专利名称：：液相三磷酸腺苷偶合的纳米单质硒及其制备和保存方法
技术领域：
：本发明涉及纳米硒，特别是液相三磷酸腺苷偶合的纳米单质硒及其制备与保存方法。
背景技术：
：硒是人体必需微量元素。硒具有抗氧化、调节免疫、拮抗有害重金属等重要生物功能。人体缺硒将诱发多种疾病，如艾滋病(AIDS)、乙型肝炎、肝癌、克山病、大骨节病、心脑血管疾病等。目前研究结果显示使用超大剂量的硒(比硒的营养剂量范围高出510倍，硒的营养剂量为50200|ig/d)能防癌，降低癌症发生率和癌变程度。流行病学调查发现，低硒地区癌症发生率高于富硒地区癌症发生率。人群干预研究证明补硒可以防癌。在江苏启东肝癌高发区、河南林县食管癌高发区，人群强化补硒后显著降低了癌症的发病率。在美国，对8000人进行长达10年的补硒研究，结果表明，硒可以显著降低肺癌、肠癌、胃癌、血癌等癌症的发病率。同时又有大量实验表明超大剂量的硒与化疗药物合并使用可以提高癌症治疗的治愈率。Yatrik.(Mol.CancerTher[J]，2005，4:1239-1249)等人石开究发现甲基硒酸和它莫西芬联合使用，提高了它莫西芬治疗乳腺癌、肺癌的效果。1992年MasahikoSato等人(CancerChemotherPharmacol[J],1992,30:439-443)用亚硒酸钠与顺铂联用取得显著效果，荷瘤动物单用顺铂治疗，存活在7周左右，超大剂量的亚硒酸钠与顺铂联用完全治愈了肿瘤。ShousongCao等人(Clin.CancerRes[J]，2004,10:2561-2569)用超大剂量的甲基硒代半胱氨酸与依力替康联用，取得惊人效果。依力替康是治疗肠癌的化疗药物，它与超大剂量的甲基硒代半胱氨酸联用后，对敏感性肠癌和头颈部癌治愈率提高了7080%，对不敏感性肠癌和头颈部癌治愈率提高了为4070°/。。预防癌症和合并化疗治愈癌症方面需要超营养水平或超大剂量硒，而这些剂量已经进入了硒的毒性范围，这严重限制了硒在防治癌症方面的潜力。因此寻求低毒而生物利用度良好的硒形式对硒在治疗癌症和其它疾病方面的应用十分重要。1985年，就有人提出了胶体状态的红色单质硒具有生物活性的假说，但一直缺乏研究证据。1998年，张劲松等人在蛋白质或多肽溶液体系中使用还原剂还原硒化合物得到蛋白质态或多肽态的纳米硒，再经过分离和干燥得到了纳米硒固体，并申请了发明专利(CN1184776A)。试验研究表明，纳米硒的生物利用性好，急毒性小，生物活性高。例如，纳米硒能对抗CCl4诱发的急性肝损伤，显著抑制肿瘤体积，抑制肿瘤转移，提高免疫指标等。目前纳米硒的生物学功效己被认可，国家卫生部已经批准纳米硒胶囊为保健食品(卫食健字1998第134号)。2002年，张胜义等申请了葡苷聚糖纳米硒及其制备方法(CN1415241A)、甲壳素纳米硒及其制备方法(CN1415310A)和氨基酸纳米硒及其制备方法中国专利CN1415308A中公开的产品均必需以固相保存且其修饰剂均是没有抗癌活性的(如葡苷聚糖、甲壳素及混合氨基酸等)。在本课题组曾先后申请了液相多聚糖纳米硒及其制备与保存(CN1947723A)、液相维生素C复合的纳米单质硒及其制备与保存方法(CN100998603A)、液相氨基酸耦合的纳米硒单质及其制备和保存方法等多个专利(CN101040869A)。这些专利的产物最突出的优点是以液态(水溶胶)形式保存，从而可以作为注射、喷雾等多种剂型应用，但硒的浓度都相对偏小，不利于临床上癌症联合化疗时大剂量的使用。而且所用的修饰剂同样是一些没有抗癌活性的物质。黄亮等(高等学校化学学报[J],2007，28(2):208-211)研究发现具有一定抗癌活性的裙带菜多糖或其适当氧化降解的产物对纳米硒也有较好的修饰及其稳定化作用，但因修饰剂分子量大、粘度高、溶解度低、不利于人体吸收等不利因素制约了其临床应用。同时用这类多糖对纳米硒修饰时事先要对多糖进行长时间的超声波辅助氧化分解，存在操作麻烦，生成成本高等的不利因素。