666A以另外的24h之前，将LLC-PKl细胞以YFP-a I转染24h。将细胞固定并以菲律宾菌素对胆固醇进行染色，显示了 YFP-a I、胆固醇的代表性共聚焦图像和合并图片。箭头指向YFP-Ci I和胆固醇的共定位。相同的实验重复至少三次。标尺20 μ m。图4D.在暴露于5 μ g/ml U18666A以24h之前，将LLC-PKl细胞以RFP_rab7转染24h。之后，固定细胞并以Na/K-ATPase α I进行免疫染色。显示了 α I染色、RFP_rab7的代表性共聚焦图像以及合并图片。箭头指向RFP_rab7和α I的共定位。相同的实验重复至少三次。标尺20μηι。图5. NBD-胆固醇直接与纯化的Na/K-ATPase相互作用。从猪肾髓质中制备纯化的Na/K-ATPase膜样品(PKE )。图5A. PKE样品的SDS-PAGE凝胶显示有两条带，Na/K-ATPasea I和β 1，如箭头所显示的。图5Β.在4 °C下将PKE用IOmM Μβ-CD或IOmMM β -⑶/ImM胆固醇处理Ih。测量不同处理的PKE中的胆固醇含量。图5C.胆固醇及NBD-胆固醇的结构示意图。将Μβ-⑶处理的ΡΚΕ(200ηΜ)与不同剂量的NBD-胆固醇一同孵育。以473nm或295nm的激发在530nm处检测NBD信号(图OT)或FRET信号(图5E)。显示了三次独立实验中代表性的剂量依赖饱和曲线。NBD-CH，NBD-胆固醇。将62. 5nM的NBD-胆固醇与不同剂量的经Μβ -⑶处理的PKE —同孵育。以473nm或295nm的激发在530nm处检测NBD信号(图5F)或FRET信号(图5G)。显示了三次独立实验中典型的剂量依赖饱和曲线。图5H.用GST下拉测定来纯化GST和带GST标签的蛋白质。纯化的蛋白质进行SDS-PAGE电泳并用考马斯亮蓝染色。显示了代表性的考马斯亮蓝染色的凝胶。图51.将62. 5nM NBD-胆固醇与不同剂量的纯化的蛋白质一同孵育。以295nm的激发在530nm处检测FRET信号。显示了三次独立实验中典型的剂量依赖饱和曲线。图5J.将IOOnM纯化的蛋白质与不同剂量的NBD-胆固醇一同孵育。以295nm的激发在530nm处检测FRET信号。显示了三次独立实验中典型的剂量依赖饱和曲线。图5K.将IOOnM PKE与30nM NBD-胆固醇相混合，然后加入不同剂量的胆固醇以竞争NBD-胆固醇对PKE的结合。显示了 FRET信号，其为胆固醇剂量增加的结果。图6.胆固醇调控的α I膜运输和表达需要胆固醇/α I相互作用。将野生型大鼠α I-修复的细胞(图6Α)或胆固醇结合结构域突变体大鼠α I-修复的细胞(图6Β)以不同 剂量的U18666A化合物处理24h，并进行菲律宾菌素(上图)和Na/K-ATPase α I (下图)染色。标尺20μηι。图6C.四次独立实验的代表性Western印迹显示了 10 μ g/ml U18666A及不同剂量的TAT-CRAC对细胞处理24h后，LLC-PKl细胞中大鼠Na/K-ATPase α I以及α_微管蛋白的水平。定量数据显示于下文，表示为平均值土S.E. 相比于未处理对照，p〈0. Ol0图7.对BALB/cnpcnih/npcnih小鼠的靶标器官中Na/K-ATPase α I的下调。图7Α.代表性Western印迹显示了 NPCl敲除对脑Na/K-ATPase α I、α 2、α 3及胰岛素受体β亚基的影响。在胰岛素受体杂交中较低的条带旁的星号表示非特异性条带。图7Β.显示了 NPC1+/+和NPC1+/+小鼠的肝脏样品中Na/K-ATPase α I和胰岛素受体β的代表性Western印迹结果。来自5NPC1+/+和5NPC1+/+小鼠的所有Western印迹结果都进行定量，显示于右图并表示为平均值土SE. **，ρ〈0·01。发明详述本发明人研究了细胞胆固醇耗尽是否导致细胞表面Na/K-ATPase α I的下调，随后导致窖蛋白-I进行重新分配。在本发明中，发明者证明了质膜胆固醇的耗尽导致对Na/K-ATPasea I的细胞内吞及下调。如Cl型Niemann-Pick(NPCl)病中所显示出的对细胞内胆固醇运输的破坏与细胞表面Na/K-ATPase α I的耗尽相关。另外，Na/K-ATPase α I能够通过其N末端胆固醇相互作用基序与胆固醇直接相互作用。α I-胆固醇相互作用影响胆固醇耗尽诱导的α 下调。最后，证明了 NPCl小鼠模型的肝脏和脑中的Na/K-ATPaseal有下调。由于已知Na/K-ATPase参与细胞生长及存活，因此本发明提供了新的解释，将胆固醇运输缺陷与NPCl病中大量的神经退行相关联。本发明提供了质膜胆固醇调控细胞表面的Na/K-ATPase α I亚基含量这一发现的实际应用。质膜中胆固醇耗尽导致细胞表面α I的细胞内吞及降低。α I表达的降低不仅在体外培养的LLC-PKl细胞中观察到，也在来自NPCl突变体小鼠的脑和肝细胞中得到体内的验证。有趣的是，已知Na/K-ATPase对神经元细胞生长和存活至关重要。因此，这些发现为脂质储存障碍如NPCl病中的神经退行效应的分子机制提供了新的解释。细胞表面Na/K-ATPase受到质膜胆固醇的调控。胆固醇富集于专门的质膜脂质结构域——穴样内陷中。