专利名称：人类液泡膜型腺苷三磷酸酶D亚基编码基因pRb－BP76的制作方法
技术领域：
本发明涉及与抗癌基因编码产物pRB相作用的人体蛋白质编码基因pRb-BP76及它在人体各组织中的表达和在染色体上的定位，以探索肿瘤诊断和治疗的新途径。
Rb基因是人类报道最早的肿瘤抑制基因，其正常的编码蛋白不仅是一种重要的细胞增殖抑制因子，还广泛参与了细胞分化、细胞凋亡、抑制肿瘤形成等多种复杂的生理过程(Mulligan，G.，TIG，1998，14223-229；Knudsen，E.S.et al.，Genes & Dev.，1998，122278-2292；Luo，R.X.，etal.，Cell，1998，92463-473；Macleod，K.，Curr.Opin.Genet.Dev.，1999，9(1)31-39)其核心环节就是DNA与蛋白质，蛋白质与蛋白质相互作用，Rb发生作用主要是通过影响转录来实现的，它通过与多种转录因子的相互作用对转录发生正调控或负调控。
正常的Rb具有抑癌功能，但Rb基因的一些缺失或突变所造成的突变体由于丧失了对细胞增殖、分化等的正常控制而导致细胞癌变。常见的由于Rb突变所导致的肿瘤有视网膜母细胞瘤、骨肉瘤、小细胞肺癌、前列腺癌和膀胱癌(Paggi，M.G.，et al.，J.Cell Biochem.，1996，62418-430)。此外，Rb还是一些小的DNA肿瘤病毒的病毒抗原(如腺病毒的E1A蛋白、SV40的大T抗原)的早期作用因子。因此，Rb与各蛋白质因子之间的相互作用显得尤为重要，已成为人们注意的焦点。过去几年来，人们已经克隆了许多编码产物能够与pRB相作用的基因(Weinberg，R.A.，Science，1991，2541138-1146；Cavanaugh，A.H.，et al.，Nature，1995，374177-180；Wang，C.Y.，et al.，Science，1993，2601330-1335；Dunaief，J.L.，et al.，Cell，1994，79119-130；Woitach，J.T.，et al.，Nat.Genet.，1998，19(4)371-374；Simons，A.，et al.，Oncogene，1997，14(2)145-155)，一方面研究这些因子的结构特征，寻找它们与pRB的作用规律，另一方面致力于研究它们的功能。这两方面的研究为阐明pRB参与细胞各项生理过程的调控机制奠定了基础。同时研究Rb与其他蛋白质因子的相互作用，有助于探讨肿瘤的发病机制，为肿瘤的诊断和治疗提供新的设想和方案。
酵母双杂交系统是近年来发展起来的一种在体内研究蛋白质之间相互作用的体系(Chien，C.T，et al.Proc.Acad.SCi.USA，1991，889578-9582)该系统的原理是基于酵母中的一种转录因子GAL4功能的重建。GAL4分子含有两个相对独立的功能域DNA结合区和转录激活区。把欲验证存在相互作用的两个蛋白质(X和Y)的基因分别与GAL4的DNA结合区和转录激活区融合，再将这两个融合表达载体转入特殊的酵母细胞中，此酵母菌的染色体上，已整合了可被GAL4的DNA结合区所识别并结合的位点及下游报告基因(HIS3或LacZ)，如果两个蛋白质之间发生相互作用，报告基因就能表达。蛋白质Y也可是一个基因文库，这样就可以从中筛选与蛋白质X相互作用的新蛋白质基因。
为此，本发明的目的是提供一种能与抗癌基因编码产物pRB相作用的人体蛋白质编码基因pRb-BP76全长cDNA序列，并表明它在8种正常人组织中的表达水平及在染色体上的定位，在肿瘤的诊断和治疗上具有潜在的应用意义。
本发明是一种与抗癌基因编码产物pRB相作用的人类新基因pRb-BP76，它是根据上述情况，利用pRB融合GAL4的DNA结合区，作为蛋白质X，以人胎脑cDNA文库融合GAL4的转录激活区为蛋白质Y，筛选到了一个人类新基因pRb-BP76。经PCR方法钓到了全长cDNA片段，测定了全序列，并进行了染色体定位和在8种正常人组织中的Northern杂交分析，为研究pRB的作用原理开辟了新的途径。