三磷酸腺苷作为细胞外信号分子，通过与膜上的特异性嘌呤受体结合，调节多种细胞的功能活动。近来国外学者对三磷酸腺苷的抗癌作用十分重视。Rapaport等报道(ProcNatlAcadSciUSA[J],1989，86(5):1662~6)，三磷酸腺苷对小鼠结肠移植癌和人肺巨细胞癌及前列腺癌的增殖有抑制作用。Hatta报道(LeukRes[J],2002,26(5):477-482)三磷酸腺苷对小鼠白血病具有抗增殖作用。Yamaguchi等报道(JCellPhysiol[J]，1994,159(3):441~449)，细胞外三磷酸腺苷能提高小鼠髓细胞性白血病细胞诱导分化的能力，促使向正常表型逆转。Palomares等报道(MelanomaRes[J],1999,9(3):233-242)三磷酸腺苷对黑色素瘤有抑制作用。Bradley等则报道(JharmacolExpTher[J],2001，299(2):748~752)三磷酸腺苷对人星形细胞瘤具有抗增殖作用。国内学者中郝纯毅等(中华肿瘤杂志[J]，1999,21(3):165167)研究发现三磷酸腺苷不仅抑制人胃癌细胞的增殖，加药处理4天后增殖的抑制率可达80%以上。而且诱导分化，使人胃癌细胞的恶性表型向正常表型逆转。秦葵等(中国药理学通报[J],2006，22(1):31-4)研究发现三磷酸腺苷对人食管癌细胞株Eca-109和人肝癌细胞株SMMC-7721细胞均有增殖抑制作用。
发明内容针对现有技术的不足，本发明的首要目的是将具有抗癌活性的三磷酸腺苷弓I入液相纳米单质硒体系，提供一种液相三磷酸腺苷偶合的纳米单质硒。本发明的另一目的是提供上述液相三磷酸腺苷偶合的纳米单质硒的制备方法。本发明的再一目的是提供一种稳定保存纳米单质硒的方法。为达上述目的，本发明提供如下的技术方案一种液相三磷酸腺苷偶合的纳米单质硒的制备方法，在常温常压下，在三磷酸腺苷溶液中加入维生素C溶液，混合均匀，然后滴加二氧化硒溶液或亚硒酸盐溶液，边滴加边混匀，待产物中所出现的红色不再改变，得到由三磷酸腺苷和纳米单质硒所组成的液相偶合物。上述方法中，优选地，所述维生素C为还原型维生素C。上述方法中，优选地，所述亚硒酸盐为亚硒酸钠。上述方法中，优选地，所述的三磷酸腺苷溶液的浓度为0.01moH/10.1moH/1，维生素C溶液的浓度为0.02moH/10.2mol'U1,二氧化硒或亚硒酸钠溶液的浓度为lxl(T6mol丄"lxl(T2mol'L";三磷酸腺苷溶液、维生素C溶液、二氧化硒或亚硒酸钠溶液的体积用量比为1~50:1:0.1~10。更优选地，上述方法中，所述的三磷酸腺苷溶液的浓度为0.025moH/10.08mol丄"，维生素C溶液的浓度为0.1mol丄"，二氧化硒或亚硒酸钠溶液的浓度为lxl(T4moH/1;三磷酸腺苷溶液、维生素C溶液、二氧化硒或亚硒酸钠溶液的体积用量比为5~50:1:0.110。本发明还提供了上述方法所制得的液相三磷酸腺苷偶合的纳米单质硒。腺苷的浓度范围优选为lmmol，L"0.08moH/1，所述维生素C的浓度范围为2fxmol'L"0.01mol丄"，所述纳米单质硒的浓度范围为lHmol'lZ—Smmol'L-^本发明同时提供了一种保存纳米单质硒的方法，及可将纳米单质硒制成本发明的液相三磷酸腺苷偶合的纳米单质硒的形式，在2-10。C下在水溶液中以溶胶形态保存。本发明所得到产品的三磷酸腺苷和硒的比例可以调整，若要增加产品中硒的含量，应适当增加修饰剂三磷酸腺苷和还原剂维生素C的溶液浓度或体积。三磷酸腺苷的起始浓度过低，或纳米单质硒的浓度过高，得到的纳米单质硒的粒径会偏大，且可能不利于纳米单质硒的稳定保存。适当增加三磷酸腺苷的起始浓度，有利于降低硒粒子的粒径、有利于延长保存时间。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果本发明使用具有很好生物活性、抗癌活性和对液相纳米单质硒具有优越稳定化作用的三磷酸腺苷分子作为表面修饰剂对纳米单质硒进行表面修饰，以达到调控纳米单质硒粒径和稳定纳米单质硒的作用，三磷酸腺苷偶合的纳米单质硒水溶胶经透射电子显微镜、红外光谱、Zeta电位、元素分析的测量表明，三磷酸腺苷对纳米单质硒形成了很好的表面修饰及其稳定化的作用。