维持穴样内陷需要有胆固醇的存在，因为胆固醇耗尽导致穴样内陷结构的破坏。此外，细胞表面胆固醇的降低动员穴样内陷标记物窖蛋白-1，并将其从穴样内陷重新分配至细胞质。上述胆固醇耗尽效应与Na/K-ATPase α I对穴样内陷窖蛋白-I蛋白质的敲除效应有惊人的类似之处。因此，有人提出胆固醇耗尽可以下调细胞表面Na/K-ATPasea 1，后者有助于窖蛋白-I的重新分配。该命题得到本发明的数据的支持。例如，不管是细胞胆固醇的急性或慢性耗尽都导致Na/K-ATPase的下调(图I和2)。此外，细胞内胆固醇运输抑制剂U18666A (其破坏晚期内体/溶酶体和质膜之间的运输)也下调细胞表面Na/K-ATPase α I (图3)。由于U18666A处理的细胞中总细胞胆固醇未显示显著差异，因此这些结果清楚地表示是质膜胆固醇含量调控了细胞表面Na/K-ATPase。这种胆固醇耗尽效应似乎是特异性针对Na/K-ATPase α I的，因为胰岛素受体表达水平并未改变(图3Β)。在这一点上，检查胆固醇耗尽如何下调细胞表面α I很有意义。免疫染色表明了在胆固醇耗尽时α I从细胞表面向细胞内区室的重新分配(图IC和3Α)。这些观察提示有两种可能的情况或者是新合成的α I无法转运到细胞表面，或者是表面α I在表面胆固醇耗尽后受到细胞内吞。随后的研究指向第二种情况。首先，α I的转录在U18666A处理的 细胞中看上去很正常，因为mRNA水平未变化。第二，对蛋白质翻译进行普遍的阻断未阻止α I的重新分配。最后，α I在U18666A处理后与胆固醇以及晚期内体标记物Rab7共定位(图4)。总而言之，这些数据有力地提示了质膜蛋白质库调控细胞表面的α 含量。质膜胆固醇库的降低导致对细胞表面αI的细胞内吞和下调。Na/K-ATPase α I直接与胆固醇相互作用，且胆固醇调控的α I细胞内吞依赖于α I-胆固醇相互作用。我们的之前的研究表明Na/K-ATPase α I和胆固醇之间的膜分布有相互调控；这两种广泛表达的分子可以直接相互作用。其他的研究显示膜胆固醇含量影响了 Na/K-ATPase的活性，甚至有一项研究提出了 Na/K-ATPase和胆固醇之间有直接结合。然而，在本研究之前，缺少所述问题的直接证据。在本发明中，发明者相反地使用了 FRET分析以阐明该问题，并证明纯化的猪肾Na/K-ATPase直接与胆固醇类似物——NBD-胆固醇相互作用(图5)。本发明人进一步将胆固醇结合位点定位于α I亚基内的NT，并显示了 CRAC基序对于结合是至关重要的(图5)。有趣的是，似乎CRAC基序对于胆固醇调控的α I的细胞内吞很重要，因为定点诱变造成此基序的破坏使得α I对质膜胆固醇耗尽不敏感。进一步地，向细胞中加入膜通透性的CRAC肽保护α I使之不受U18666A的下调，这与上述观点一致(图6)。因为CRAC突变体α I正常定位在质膜内(图6Β)，所以α I-胆固醇相互作用不大可能稳定细胞表面的Na/K-ATPase0相反，胆固醇可能加速Na/K-ATPase进入脂後的分选,这介导了 Na/K-ATPase的细胞内吞。有人提出脂筏(鞘脂类和胆固醇的集合体)对于蛋白质运输中的蛋白质分选很重要。此外，显示一种类型的脂筏——穴样内陷能浓缩Na/K-ATPase并介导其内吞作用。考虑到本发明中的结果，令人信服的是α I-胆固醇相互作用是在应答多种信号时对Na/K-ATPase进行恰当的分选进入脂筏如穴样内陷并产生随后的细胞内吞作用的关键。Na/K-ATPase α I为潜在的质膜胆固醇感受子。作为所有哺乳动物中至关重要的分子，胆固醇水平受到细胞的严格调节。研究最多的细胞胆固醇调控机制包括处于ER膜内的HMG-CoA还原酶和SCAP-SREBP2复合物，它们的蛋白质丰度和活性依赖于ER胆固醇库。然而，大多数细胞胆固醇在质膜中定位并起作用，ER胆固醇库受到质膜胆固醇含量的控制。因此，有人提出存在质膜胆固醇感受子，其调控质膜和内膜之间的胆固醇运输。本发明人研究了 Na/K-ATPase α I是否为质膜胆固醇感受子。首先，像胆固醇一样，α I在所有哺乳动物中广泛表达并主要定位于质膜内。第二，α I通过调控窖蛋白-I (一种参与细胞内胆固醇运输的α蛋白质)的膜运输而控制质膜和细胞内区室之间的胆固醇运输。第三，胆固醇可与α I相互作用，且质膜胆固醇的耗尽下调其细胞表面的水平。最后，在体内α I的减少导致质膜胆固醇的降低，这随后减少了 ER胆固醇库，并激活SREBP2通路。因此，建立了 α 调控细胞胆固醇含量典型的负反馈循环。NPCl病中的Na/K-ATPase。NPCl病特征为细胞内胆固醇在晚期内体/溶酶体中的积累，这被认为是由内膜和质膜间胆固醇运输缺陷所导致。但是该疾病的主要问题在于中枢神经系统中大量神经元细胞的死亡。然而，还不很了解这两个事件如何相联系。在另一方面，Na/K-ATPase是神经系统中一种至关重要的分子，因为其是维持静止膜电位的主要驱动力之一。近期的研究已经表明其还调控细胞生长，并在细胞存活/细胞死亡中起关键作用。Na/K-ATPase α亚基中的突变与神经退行相联系。因为用U18666A处理细胞能模拟NPCl病的表型，U18666A对Na/K-ATPase α I的下调使得我们研究NPCl动物模型中的α I 表达水平。