本发明以pRB为靶分子，利用酵母双向杂交系统从人胎脑cDNA文库中筛选到多个阳性克隆，测定各阳性克隆的cDNA序列，得到一个长度为1052bp的cDNA序列(序列表SEQ ID NO1)，该cDNA序列编码一个182个氨基酸的肽段(序列表SEQ ID NO2)，包括一段3’非编码区，但5’编码区不全。Northern杂交的结果表明，该基因全长mRNA约为1.4kb。查询EST数据库进行拼接，在3’端又延伸了一段。在已经拿到的pRb-BP76序列的5’端反向设计一个引物作为3’引物，用人胎脑cDNA文库的载体臂上的一段序列作为5’引物(序列表SEQ ID NO5)进行PCR反应，得到一段约0.6kb的扩增片段，测定其核苷酸序列后，可与前面的片段共同拼接成pRb-BP76基因全长cDNA，长度为1403bp(序列表SEQ ID NO3)。其中5’非翻译区为85bp，编码区为744bp，编码247个氨基酸组成的蛋白质(序列表SEQ ID NO4)，3’非翻译区为674bp。(图1)经基因数据库检索发现，完整的pRb-BP76与牛的V型ATPase的D亚基编码基因有很高的同源性，其中核酸的同源性为87％，蛋白质水平的同源性为99％，确定pRb-BP76为人类的V型ATPase的D亚基编码基因。
进行8种正常人组织mRNA的Northern杂交分析，结果表明该基因在各种组织中广泛表达(图2)，但在心脏、脑、肾脏和胰脏这样一些分泌活动较为旺盛的组织中表达量要更高一些。
本发明还利用辐射杂交细胞系法(Radiation hybrid，简称RH)进行了pRb-BP76基因的染色体定位分析。在pRb-BP76基因3’非编码区合成一对引物(序列表SEQ ID NO6)，对RH Mapping Kit中的83个辐射杂交细胞株的模板进行PCR反应，实验结果在计算机中进行连锁和统计分析，将该基因定位于第14号染色体的q23.1-24.1区段。
本发明的优点与功能1、提供一种全新的pRb-BP76基因的cDNA序列，它的编码产物能与抗癌基因的产物pRB相作用，在肿瘤的诊断和治疗上具有应用意义。
2、pRb-BP76在8种正常人组织中广泛表达，显示该基因在细胞内具有重要功能作用，可作为诊断指标。
3、本发明已将pRb-BP76基因定位在14号染色体的q23.4-24.1区段，宜进行染色体上基因的连锁分析，应用于疾病的诊断。
4、因为V型ATPase的D亚基在ATP水解和质子泵的偶联中发挥作用，而迄今为止尚未有文献报道pRB参与此过程，因此确定pRb-BP76为人类V型ATPase的D亚基编码基因，这为进一步了解Rb更多的功能提供了线索。
本发明通过以下附图和实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。
图1.pRb-BP76cDNA片段的克隆图中280-1331位即SEQ ID NO1中的核苷酸序列图中1-630位为PCR延伸出的pRb-BP76的5’端图中1331bp后的序列为在EST库中拼接出的序列图2.以pRb-BP76为探针，人不同组织mRNA的Northern杂交图中 1.心脏 2.脑 3.胎盘 4.肺脏5.肝脏 6.骨胳肌 7.肾脏 8.胰脏实施例1酵母双向杂交系统筛选pRb-BP76cDNA片段将pRB与GAL4 DNA结合结构域融合的表达质粒和人胎脑cDNA文库与GAL4转录激活结构域融合的表达质粒(均购自CLontech公司)共转化于酵母HF7c中。靶蛋白质粒的营养筛选标记为TRPl基因，文库质粒的营养筛选标记为LEUZ基因，如果靶蛋白与被检测蛋白之间有相互结合，就激活HF7c中报告基因HIS3的表达，因此细胞就能在缺少Leu、Trp和His的基本培养基上生长。在1.5×106个转化子(在L-和W-平板上)中获得295个能在SD(W-L-H-)平板上生长的转化子。为了排除假阳性克隆，测定这些克隆的半乳糖苷酶活力，发现有57个克隆在X-gal平板上显蓝色。将阳性转化子接种于缺少Leu的培养液中培养，抽取质粒DNA，转化大肠杆菌，再制备质粒DNA。将该质粒与靶蛋白质粒转化到另一酵母菌株SFY526中，在X-gal平板上均显蓝色，表明有半乳糖苷酶活力，证明确为阳性克隆。对57个阳性克隆中的cDNA文库质粒分别进行限制性内切酶图谱分析和部分DNA序列测定，57个阳性克隆仅代表6个独立的基因，其中一个cDNA片段长度为1052bp(序列表SEQ IDNO1)，在人的基因文库中未查询到同源序列，但它与牛的V型ATPase的D亚基编码基因同源性很高，它代表一个新的人类基因，命名为pRb-BP76。