本发明所得的三磷酸腺苷偶合的纳米单质硒具有超大剂量的纳米单质硒浓度且能充分发挥抗癌活性小分子与纳米单质硒的协同抗癌作用，为临床上癌症的联合化疗提供一种很好的优选方案。而且所制得的产物可以在液相中以水溶胶的形式保存，有利于多种剂型开发，如注射剂、口服、喷雾、霜剂等，从而大大拓展了应用范围。图1是TECNAI-10型透射电子显微镜(Philips)下纳米单质硒形貌图。图中A、B、C、D分别对应实施例l至实施例4中硒浓度为64pmol丄"时三磷酸腺苷偶合的纳米单质硒的形貌，E对应的是实施例五中硒浓度为1mmol.L"时三磷酸腺苷偶合的纳米单质硒的形貌。图2是实施例1中硒浓度64pmol丄"时三磷酸腺苷偶合的纳米单质硒体系及其相同浓度下的单独纳米单质硒体系、三磷酸腺苷的红外光谱图；图中谱线a、b、c(由上至下)分别对应纳米单质硒、三磷酸腺苷、三磷酸腺苷偶合的纳米单质硒的红外光谱图。图3是实施例1中硒浓度64|_imol丄-1时三磷酸腺苷偶合的纳米单质硒体系及其相同浓度下的单独纳米单质硒体系的Zeta电位图；图中A、B分别对应纳米单质硒、三磷酸腺苷偶合的纳米单质硒的Zeta电位图。图4是实施例5中硒浓度lmmol七-1时三磷酸腺苷偶合的纳米单质硒颗粒中的EDX元素分析图。具体实施方式下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明，但本发明的实施方式不限于此。实施例1:在常温常压下(15~35°C，l标准大气压)，取浓度为0.025moH/1的三磷酸腺苷溶液各2ml分别加入2个10ml的容量瓶中，然后取浓度为0.1mol丄"的维生素C溶液各0.3ml分别加入这2个容量瓶中，轻轻摇匀使之混合充分，然后分别滴加浓度为4xl0'4mol七"的二氧化硒溶液1.6ml，3.2ml。边滴加边轻轻摇匀，待红色不再改变，加水定容至10ml，即得到硒浓度分别为64、12^mol.U1，三磷酸腺苷的浓度为5mmoH/1，维生素C的浓度为3mmoH/1的目标产物。由BI9000AT型激光散射仪测定产物中的纳米粒子的分布情况，计数用Number。产物中的纳米粒子的平均粒径在40.0100.0nm范围，见附表l。产物可在2-10。C下在水溶液中以溶胶形态保存。附表1:实施例1的纳米单质硒粒子的粒径范围硒浓度平均粒径主要粒径粒径范围(|xmol七陽1)C腦)C腦)6455.340.240.099.112860.358.942.2100.0实施例2:在常温常压下(15~35°C，1标准大气压)，取浓度为0.025mol.U1的三磷酸腺苷溶液各2ml分别加入2个10ml的容量瓶中，然后取浓度为0.1mol七—1的维生素C溶液各0.3ml分别加入这2个容量瓶中，轻轻摇匀使之混合充分，然后分别滴加浓度为AxlO^mol.L-1的亚硒酸钠溶液1.6ml，3.2ml边滴加边轻轻摇匀，待红色不再改变，加水定容至10ml，即得到硒浓度分别为64、128pmoH;1，三磷酸腺苷的浓度为5mmo1.1/1，维生素C的浓度为3mmol.L"的目标产物。由BI9000AT型激光散射仪测定产物中的纳米粒子的分布情况，计数用Number。产物中的平均粒径在31.6106.0nm范围，见附表2。产物可在2-10°C下在水溶液中以溶胶形态保存。附表2:实施例2的纳米单质硒粒子的粒径范围<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例3:在常温常压下(15~35°C，l标准大气压)，取浓度为0.025mol.L—1的三磷酸腺苷溶液各4ml分别加入2个10ml的容量瓶中，然后取浓度为0.1mol丄—1的维生素C溶液各0.3ml分别加入这2个容量瓶中，轻轻摇匀使之混合充分，然后分别滴加浓度为4xl(T4mol七"的亚硒酸钠溶液1.6ml，3.2ml边滴加边轻轻摇匀，待红色不再改变，加水定容至10ml,即得到硒浓度分别为64、128pmol丄"，三磷酸腺苷的浓度为10mmoH/1，维生素C的浓度为3mmol丄"的目标产物。