有趣的是，本发明人发现了 α I水平在NPCl突变体小鼠的脑和肝脏中都有下降(图7)。该现象似乎特异性针对α I分子，因为另一种质膜信号传导蛋白质(胰岛素受体)的表达水平不受U18666A或NPCl突变的影响(图3和7)。进一步地，NPCl脑中的其他两种α异构体(α2和α 3)未显示出显著差异(图7Α)。因此，NPCl脑中α I的特异性下调为细胞内胆固醇积累和神经退行之间的联系提供了新的可能的解释。这提高了我们对细胞胆固醇代谢的认识，也促进了关于Na/K-ATPase α I作为治疗神经退行疾病新型靶标的新的药物开发。质膜胆固醇耗尽导致LLC-PKl细胞中Na/K-ATPase α I的下调。先前的研究已经表明细胞胆固醇或Na/K-ATPase的耗尽将窖蛋白_1重新分配至核周区域，且胆固醇的耗尽将Na/K-ATPase α I重新分配出穴样内陷结构域。本发明人研究了细胞胆固醇水平的变化是否影响Na/K-ATPase的表达和重新分配，而调控合适的窖蛋白_1分配。首先，将细胞用胆固醇耗尽药物环糊精(Μβ-⑶)进行处理。因为其对胆固醇有高的亲和力，Μβ-⑶能够特异性将胆固醇从质膜中抽取出来，这极大地降低了细胞表面胆固醇库并重新分配窖蛋白-I。此外，本发明人实验室先前的工作证明用IOmM M β-⑶在37 °C下处理LLC-PKl细胞30-60分钟显著地降低了质膜胆固醇库。因此，本发明人在这些研究中使用了相同的条件。在M β -⑶处理耗尽细胞胆固醇后，本发明人洗去药物并通过将细胞在无血清培养基中孵育来补充细胞胆固醇。然后，本发明人在不同时间点收集细胞裂解物并检查蛋白质和胆固醇水平。如图IA中所示，Μβ -CD造成的细胞胆固醇耗尽导致α I水平有 40%的降低。有趣的是，Μβ-CD处理还导致细胞胆固醇水平的类似的降低(图1Β)。细胞恢复后6小时，α I和胆固醇还保持在类似的低水平，这表示细胞需要更长时间恢复。然而，细胞恢复24小时后，α I和胆固醇水平回到对照水平(图IA和1Β)。应当注意的是α I和胆固醇水平的变化都显示了在胆固醇耗尽和补充过程中类似的形式，这表明细胞α I水平与胆固醇水平正相关。此外，胆固醇耗尽对α I表达的影响不是对所有膜蛋白质的普遍影响，因为另一种质膜蛋白质胰岛素受体在胆固醇耗尽和补充过程中没有变化(图IA和1Β)。为进一步验证此结果，本发明人在Μβ-⑶的胆固醇耗尽后进行了 α 免疫染色。与Western印迹数据相一致，本发明人在来自Μβ-CD处理的细胞的质膜中检测到了较低的α 信号。此外，本发明人在Μβ-CD处理的细胞中观察到很多细胞内α I信号，这表示胆固醇耗尽导致α 重新分配到细胞内区室(图1C)。上述数据表明急性胆固醇耗尽下调质膜的α I水平。为测试慢性胆固醇耗尽是否具有类似的效应，本发明人接着将细胞于作为对照培养基的正常培养基(加血清的DMEM)及无血清培养基(只有DMEM)或无脂蛋白培养基(加了物质蛋白血清的DMEM)中培养48小时。正如所预期的，在两种胆固醇耗尽的培养基中培养细胞导致细胞胆固醇水平的减少(图2Α)。因此，α I水平在两种胆固醇耗尽的培养基中培养的细胞中有降低(图2Β)。进一步地，α I和胆固醇水平在无脂蛋白培养基中显示了类似的减少百分比再一次提示了 αI水平与细胞胆固醇水平正相关。为了进一步确认细胞表面胆固醇库调控了质膜α 1，本发明人用细胞内胆固醇运输抑制剂U18666A处理细胞。所述U化合物为一种破坏内膜和细胞表面之间细胞内胆固醇运输的两亲分子，这导致胆固醇在晚期内体/溶酶体内的积累(模拟了 NPCl突变体细胞的表型)。用U18666A处理LLC-PKl导致游离胆固醇从质膜向细胞内区室的重新分配。α I信 号在质膜中减少但在细胞内区室中增加，这与胆固醇分布形式相关(图3Α)。进一步地，U18666A对α I表达的下调是剂量和时间依赖性的(图3Β)。与胆固醇耗尽类似，U化合物对α I表达的作用似乎不是对所有质膜蛋白质的普遍作用，因为胰岛素受体含量在U18666A处理后保持不受干扰(图3Β)。最后，为确证U18666A下调了细胞表面α I,本发明人进行了 3Η-乌本苷结合测定。结果验证了质膜胆固醇的减少导致细胞表面α I的下调(图3C)。最后，与表面α I调控窖蛋白-I的运输和表达这一观点一致，U18666A也下调了窖蛋白-I的蛋白质水平(图3Β)。总而言之，这些数据证明αI蛋白质水平受到质膜胆固醇水平的调控。质膜胆固醇耗尽导致Na/K-ATPase α I的细胞内吞。为探索质膜胆固醇耗尽对α I分布及表达的作用的分子机制，本发明人进行了下列实验。首先，对于α I下调的一个可能的解释是质膜胆固醇耗尽降低了 α I的合成。为测试这种可能性，本发明人从对照及U18666A处理的细胞中提取总mRNA并进行定量PCR分析。如图4A所示，a ImRNA水平相对于对照未显示出差异，这表示质膜胆固醇耗尽可能不影响α I的从头合成。另一个可能性是其破坏了新合成的α I从内质网向质膜的运输。因此，其局限在特定的细胞区室内，因为本发明人在Μβ-CD和U18666A处理的细胞中观察到更多的细胞内α I信号(图IC和3Α)。为测试这种可能性，本发明人在向细胞加入U18666A之前用蛋白质合成抑制剂环糊精处理细胞。