实施例2.pRb-BP76全长cDNA的克隆和测序查询EST数据库进行拼接，在3’端又延伸了一段。在已经拿到的pRb-BP76序列的5’端反向设计一个引物作为3’引物，用人胎脑cDNA文库的载体臂上的一段序列作为5’引物进行PCR反应(序列表SEQ ID NO5)，得到一段约0.6kb的扩增片段，测定其核苷酸序列后，可与前面的片段共同拼接成pRb-BP76基因全长cDNA(图1)，长度为1403bp(序列表SEQ ID NO3)。其中5’非翻译区为85bp，编码区为744bp，编码247个氨基酸组成的蛋白质(序列表SEQ ID NO4)，3’非翻译区为674bp。
完整的pRb-BP76与牛的V型ATPase的D亚基编码基因有很高的同源性，其中核酸的同源性为87％，蛋白质水平的同源性为99％，确定pRb-BP76为人类的V型ATPase的D亚基编码基因。
实施例3 pRb-BP76在人正常组织中表达分析将固定有人8种正常组织mRNA的尼龙膜(CLontech公司)，放入杂交管内，加入5ml 68℃预热的快速杂交液(CLontech公司)，68℃预杂交1小时，加入变性的同位素标记的pRb-BP76的0.6kb片段，68C杂交2小时。取出杂交管洗膜，2×SSC，0.05％SDS中室温10分钟，0.1×SSC，0.1％ SDS 50℃洗两次，共30分钟。将膜置于滤纸上晾干，压片，即得图2。
实施例4 pRb-BP76在染色体上的定位在pRb-BP76cDNA的3’非编码区合成一对引物(序列表SEQ ID NO6)，对RH Mapping Kit(购自Stanford SHGC)中的83个辐射杂交细胞系的模板进行PCR反应10μl体系，含25ng模板，1.5mM Mg2+，200μM dNTP，两种引物各8pM，1μl10×PCR Buffer，1U Taq酶，反应条件为95℃ 4分钟热启动后按94℃25秒，55℃30秒，72℃30秒的顺序进行35个循环的反应，最后在72℃继续延伸7分钟。电泳分析PCR结果，其PCR产物为230bp，有相应扩增产物的记为1，无扩增产物的记为0，按顺序将结果排成串，送到SHGC网站中在计算机中进行连锁和统计分析，找出与之连锁的已经定位的标记基因，从而将该基因定位于第14号染色体的q23.1-24.1区段。
序列表(1)一般信息(I)申请人中国科学院上海生物化学研究所(II)发明名称人类液泡膜型腺苷三磷酸酶D亚基编码基因pRb-BP76(III)序列数6(2)SEQ ID NO1信息(I)序列特性(A)长度1052个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(II)分子类型cDNA(III)序列描述SEQ ID NO1TGCCTTTTCA CTAGCTGAAG CCAAGTTCAC AGCAGGTGAC TTCAGCACTA CAGTTATCCA 60AAATGTCAAT AAAGCGCAAG TGAAGATTCG AGCGAAGAAA GATAATGTAG CAGGTGTTAC120TTTGCCAGTA TTTGAACATT ACCATGAAGG AACTGACAGT TATGAACTGA CTGGTTTAGC180CAGAGGTGGG GAACAGTTGG CTAAATTAAA GAGGAATTAT GCCAAAGCAG TGGAACTACT240GGTGGAACTA GCTTCTCTGC AGACTTCTTT TGTTACTTTG GATGAAGCTA TTAAGATAAC300CAACAGGCGT GTAAATGCCA TTGAACATGT CATCATTCCC CGGATTGAAC GTACTCTTGC360TTATATCATC