专利名称：人夏科－莱登晶体2及其编码序列、以及制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新的人基因核苷酸序列。更具体地说，本发明涉及人夏科-莱登晶体2(Charcot-Leyden Crystal 2,CLC2)的cDNA序列，该cDNA编码的蛋白是人夏科-莱登晶体蛋白的同系物。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。
夏科-莱登晶体(Charcot-Leyden Crystal,CLC)是自然存在于人体组织和分泌物中的底面为六角的双锥体形晶体，与寄生过程、过敏性过程中外周血或组织中的嗜酸细胞数量增加有关。早在1854年，Charcot和Robin首先在尸体的血液和白血病患者的脾脏中发现夏科-莱登晶体(Charcot,J.M.；Robin,C.:C.R.Seances Mem.Soc.Biol.Paris 5:44-52,1854)，后来在一位哮喘病患者的唾液中亦发现了该晶体(Leyden,E.Virchows Arch.Path.Anat.54:324-344,1872)。
CLC在嗜酸细胞相关炎症反应的组织和分泌物中被观察到，这些炎症反应有哮喘、骨髓性白血病、过敏反应、寄生虫病等(Beeson,P.B.1977 et al.The eosinopilIn Problems in the Internal Medicine,Vol.15.；Ottesen,E,A.et al 1978.The eosinophil,eosinophilia and eosinophil-related disorders.In Allergy:Principles and Practice,Vol.2.E.Middleton,C.E.Reed,and E.F.Ellis,eds.C.V.Mosby Co.,St.Louis,MO,p.584.)。CLC蛋白占嗜酸细胞总蛋白的约10％(Weller,P.F.et al.1984,J.Biol.Chem.259:15100)，是嗜酸细胞的标志性蛋白，在体液和分泌物中鉴定到这种独特的底面为六角的双锥体形晶体-CLC晶体，可作为嗜酸细胞相关的过敏性炎症的标志。
CLC的全长cDNA序列在1993年分离得到，该cDNA序列长598bp，编码139氨基酸的多肽(Ackeman,S.J.et al 1993,J.Immun.150:456-468)。CLC的基因组序列几乎同时被获得，Dyer报道从特异的19号染色体库中克隆到包含了CLC编码序列的基因组片段，对CLC的cDNA和基因组序列分析结果显示CLC的编码顺序由4个外显子拼接而成(Dyer,K.D.et al.1997,Genomics 40:17-221)。
Mastrianni将人夏科-莱登晶体蛋白定位于19号染色体(Mastrianni,D.M.et al1991,Cytogenet.Cell Genet.58 2021)。荧光原位杂交技术将CLC进一步定位于19q13.1(B.Trask and H.Morhrenweiser unpublished observation,cited in Ackeman,S.J.et al 1993,J.Immun.150:456-468)。
另有一些实验显示，夏科-莱登晶体作为一个独立的蛋白具有溶血磷脂酶的活性(Gleich,G.J.et al 1976,J.Clin.Invest.57:633-640；Weller,P.F.et al 1980,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.77；7441-7443)。这一结论同时也被其它一些实验所支持碱性聚丙烯酰胺胶电泳显示，溶解的夏科-莱登晶体只有一条条带，且其分子量为17400，与从嗜酸性颗粒细胞中分离到的溶血磷脂酶的分子量相符；另外，嗜酸性颗粒细胞溶血磷脂酶能形成双锥型的晶体，与夏科-莱登晶体形态相同。这些都表明，人嗜酸粒细胞溶血磷脂酶是夏科-莱登晶体的组成成分(Weller,P.F.et al 1980,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.77；7441-7443)。但CLC与其它哺乳动物的溶血磷脂酶没有结构上的相似性(Leonidas,D.D.et al.1995,Structure 3:1379-1393)。
而CLC蛋白与外源凝集素家族的某些成员在结构、部分功能上有相似性。CLC的cDNA推导蛋白(Ackeman,S.J.et al 1993,J.Immun.150:456-468)、基因组顺序的内含子-外显子的结构(Dyer,K.D.et al.1997,Genomics 40:17-221)、特征性高度保守残基(Dyer,K.D.et al.1996,Life Sci.58:2073-2082)、结合糖的活性(Dyer,K.D.et al.1996,Life Sci.58:2073-2082)、晶体蛋白的整体结构(Leonidas,D.D.et al.1995,Structure 3:1379-1393)都与galectin家族的某些成员相似，这表明CLC蛋白可能具有galectin相关的一些活性，在细胞-细胞，细胞-基质的相互作用中通过β-半乳糖苷结合活性发挥生物功能(Dyer,K.D.et al.1997,Gemonics 40:217-221)。
CLC是嗜酸细胞的标志，但在嗜碱粒细胞中也有CLC。亚显微结构研究表明，CLC存在于嗜酸性细胞和嗜碱粒细胞的颗粒中(Dvorak,A.M.et al.1988,Blood 72:150；Dvorak,A,M.et al.1989,Lab.Invest.60:557)。最近，通过免疫金技术或间接免疫荧光定位，还发现CLC存在于嗜酸性细胞和嗜碱粒细胞中的其他部位，如胞质和核(Dvorak,A.M.et al.1990,Lab.Invest.62:590-607；Dvorak,A.M.rtal.1991,Am.J.Pathol.138:69-82；Dvorak,A.M.et al.1997,Clin.Exp.Allergy 27:452-474)、嗜碱粒细胞的脱粒通道、脱粒通道膜和一类与嗜酸性细胞的初级颗粒相似的颗粒。CLC蛋白分布的变化表明嗜碱粒细胞内含物(包括CLC)有释放与获得的变化过程，CLC的功能可能与其分布的变化过程相关(Dvorak,A.M.et al.1997,Clin.Exp.Allergy 27:452-474)。
本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该多核苷酸被命名为人CLC2。
本发明的另一个目的是提供一种新的人CLC2蛋白。
本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的人的CLC2多肽的方法。
本发明还提供了这种人的CLC2核酸序列和多肽的应用。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有人CLC2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸28-447位的核苷酸序列或SEQ ID NO.11中从核苷酸87-593位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸28-447位的核苷酸序列或SEQ ID NO.11中从核苷酸87-593位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4或12所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸28-447位的核苷酸序列或SEQ ID NO.11中从核苷酸87-593位的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种分离的人CLC2蛋白多肽，它包括具有SEQID NO.4或12氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.4或12序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。