如图4Β所示，环糊精阻断蛋白质从头合成没有阻止U18666A诱导的α I向细胞内区室的重新分配。此结果表明U18666A可能诱导了细胞表面α I的内化作用。因为U18666A的处理也导致了胆固醇在细胞内区室的积累(图3Α)，本发明人下一步检查了 α I和胆固醇是否局限在相同的细胞区室。对游离胆固醇的染色操作流程需要与αI的那些不同的固定试剂，而且不可能在相同视野中观察胆固醇和内源αI二者。为了解决这个问题，本发明人用YFP-α I转染LLC-PKl细胞，随后进行U18666A处理和胆固醇染色。这些结果证明在U18666A处理后大多数内化的α I与游离胆固醇共定位(图4C，箭头指向共定位区域)。根据文献，U18666A处理导致游离胆固醇在晚期内体/溶酶体中的积累。因此，本发明人研究了 αI是否受到细胞内吞并与胆固醇一同在晚期内体/溶酶体中积累。本发明人在加入U18666A之前用RFP标签的Rab7 (晚期内体/溶酶体的标记物)对LLC-PKl细胞进行瞬时转染。如图4D中所示，在未处理的对照细胞中大多数位于质膜内，没有检测到α I和Rab7之间的共定位。然而，U18666A处理导致了大量的细胞内α I积累，其中大多数明显的与Rab7信号共定位(箭头指向共定位区域)。这确认了在U18666A处理时α I积累于晚期内体/溶酶体之内。总而言之，在LLC-PKl细胞中通过阻断其细胞内运输而造成的质膜胆固醇耗尽不仅诱导了 αI的细胞内吞，还导致αI在晚期内体/溶酶体内的积累。Na/K-ATPase α I能够在体外通过N末端胆固醇结合基序与胆固醇直接相互作用。如本发明人先前证明的，质膜中的Na/K-ATPase α I调控细胞胆固醇分布。在另一方面，本研究的数据显示质膜胆固醇也调控Na/K-ATPase α I的膜分布。因此，本发明人研究了这两种广泛表达的分子是否与彼此有直接的相互作用。为测试这项命题，本发明人首先使用一种已经建立很好的方法从猪肾外髓质获得细胞膜片段内的纯化的Na/K-ATPase。
为确保此方法能有效地运行，将纯化的猪肾酶(PKE )样品进行SDS-PAGE凝胶电泳并用考马斯亮蓝溶液对胶进行染色。如图5A所示，在胶中检测到两条带，具有Na/K-ATPase α I和β I的对应大小。进一步的Western印迹分析确认了上方条带代表α I亚基而下方条带代表β I亚基(数据未显示)。由于纯化的细胞膜片段含有大量胆固醇，其可能已经饱和了 Na/K-ATPase上的结合位点，所以大多数胆固醇成分由Μβ -CD抽取出来(图5Β)。为研究Na/K-ATPase和胆固醇之间的结合，使用一种胆固醇类似物，25-[N-[ (7-氮-2-1，3-苯并恶二唑-4-基)甲基]氨基]-27-降胆甾醇(NBD胆固醇)进行结合测定。NBD-胆固醇在之前就用于研究蛋白质-胆固醇相互作用。和胆固醇不同，NBD-胆固醇当在473nm处激发时能够发射峰在 530nm处的荧光信号，因为在C25位置处的甲基基团被NBD基团取代(图5C)。在水溶液中，其荧光大部分淬灭了。然而当其结合于蛋白质并暴露于疏水环境时，荧光信号会增加。此外，其具有比胆固醇(30nM)更高的临界微团浓度( 650nM)，这样，在结合测定中可使用较高浓度的NBD-胆固醇。将200nM的PKE与不同剂量的NBD-胆固醇一同孵育并测量NBD荧光信号，观察到NBD-胆固醇的剂量依赖性饱和曲线(图OT)。Kd值为100nM-200nM。胆固醇竞争了NBD-胆固醇和纯化的PKE之间的结合(图5K)。为进一步验证这些结果代表了脂类-蛋白质相互作用而不是脂类-脂类相互作用，本发明人测量了荧光共振能量转移(FRET)信号。当NBD-胆固醇结合于蛋白质时，氨基酸色氨酸可在295nm处激发并且在 350nm处发射，这与NBD-胆固醇的激发谱相重叠。在将PKE与NBD-胆固醇一同孵育并在295nm处激发Trp后，本发明人在530nm处检测到FRET信号的NBD-胆固醇剂量依赖性饱和曲线(图5E)。为验证这些结果，本发明人将62. 5nM的NBD-胆固醇与不同浓度的PKE —同孵育。与前述实验相一致，将NBD-胆固醇与PKE —同孵育产生了 NBD信号(图5F)和FRET信号(图5G) 二者的PKE剂量依赖性饱和曲线。总而言之，这些观察表明纯化的Na/K-ATPase能够在体外直接与NBD-胆固醇相互作用。为进一步解析Na/K-ATPase中的胆固醇结合位点，本发明人搜索文献并发现在大多数已知的胆固醇结合蛋白质中都鉴定有一段胆固醇识别/相互作用氨基酸序列及一致模式(CRAC)。随后的研究进一步表明CRAC负责胆固醇结合且将CRAC中间的关键氨基酸Tyr突变完全消除了其的胆固醇结合亲和力。在本发明人搜索人Na/K-ATPase α I的一级序列时，发现在N末端结构域(NT)内有一个CRAC (Leu51-Arg61)且此CRAC基序在哺乳动物种属之间是高度保守的。为测试NT是否是Na/K-ATPase-胆固醇相互作用的关键因素，本发明中首先将谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签连接于NT肽并通过GST下拉测定法纯化GST-NT (图5H)。然后进行了如图5E NBD-胆固醇结合测定。