ACAGAGCTGG ATGAGAGAGA GCGAGAAGAG TTCTATAGGT TAAAGAAAAT420ACAAGAGAAG AAAAAGATTC TAAAGGAAAA TCTGAGAAGG ACTTGGAGCA AAGGAGAGCA480GCTGGAGAGG TGTTGGAGCC TGCTAATCTT CTGGCTGAAG AGAAGGACGA GGATCTTCTA540TTTGAATAAT CTTTCCTGTT CTGGTTCTTT GAGAAACCCT AACACTGGCT TCATTTTAAT600TCACAGTGTG TAGGTTTGAT TTGTGTGGCT ATTTATTTTT TGGCCTAAGA ATTTCACTGG660TTGTAAAATT TACCTAGATG TCTATTTATG GGATTACTTT TGCAGAATCA TAATTTAGCA720ACCATTTATC ATGGATGAAA 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Phe Tyr 135Arg Leu Lys Lys Ile Gln Glu Lys Lys Lys Ile Leu Lys Glu Lys 150Ser Glu Lys Asp Leu Glu Gln Arg Arg Ala Ala Gly Glu Val Leu 165Glu Pro Ala Asn Leu Leu Ala Glu Glu Lys Asp Glu Asp Leu Leu 180Phe Glu 182(4)SEQ ID NO3信息(I)序列特性(A)长度1403个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(II)分子类型cDNA(III)序列描述SEQ ID NO3AGGAAGACAC TGTGGAGGCC AGTTCTGGAG CTATTGCAGC CTCGGTTGCC CGGCCGGGGA --26CCCGAGCCGA AAAGTTATCG TCAGAATGTC GGGCAAAGAC CGAATTGAAA TCTTTCCCTC35GCGAATGGCA CAGACCATCA TGAAGGCTCG TTTAAAGGGA GCACAGACAG GTCGAAACCT95CCTGAAGAAA AAATCTGATG CCTTAACTCT TCGATTTCGA CAGATCCTAA AGAAGATAAT 155AGAGACTAAA ATGTTGATGG GCGAAGTGAT GAGAGAAGCT GCCTTTTCAC TAGCTGAAGC 215CAAGTTCACA GCAGGTGACT TCAGCACTAC AGTTATCCAA AATGTCAATA AAGCGCAAGT 275GAAGATTCGA GCGAAGAAAG ATAATGTAGC AGGTGTTACT TTGCCAGTAT TTGAACATTA 335CCATGAAGGA ACTGACAGTT ATGAACTGAC TGGTTTAGCC AGAGGTGGGG AACAGTTGGC 395TAAATTAAAG AGGAATTATG CCAAAGCAGT GGAACTACTG GTGGAACTAG CTTCTCTGCA 455GACTTCTTTT GTTACTTTGG ATGAAGCTAT TAAGATAACC AACAGGCGTG TAAATGCCAT 515TGAACATGTC 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NO4信息(I)序列特性(A)长度247个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(II)分子类型蛋白质(III)序列描述SEQ ID NO4Met Ser Gly Lys Asp Arg Ile Glu Ile Phe Pro Ser Arg Met Ala15Gln Thr Ile Met Lys Ala Arg Leu