在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。
在本发明的另一方面，提供了一种产生具有人CLC2蛋白活性的多肽的方法，该方法包括(a)将编码具有人CLC2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人CLC2蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸28-447位的核苷酸序列或SEQ ID NO.11中从核苷酸87-593位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人CLC2蛋白的重组细胞；(c)在适合表达人CLC2蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人CLC2蛋白活性的多肽。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为478个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于28-447位核苷酸，它编码一种人CLC2蛋白-即CLC2A蛋白。在本发明的另一具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为617个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.11，其中开放读框位于87-593位核苷酸，它编码另一种人CLC2蛋白-即CLC2B蛋白。CLC2A和CLC2B是同一基因经不同剪接后所产生的蛋白。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“人CLC2蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有人CLC2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中从核苷酸28-447位的核苷酸序列或SEQ ID NO.11中从核苷酸87-593位的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框28-447位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列，或者位于SEQ ID NO.11序列的编码框87-593位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中从核苷酸28-447位的核苷酸序列或SEQ ID NO.11中从核苷酸87-593位的核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列，也能编码出SEQ ID NO.4或12所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下，与SEQ ID NO.3中从核苷酸28-447位的核苷酸序列或SEQ ID NO.11中从核苷酸87-593位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸28-447位的核苷酸序列或SEQID NO.11中从核苷酸87-593位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与人CLC2相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.4或12序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5和/或3端添加数个核苷酸。本发明的编码序列可以是DNA或RNA，可以是单链或双链。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“人CLC2蛋白多肽”指具有人CLC2蛋白活性的SEQ ID NO.4或12序列的多肽。该术语还包括具有与人CLC2相同功能的、SEQ ID NO.4或12序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人CLC2蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人CLC2 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人CLC2多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人CLC2多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人CLC2多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人CLC2多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供人CLC2蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人CLC2多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基((如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“人CLC2保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.4或12的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明还包括人CLC2多肽编码序列及其片段的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内人CLC2的表达。
本发明还包括一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有人CLC2多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码人CLC2的核酸分子。
本发明还包括检测人CLC2核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于人CLC2多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
另一方面，本发明还包括对人CLC2 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人CLC2基因产物或片段。较佳地，指那些能与人CLC2基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人CLC2蛋白的分子，也包括那些并不影响人CLC2蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人CLC2基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人CLC2基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人CLC2或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495,1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:511,1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:292,1976；Hammerling等人，InMonoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本发明的抗体包括能阻断人CLC2功能的抗体以及不影响人CLC2功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人CLC2基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人CLC2基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