如图51和5J所显示的，GST自身不诱导出FRET信号，而GST-NT诱导了剂量依赖性的FRET信号饱和曲线，表明NT具有胆固醇结合亲和力。进一步地，本发明人将CRAC中间的氨基酸Tyr53突变为Ser53并且进行了同样的NBD-胆固醇结合测定。有趣的是，突变体NT-Y53S未显示出胆固醇结合亲和力。这表明NT中的CRAC是胆固醇结合的关键因素。Na/K-ATPase α I的CRAC对于胆固醇调控的α I膜运输至关重要。前节的数据表明Na/K-ATPase α I的NT能够在体外通过CRAC与胆固醇相互作用。因此，探索CRAC是否在胆固醇耗尽诱导的α I细胞内吞中起作用很有意义。首先，本发明人用U18666A处理野生型大鼠α I修复的细胞——AAC-19，并对α I和胆固醇二者进行染色。如图6Α所示，LLC-PKl细胞中的野生型大鼠α I与内源猪α I作用相同(图3Α)。质膜胆固醇的耗尽以剂量依赖的形式导致α I的细胞内吞作用。接着，本发明人通过定点诱变方法将大鼠a ICRAC中关键的Tyr55(对应猪α I中的Tyr53)突变为Ser55并生成稳定的突变体大鼠α I修复的细胞系(PY-17-Y55S)。在细胞系建立时，本发明人对其进行了在AAC-19细胞上进行的相同实验。有趣的是，与野生型大鼠α I相反，所述Y55s突变体大鼠α I未显示对U18666A处理的应答的明显细胞内吞作用(图6Β)。为确认这些发现，本发明人合成了具有阳性电荷的前导肽HIV-TAT的CRAC，将其标记于CRAC的N末端以使TAT-CRAC肽具有细胞通透性。理论上，将TAT-CRAC肽加入细胞可能通过竞争抑制打断内源α I和胆固醇之间的结合。如图6C所示，TAT-CRAC肽以剂量依赖的形式修复了 U18666A引起的α I下调作用。总而言之，胆固醇调控的Na/K-ATPase α I膜运输依赖于胆固醇-α I相互作用。Na/K-ATPase α I在NPCl突变体小鼠的肝脏和脑中下调。如上文提到的，两亲化合物U18666A对细胞的处理导致NPCl-样表型。U18666A处理的细胞中Na/K-ATPase α I的下调促使我们检测此作用是否在生理学上于NPCl疾病相关。因为NPCl疾病是一种脂类储存障碍并显示有显著的中枢神经系统的神经退行，所以本发明人聚焦于两种最相关的器官脑和肝脏。如图7Α所示，Na/K-ATPase α I蛋白质表达水平在NPC-/-小鼠脑中下降了 大约40%，这与我们前面的体外数据相一致。因为脑细胞表达α亚基的三种异构体，所以本发明人检测了 α2和α3的蛋白质水平。α2水平有少量但不显著的增加，而α 3在对照与NPCl小鼠脑中未显不任何差异。进一步地，与前文数据相一致，胰岛素受体蛋白质水平在NPCl小鼠脑中没有改变(图7Α)。因此，似乎NPCl病中的胆固醇运输缺陷特异性影响α I的表达。最后，发现了 α 水平在NPCl小鼠肝细胞中也减少至一半，而胰岛素受体未显示出明显的差异(图7Β)。然而，α I下调的作用似乎为器官特异性的，因为心脏和肾脏中的α I水平未显示出显著差
巳
实施例
实施例I.材料细胞培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购自Invitrogen。抗体及其来源如下用于Western印迹分析的小鼠单克隆抗-Na/K-ATPase α I抗体(a6F)购自爱荷华大学的发育研究杂交瘤细胞库(Developmental Studies Hybridoma Bank)。用于免疫细胞化学的小鼠单克隆抗-Na/K-ATPase α I 抗体购自 Upstate Biotechnology Inc. (Lake Placid,NY)。小鼠单克隆抗-胰岛素受体β亚基抗体、兔多克隆抗-窖蛋白-I抗体、小鼠单克隆抗_α -微管蛋白抗体及所有二抗来自Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)。兔多克隆抗-Na/K-ATPase α 2抗体(HERED)及兔多克隆抗-Na/K-ATPase α 3抗体由德克萨斯科技大学的 Thomas A. Pressley 博士惠赠。Optitran 硝酸纤维素膜来自 Schleicher&Schuell。增强型化学发光SuperSignal试剂盒购自Pierce。Μ β -⑶、环糊精和菲律宾菌素获自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。U18666A 化合物来自 Cayman Chemical (Ann Arbor,MI)。Lipofectamine 2000 购自 Invitrogen。Amplex Red Cholesterol Assay Kit 购自Molecular Probes, Inc. (Eugene, 0R)o [3H]乌本苷来自 PerkinElmer Life Sciences(Waltham, MA)。NBD-胆固醇来自 Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)。QuikChange 定点诱变试剂盒获自Stratagene (La Jolla，CA)。TAT-CRAC肽是高纯度(>95%)合成的。