由BI9000AT型激光散射仪测定产物中的纳米粒子的分布情况，计数用Number。产物的纳米粒子的平均粒径在37.6112.0nm范围，见附表3。产物可在2-l(TC下在水溶液中以溶胶形态保存。附表3:实施例3的纳米单质硒粒子的粒径范围<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例4:在常温常压下(15~35°C，l标准大气压)，取浓度为0.08mol丄"的三磷酸腺苷溶液各5ml分别加入2个10ml的容量瓶中，然后取浓度为0.1mol丄"的维生素(3溶液各0.21111分别加入这2个容量瓶中，轻轻摇匀使之混合充分，然后分别滴加浓度为4xlO"mol，L"的二氧化硒溶液1.6ml，3.2ml。边滴加边轻轻摇匀，待红色不再改变，加水定容至10ml，即得到硒浓度分别为64、128pmoH/1，粒径在48，2105.8nm范围，见附表l。产物可在2-10°C下在水溶液中以溶胶形态保存。附表4:实施例4的纳米单质硒粒子的粒径范围硒浓度平均粒径主要粒径粒径范围(nmol'L-1)Cnm)(nm)6458.358.248.296.012860.772.760.7105.8实施例5:在常温常压下(15~35°C，l标准大气压)，取浓度为0.05mol.U1的三磷酸腺苷溶液各4ml分别加入2个10ml的容量瓶中，然后取浓度为0.1mol七"的维生素C溶液各2ml分别加入这2个容量瓶中，轻轻摇匀使之混合充分，然后分别滴加浓度为4xl(T2mol丄"的二氧化硒溶液0.25ml，0.75ml边滴加边轻轻摇匀，待红色不再改变，加水定容至lOml，即得到硒浓度分别为1、Smmol'L-1,三磷酸腺苷的浓度为20mmoH/1，维生素C的浓度为15mmol'U1的目标产物。由BI9000AT型激光散射仪测定产物中的纳米粒子的分布情况，计数用Number。产物中的纳米粒子的平均粒径在32.699.3nm范围，见附表5。产物可在2-l(Tc下在水溶液中以溶胶形态保存。附表5:实施例5的纳米单质硒粒子的粒径范围硒浓度平均粒径主要粒径粒径范围(mmol-U1)Cnm)C歸)144.431.632.694.2351.960.735.199.3需要强调的是，本发明所得到产品的三磷酸腺苷和硒的比例可以调整，若要增加产品中硒的含量，应适当增加修饰剂三磷酸腺苷和还原剂维生素c的溶液浓度或体积。三磷酸腺苷的起始浓度过低，或纳米单质硒的浓度过高，得到的纳米单质硒的粒径会偏大，且可能不利于纳米单质硒的稳定保存。适当增加三磷酸腺苷的起始浓度，有利于降低硒粒子的粒径、有利于延长保存时间。实施例l-5所得产品在透射电镜下的形貌如图1A-E所示，从图中可以看出三磷酸腺苷偶合的纳米单质硒颗粒尺寸均一，说明三磷酸腺苷对纳米单质硒有很好的粒径调控作用。对实施例1中硒浓度为64pmol丄"时三磷酸腺苷偶合的纳米单质硒的体系进行离心分离得到固体颗粒，干燥后与KBr压片，测试红外光谱。同时分别测试相同浓度的纳米单质硒和三磷酸腺苷的红外光谱。如图2所示。图中谱线a、b、c分别对应纳米单质硒、三磷酸腺苷、三磷酸腺苷偶合的纳米单质硒的红外光谱图。根据三磷酸腺苷红外谱图的变化，说明在三磷酸腺纳米单质硒偶合物体系中，三磷酸腺苷中三个磷酸基周围的环境发生了很大的变化。这种变化我们认为主要是三磷酸腺苷是通过a、卩位的P=0上的氧原子与硒形成O—Se—O化学键来完成对纳米单质硒的修饰，从而导致三磷酸腺苷中酸苷键Pa—O—Pp、P=0的振动受到了很大的抑制，周时对磷酯键C一O—P的振动也产生了很大的影响。