Lys Gly Ala Gln Thr Gly Arg30Ash Leu Leu Lys Lys Lys Ser Asp Ala Leu Thr Leu Arg Phe Arg45Gln Ile Leu Lys Lys Ile Ile Glu Thr Lys Met Leu Met Gly Glu60Val Met Arg Glu Ala Ala Phe Ser Leu Ala Glu Ala Lys Phe Thr75Ala Gly Asp Phe Ser Thr Thr Val Ile Gln Asn Val Asn Lys Ala90Gln Val Lys Ile Arg Ala Lys Lys Asp Asn Val Ala Gly Val Thr 105Leu Pro Val Phe Glu His Tyr His Glu Gly Thr Asp Ser Tyr Glu 120Leu Thr Gly Leu Ala Arg Gly Gly Glu Gln Leu Ala Lys Leu Lys 135Arg Asn Tyr Ala Lys Ala Val Glu Leu Leu Val Glu Leu Ala Ser 150Leu Gln Thr Ser Phe Val Thr Leu Asp Glu Ala Ile Lys Ile Thr 165Asn Arg Arg Val Asn Ala Ile Glu His Val Ile Ile Pro Arg Ile 180Glu Arg Thr Leu Ala Tyr Ile Ile Thr Glu Leu Asp Glu Arg Glu 195Arg Glu Glu Phe Tyr Arg Leu Lys Lys Ile Gln Glu Lys Lys Lys 210Ile Leu Lys Glu Lys Ser Glu Lys Asp Leu Glu Gln Arg Arg Ala 225Ala Gly Glu Val Leu Glu Pro Ala Asn Leu Leu Ala Glu Glu Lys 240Asp Glu Asp Leu Leu Phe Glu 247(6)SEQ ID NO5信息(I)序列特性(A)长度5’引物为23个碱基对，3’引物为22个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(II)分子类型DNA(PCR引物)(III)序列描述SEQ ID NO55’引物CTCGGGAAGC GCGCCATTGT GTT 233’引物TGGCATTTAC ACGCCTGTTG GT 22(7)SEQ ID NO6信息(I)序列特性(A)长度5’引物为21个碱基对，3’引物为20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(II)分子类型DNA(PCR引物)(III)序列描述SEQ ID NO65’引物CCATGACAGA CAAGACAGGA A213’引物GTGTTACACG TGATCTGCTT 20
权利要求
1.一种与抗癌基因编码产物pRB相作用的人体蛋白质编码基因pRb-BP76，其特征在于它为人类V型ATPase D亚基的编码基因，具有如序列表SEQID NO3所示的cDNA核苷酸序列和如序列表SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
全文摘要
本发明涉及一种与抗癌基因编码产物pRB相作用的人体蛋白质编码基因pRb－BP76,它由cDNA由1403个核苷酸组成,编码序列编码247个氨基酸组成的蛋白质,通过同源性比较确认其为人类V型ATPaseD亚基的编码基因。它在人体的正常组织中广泛表达。pRb－BP76基因定位在第14号染色体q23.1—24.1区段。
文档编号C07K14/435GK1254013SQ9911991
公开日2000年5月24日 申请日期1999年10月29日 优先权日1999年10月29日
发明者敖世洲, 闻宏, 李 权 申请人:中国科学院上海生物化学研究所