通过高效液相色谱质谱确定其特性及纯度。细胞培养LLC-PKl细胞获自美国模式培养物保藏中心。大鼠α I修复的Na/K-ATPase α I敲除细胞(AAC-19)以及窖蛋白-结合基序突变体大鼠α I修复的Na K-ATPase α I敲除细胞(mCBM)衍生自如前文所描述的LLC-PKl细胞。所有细胞都培养于含有10%胎牛血清、青霉素(100 单位 /ml) / 链霉素(100 μ g/ml)的 Dulbecco's modified Eagle’s 培养基(DMEM)中，在5%C02-增湿培养箱中培养。除非另有说明，在细胞达到100%融合度时，将其进行24小时的血清饥饿并用于实验。质粒构建物及转染大鼠a ICRAC突变体(Tyr55至Ser55)是通过在如前文所生成的pRc/CMV-alAACml质粒上进行基于PCR的定点诱变而产生。然后使用相同的先前描述的操作流程建立Y55S突变体α I敲入细胞系。pEYFP-a I质粒是按之前描述的方法生成的。RFP_rab7质粒获自WWW. addgene. org。表达GST融合蛋白质的质粒构建物是按前文所描述的方法由PGEX-4T-1而制备的。GST-NT (Alal至Serl60)和GST-NT-Y55S表达载体基于猪肾Na/K-ATPasea I亚基的序列而构建。所有构建物都通过DNA测序得到确认。在转染时，使细胞生长到大约70%的融合度并按前文所述的方法使用Lipofectamine 2000转染对应的质粒。随后的实验在转染后34小时进打。实验动物BALB/c 遗传背景的 NPCl+/-小鼠购自 The Jackson Laboratory。NPCl+/+ 和NPCl-/-小鼠是通过交配两只NPCl+/-小鼠产生的。从尾巴活检组织获得DNA并用于基于PCR的基因分型。所有小鼠在12-h的黑夜/白天循环中生长并自由摄取标准食物。所有动物实验都在同窝小鼠间进行。所有步骤都得到托雷多大学医学院校区的学院动物饲养和使用委员会的认可。所有小鼠都在10周龄时处死，小心地解剖出包括脑、肝脏、心脏和肾脏的器官，并进行称重。所有组织立即冷冻于液氮并储存于_80°C用于进行Western印迹分析。
实施例2.方法Μβ -⑶的细胞胆固醇耗尽以及恢复使LLC-PKl细胞在6cm培养皿中生长至100%融合度，并进行24小时的血清饥饿。然后对细胞用IOmM M β-⑶处理I小时。下一步，将Μβ-⑶从细胞中移除，让细胞在DMEM中分别恢复0、6、24小时，然后在RIPA缓冲液中用细胞刮刮下细胞。用细胞裂解物进行蛋白质测定及Western印迹分析。Western 印迹分析细胞裂解物及组织匀浆的蛋白质浓度使用来自Bio-Rad (Hercules, CA)的Protein Assay Kit进行测量。将等量的蛋白质加样至凝胶并在10%的SDS-PAGE上分离，转移至Optitran膜，并用对应的抗体进行探测。用ECL试剂盒检测蛋白质信号。通过免费软件Image J对Western印迹条带的灰度进行分析。 免疫细胞化学Na/K-ATPase α I的染色按先前描述的方法进行。简言之，将细胞进行24小时的血清饥饿并在盖玻片上进行处理。然后用冰冷的甲醇对细胞进行30min的固定并用来自Invitrogen的Signal Enhancer进行封闭。接着，将细胞与单克隆抗-Na/K-ATPase α I抗体在4°C孵育过夜。用PBS洗涤三次，加入二抗Alex 488-缀合的抗小鼠抗体并在室温孵育3小时。洗涤盖玻片，并封片，用Leica共聚焦显微镜拍照。胆固醇测定及菲律宾素染色胆固醇测定及菲律宾素染色是按Chen等人Regulation of intracellularcholesterol distribution by Na/K-ATPase. Journal Biological Chemistry, Volume284，pages 14881-14890(2009)的方法进行的。[3H]乌本苷结合[3H]乌本苷结合是按 Tian 等人在 Changes in sodium pump expressiondictate the effects of ouabain on cell growth, Journal of Biological Chemistry,14921-1429(2009)中描述的方法进行的。定量RT-PCR对Na/K-ATPase α I和GAPDH的mRNA水平进行定量RT-PCR，是按照Tian等人在 Changes in sodium pump expression dictate the effects of ouabain on cellgrowth, Journal of Biological Chemistry, 14921-1429 (2009)中描述的方法进行的。NBD-胆固醇结合测定NBD-胆固醇结合测定是按 Petrescu 等人 Steroidogenic acute regulatoryprotein binds cholesterol and modulates mitochondrial membrane sterol domandynamics, Journal Biological Chemistry, Volume 276, pages 36970-36982 (2001)中描述的方法进行。