实施例1中硒浓度为64pmol丄"时三磷酸腺苷偶合的纳米单质硒的体系及其相同浓度的单独纳米单质硒表面的Zeta电位如图3所示，从图3(A)中可以看出，在单独的纳米单质硒体系中，纳米颗粒表面的Zeta电位为零，而在三磷酸腺苷纳米单质硒偶合物体系中，纳米单质硒表面的Zeta电位为一10mv，如图3(B)所示，这说明体系中纳米单质硒表面带上了负电荷。这主要是因为纳米单质硒表面耦合了三磷酸腺苷造成的。三磷酸腺苷的三个磷酸基带有负电荷，三磷酸腺苷通过P=0上的氧原子与硒形成O-Se-O化学键来完成对纳米单质硒的修饰后使纳米单质硒表面也带上负电荷。三磷酸腺苷纳米单质硒偶合物的生成，一方面对纳米单质硒颗粒间的相互接触形成了空间位阻，同时使纳米颗粒表面都带上了负电荷形成了排斥力，这两方面的原因防止纳米单质硒发生沉聚，使其稳定地保存于溶液中。实施例5中硒浓度为lmmol丄-l时，三磷酸腺苷偶合的纳米单质硒颗粒中的EDX元素分析如图4所示。从图中可以看出三磷酸腺苷偶合的纳米单质硒体系中硒、磷、氧等元素的分布情况。这也从另一个角度说明了三磷酸腺苷对纳米单质硒的表面修饰作用。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。权利要求1、一种液相三磷酸腺苷偶合的纳米单质硒的制备方法，其特征在于在常温常压下，在三磷酸腺苷溶液中加入维生素C溶液，混合均匀，然后滴加二氧化硒溶液或亚硒酸盐溶液，边滴加边混匀，待产物中所出现的红色不再改变，得到由三磷酸腺苷和纳米单质硒所组成的液相偶合物。2、根据权利要求1所述的液相三磷酸腺苷偶合的纳米单质硒的制备方法，其特征在于所述维生素C为还原型维生素C。3、根据权利要求1所述的液相三磷酸腺苷偶合的纳米单质硒的制备方法，其特征在于所述亚硒酸盐为亚硒酸钠。4、根据权利要求1所述的液相三磷酸腺苷偶合的纳米单质硒制备方法，其特征在于所述的三磷酸腺苷溶液的浓度为0.01mol丄"0.1moH/1，维生素C溶液的浓度为0.02mol丄"0.2mol丄"，二氧化硒或亚硒酸钠溶液的浓度为lxlO"mol，L"lxl(^mol丄"；所述磷酸腺苷溶液、维生素C溶液、二氧化硒或亚硒酸钠溶液的体积用量比为150:1:0.110。5、根据权利要求4所述的液相三磷酸腺苷偶合的纳米单质硒制备方法，其特征在于所述的三磷酸腺苷溶液的浓度为O.OSSmol'lZ-O.OSmol'L-1,维生素C溶液的浓度为0.1moH/1，二氧化硒或亚硒酸钠溶液的浓度为lxl0^mol七"；所述三磷酸腺苷溶液、维生素C溶液、二氧化硒或亚硒酸钠溶液的体积用量比为550:1:0,110。6、一种液相三磷酸腺苷偶合的纳米单质硒，其特征在于是由权利要求1至5中任一项所述的液相三磷酸腺苷偶合的纳米单质硒的制备方法得到的。7、根据权利要求6所述的液相三磷酸腺苷偶合的纳米单质硒，其特征在于其中，三磷酸腺苷的浓度范围为lmmol'L-10.08mol'U1,维生素C的浓度范围为2拜01七-10.0111101丄-1，纳米单质硒的浓度范围为liimoH^—Smmol'L^8、一种稳定保存纳米单质硒的方法，其特征在于制成权利要求6所述的液相三磷酸腺苷偶合的纳米单质硒，在210。C下在水溶液中以溶胶形态保存。全文摘要本发明涉及纳米硒，具体公开了一种三磷酸腺苷偶合的纳米单质硒及其制备和保存方法。制备方法如下在常温常压下，在三磷酸腺苷溶液中加入维生素C溶液，混合均匀后滴加二氧化硒或亚硒酸盐溶液，边滴加边混匀，待产物中所出现的红色不再改变，得到由三磷酸腺苷和纳米单质硒所组成的液相偶合物。本发明用具有抗癌活性的小分子三磷酸腺苷对纳米单质硒进行很好的粒径调控和稳定化作用，得到了抗癌活性高毒性低的硒形式。而且所制得的产物可以在液相中以水溶胶的形式保存，有利于多种剂型开发，如注射剂、口服、喷雾、霜剂等，从而大大拓展了应用范围。文档编号A61K33/04GK101530422SQ200910038320公开日2009年9月16日申请日期2009年4月1日优先权日2009年4月1日发明者杰刘,张逸波,航徐,芳杨,郑文杰,陈填烽申请人:暨南大学