Na/K-ATPase和GST-融合蛋白质的纯化使用Jorgensen方法从猪肾外髓质中纯化出Na/K-ATPase。GST-融合蛋白表达于大肠埃希氏菌BL21 (Invitrogen)中并使用谷胱甘肽珠子进行纯化。用洗脱缓冲液(IOmM还原性谷胱甘肽，0. l%Triton X_100，50mM Trish，pH 8. 0)将可溶的GST-融合蛋白质从谷胱甘肽珠子上洗脱。将洗脱液在包含0. l%Triton X-100,50mM Tris-HCl，pH 8. O的缓冲液中透析移除残留的谷胱甘肽。统计学分析数据表示为平均值土S. E0使用学生t检验进行统计学分析，在p〈0. 05时的显著性可接受。实施例3.对可能调制细胞内胆固醇的测试组合物的测定本发明人从对照和U18666A-处理的细胞中提取总mRNA并进行定量PCR分析。如图4A所示，α I的mRNA水平相比于对照没有差异，这表明质膜胆固醇耗尽可能不影响α 的从头合成。在一项独立的实验中，本发明人还在U18666A加入细胞之前对细胞进行蛋白质合成抑制剂环糊精的处理。如图4Β所示，环糊精阻断蛋白质从头合成并未阻止U18666A诱导的α I向细胞内区室的重新分配。该结果表明U18666A可能诱导细胞表面α I的内化作用。 因为U18666A处理也导致胆固醇在细胞内区室的积累(图3Α)，所以本发明人下一步检查了αI和胆固醇是否局限在相同的细胞区室。对游离胆固醇的染色操作流程需要与α 的那种不同的固定试剂，而且不可能在相同视野中观察胆固醇和内源α 二者。为了解决这个问题，本发明人用YFP-α I转染LLC-PKl细胞，随后进行U18666A处理和胆固醇染色。这些结果表明在U18666A处理后大多数内化的α I与游离胆固醇共定位(图4C，箭头指向共定位区域)。在一项独立的实验中，本发明人还在加入U18666A之前用假RFP标签的Rab7 (晚期内体/溶酶体的标记物)对LLC-PKl细胞进行瞬时转染。如图4D中所示，在未处理的对照细胞中大多数α I位于质膜内，没有检测到α I和Rab7之间的共定位。然而，U18666A处理导致了大量的细胞内α I积累，其中大多数明显的与Rab7信号共定位(箭头指向共定位区域)。这确认了在U18666A处理时α I积累于晚期内体/溶酶体之内。实施例4.对可能调制质膜胆固醇的测试组合物的测定首先，将细胞用胆固醇耗尽药物B-环糊精(Μβ_⑶)进行处理。因为其对胆固醇有高的亲和力，Μβ -CD能够特异性将胆固醇从质膜中抽取出来，这极大地降低了细胞表面胆固醇库并重新分配窖蛋白-I。此外，本发明人实验室的先前的工作表明用IOmM Μβ-CD在37°C下处理LLC-PKl细胞30-60分钟显著地降低了质膜胆固醇库。因此，本发明人在这些研究中使用了相同的条件。在用Μβ -⑶处理耗尽细胞胆固醇后，本发明人洗去药物并通过将细胞在无血清培养基中孵育补充回细胞胆固醇。然后，本发明人在不同时间点收集细胞裂解物并检查蛋白质和胆固醇水平。如图IA中所示，Μβ -⑶造成的细胞胆固醇耗尽导致α I水平 40%的降低。有趣的是，Μβ-CD处理还导致细胞胆固醇水平的类似的降低(图1Β)。细胞恢复后6小时，α I和胆固醇还保持在类似的低水平，这表示细胞需要更长时间恢复。然而，细胞恢复24小时后，α I和胆固醇水平回到对照水平(图IA和1Β)。应当注意的是α I和胆固醇水平的变化在胆固醇耗尽和补充过程中都显示了类似的形式，这表明细胞αI水平与胆固醇水平正相关。此外，胆固醇耗尽对α I表达的影响不是对所有细胞膜蛋白质的普遍影响，因为另一种质膜蛋白质胰岛素受体在胆固醇耗尽和补充过程中没有变化(图IA和1Β)。为进一步确认此结果，本发明人在Μβ_⑶的胆固醇耗尽后进行了 α I免疫染色。与Western印迹数据相一致,本发明人在来自Μβ -CD处理的细胞的质膜中检测到了较低的α I信号。此外，本发明人在Μβ-CD处理的细胞中观察到很多细胞内α I信号，这表示胆固醇耗尽导致α I重新分配到细胞内区室(图1C)。上述数据表明急性胆固醇耗尽下调质膜的α I水平。为测试慢性胆固醇耗尽是否具有类似的效应，本发明人接着将细胞于作为对照培养基的正常培养基(加血清的DMEM)及无血清培养基(只有DMEM)或无脂蛋白培养基(加了物质蛋白血清的DMEM)中培养48小时。正如所预期的，在两种胆固醇耗尽的培养基中培养细胞导致细胞胆固醇水平的减少(图2Α)。因此，α I水平在两种胆固醇耗尽的培养基中培养的细胞中降低(图2Β)。进一步地，α I和胆固醇水平在无脂蛋白培养基中显示了类似的减少百分比再一次提示了 αI水平与细胞胆固醇水平正相关。为了进一步确认细胞表面胆固醇库调控了质膜α 1，本发明人用细胞内胆固醇运输抑制剂U18666A处理细胞。所述U化合物为一种破坏内膜和细胞表面之间细胞内胆固醇运输的两亲分子，这导致胆固醇在晚期内体/溶酶体内的积累，模拟了 NPCl突变体细胞的表型。用U18666A处理LLC-PKl导致游离胆固醇从质膜向细胞内区室的重新分配。α I信 号在质膜中减少但在细胞内区室中增加，这与胆固醇分布形式相关(图3Α)。进一步地，U18666A对α I表达的下调是剂量和时间依赖性的(图3Β)。与胆固醇耗尽类似，U化合物对α I表达的效应似乎不是对所有质膜蛋白质的普遍影响，因为胰岛素受体含量在U18666A处理后保持不受干扰(图3Β)。最后，为确证U18666A下调了细胞表面α 1，本发明人进行了 3Η_乌本苷结合测定。结果验证了质膜胆固醇的减少导致细胞表面α I的下调(图3C)。最后，与表面α I调控窖蛋白-I的运输和表达这一观点一致，U18666A也下调了窖蛋白-I的蛋白质水平(图3Β)。虽然本发明的描述中参考了多种的及优选的实施方式，然而本领域技术人员应当理解的是可以做出多种变化，而且等价物可以置换其中的成分而不偏离本发明的本质范围。此外，可作出许多修饰以使具体的情况或材料能适合于本发明的教义，而不偏离其本质范围。因此，不预期的是将本发明限制在本文公开的用于实行本发明的具体实施方式
，而是本发明会包括所有符合权利要求范围的实施方式。本文用来阐明本发明或提供关于本发明时间的其他细节的出版物和其他材料通过引用并入本文，简便起见，将其在下文的参考目录中提供。本文提到的任何文档的引用不预期为认可前述的任何项为相关的在先技术。关于这些文档日期的所有陈述或对其内容的表示都是基于申请人可得的信息，不包含任何对这些文档的日期或内容正确性的认可。
权利要求
1.鉴定能够调制细胞内胆固醇浓度的测试组合物的方法，包括 a.在胆固醇运输测试模型中将测试组合物与Na/KATPase相接触；以及 b.鉴定步骤a.是否产生细胞内胆固醇浓度的调制。
2.鉴定能够调制质膜胆固醇浓度的测试组合物的方法，包括 a.在胆固醇运输测试模型中将测试组合物与Na/KATPase相接触；以及 b.鉴定步骤a.是否产生细胞内胆固醇浓度的调制。
3.上述任何一项权利要求的方法，其中的调制为细胞内胆固醇浓度的降低。
4.上述任何一项权利要求的方法，其中测试模型为细胞培养物。
5.上述任何一项权利要求的方法，其中测试模型为哺乳动物。
6.上述任何一项权利要求的方法，，其中测试模型选自肝细胞；肾细胞；脑细胞；神经 细胞；胰腺细胞；肺细胞；皮肤细胞；心脏细胞；啮齿动物细胞；人细胞；小鼠；大鼠；豚鼠；犬；猴；以及人。
7.权利要求5的方法，其中测试模型选自以下的模型NPC1病；病理性脂质积累；脉管疾病；心脏病；中风；超重；肥胖；糖尿病；代谢综合征；甲状腺功能紊乱；药物副作用；关节硬化；心力衰竭；心脏疾病；阿尔茨海默病；帕金森病；亨廷顿病；泰萨二氏病；以及神经退行性疾病。
8.鉴定能够调制胆固醇浓度的测试组合物的方法，包括 a.将测试组合物与Na/KATPase相接触；以及 b.鉴定步骤a.是否产生对Na/KATPase的α I亚基的CRAC结构域的结合。
9.权利要求8的方法，其中步骤a.是以选自体外和体内的形式完成的。
10.影响细胞中胆固醇运输的方法，包括影响Na/KATPase的胆固醇结合活性。
11.权利要求10的方法，其中Na/KATPase的胆固醇结合活性以以下方式受到影响降低；增加；消除；阶段性破坏；以及阶段性增强。
12.在需要这种改善的器官中改善由于病理性细胞内胆固醇累积导致的神经退行的方法，包括降低Na/K ATPase的胆固醇结合活性。
13.治疗Cl型NeumannPick病的方法，包括降低Na/K ATPase结合胆固醇的能力。
14.权利要求13的方法，其中降低是以选自以下的方式完成的拮抗Na/KATPase的α I亚基的CRAC结构域；以及抑制Na/K ATPase的α I亚基的CRAC结构域。
15.鉴定能够治疗胆固醇相关疾病状态的组合物的方法，包括 a.将测试组合物与Na/KATPase相接触；以及 b.鉴定步骤a.是否产生对胆固醇结合Na/KATPase的α I亚基的CRAC结构域的能力的拮抗。
16.权利要求15的方法，其中疾病状态选自NPC1;病理性脂质积累；脉管疾病；心脏病；中风；超重；肥胖；糖尿病；代谢综合征；甲状腺功能紊乱；药物副作用；关节硬化；心力衰竭；心脏疾病；阿尔茨海默病；帕金森病；亨廷顿病；泰萨二氏病；以及神经退行性疾病。
17.在胆固醇运输测试模型中下调Na/KATPase的方法，包括在测试模型中耗尽质膜胆固醇浓度。
18.在胆固醇运输测试模型中将Na/KATPase的α I亚基重新分配到细胞内区室的方法，包括在测试模型中耗尽质膜胆固醇浓度。
19.在胆固醇运输测试模型中影响窖蛋白-I的运输和表达的方法，包括下调质膜的Na/K ATPase 的 a I 亚基。
20.治疗NPCl病的方法，包括改变Na/KATPase的a I亚基的表达，以改善NPCl病的症状。
全文摘要
本发明部分基于钠/钾三磷酸腺苷合成酶(Na/K ATPase)的新结构构象及功能的阐明,尤其是对新的结合位点及相互作用的阐明。本发明提供了Na/K ATPase及与Na/K ATPase相互作用的化合物之间的数种惊人的结构及功能关系的应用。这些结构和关系的公开提供了对在化学上影响Na/K ATPase相互作用以及已知的其上游和下游的调节子的理解及解决方案。
文档编号A61K31/704GK102858346SQ201180010295
公开日2013年1月2日 申请日期2011年1月13日 优先权日2010年1月13日
发明者谢子建, 陈逸良, 王浩杰 申请人:托莱多大学