本发明的人CLC2核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中的各种DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明蛋白的片段除了可用重组法产生之外，还可用固相技术通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis,WH Freeman Co.,San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85:2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City,CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。
本发明蛋白的编码序列还可用于基因定位。例如，通过荧光原位杂交技术(FISH)，将cDNA克隆与分裂中期的染色体进行杂交，可以准确地进行染色体定位。该技术可以使用短至约500bp的cDNA；也可以使用长至约2000bp或者更长的cDNA。对于该技术，可参见Verma等人，Human Chromosomes:A Manual ofBasic Techniques,Pergamon Press,New York(1988)。
一旦序列被定位于染色体上的某个精确位置，将可以将序列在染色体上的物理位置与遗传图谱数据相关联。这些遗传图谱数据是可以获得的，例如通过孟德尔(Mendelian)人遗传数据库(可通过Johns Hopkins University Welch MedicalLibrary在网上获得)。然后，通过连锁分析来鉴定基因与已定位于同一染色体区域的疾病之间的相关性。
接着，有必要确定患病个体和健康个体之间的cDNA或基因组序列方面的差异。如果某一突变存在于部分或全部患病个体但不存在于正常个体，那么该突变可能就是该疾病的致病因素。
此外，利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与CLC2发生相互作用的物质，如受体、抑制剂或拮抗剂等。
本发明蛋白及其抗体、抑制剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。
以本发明的人CLC2蛋白为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的蛋白质和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的人CLC2蛋白可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
当本发明的人CLC2蛋白多肽被用作药物时，可将治疗有效剂量的该多肽施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
CLC与嗜酸细胞相关炎症反应有着密切的关系，其在体液和分泌物中的鉴定可作为嗜酸细胞相关的过敏性炎症的标志。另外，CLC与外源凝集素家族的某些成员在结构、部分功能的相似性表明CLC蛋白可能具有外源凝集素相关的一些活性，在细胞-细胞，细胞-基质的相互作用中通过β-半乳糖苷结合活性发挥生物功能(Dyer,K.D.et al.1997,Gemonics 40:217-221)。CLC还存在于嗜碱粒细胞中，其分布有变化的过程，因此CLC的功能可能与其分布的变化过程相关(Dvorak,A.M.etal.1997,Clin.Exp.Allergy 27:452-474)。
此外，由于本发明的人CLC2具有源自人的天然氨基酸序列，因此，与来源于其他物种的同族蛋白相比，预计在施用于人时将具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人体内的免疫原性更低或没有)。
在附图中，
图1为本发明的人CLC2A、CLC2B与人CLC(hCLC)、鼠CLC(mCLC)和猩猩CLC(pCLC)等5种蛋白的氨基酸序列同源比较图。其中，相同的氨基酸在序列下方用“*”标出，相似的氨基酸用“·”标出。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1人CLC2的cDNA序列的克隆和测定(A)人CLC2A的cDNA序列的克隆和测定1．引物扩增以人脑λgtllcDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物--A:5′-CGAAGAGCTGCCCAGAAGGAGAG-3′(SEQ ID NO.1)为正向引物，寡核苷酸B:5′-TCCTCAACAATGAGGAGTCTGATC-3′(SEQ ID NO.2)为反向引物，进行PCR。PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、62℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到的PCR片段约为500bp的目的片段。
2．PCR产物的测序将上述PCR扩增产物A/B与pGEM-T载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JMl03，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用SequiTherm EXCELTMDNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对插入片段进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共478bp，详细序列见SEQ ID NO:3，其中开放读框位于28-447位核苷酸。
根据得到的全长cDNA序列推导出人CLC2A的氨基酸序列，共139个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO:4。
(B)人CLC2B的cDNA序列的克隆和测定1．引物扩增采用与克隆CLC2A相同的方法，不同点仅在于所用的一对寡核苷酸引物不同，即将寡核苷酸A′:5′-GTGACAGAGCAAGACCCTATCTC-3′(SEQ ID NO.9)为正向引物，寡核苷酸B′:5′-CAATGAGGAGTCTGATCATCTCC-3′(SEQ ID NO.10)为反向引物，进行PCR。电泳检测得到的PCR片段约为600bp的目的片段。
2．PCR产物的测序如上将上述PCR扩增产物A′/B′与pGEM-T载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用SequiTherm EXCELTMDNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对插入片段进行测序，获得全长cDNA序列，共617bp，详细序列见SEQ ID NO:11，其中开放读框位于87-593位核苷酸。
根据得到的全长cDNA序列推导出人CLC2B的氨基酸序列，共168个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO:12。
实施例2同源比较用本发明的人CLC2的全长cDNA序列及其编码蛋白(包括CLC2A和CLC2B)，在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBankCDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中，用BLAST程序进行核酸和蛋白同源检索。结果发现，在核苷酸水平和蛋白水平上与人的CLC(gb|L01664)都有较高同源性。其中，CLC2A推导蛋白与人CLC蛋白的同一性达到50％，相似性达60％。CLC2B推导蛋白与人CLC蛋白的同一性达到49％，相似性达59％。另外，CLC2A和CLC2B与鼠和猩猩中已公布的CLC部分序列也显示了较高的同源性(CLC2A和CLC2B与hCLC、mCLC及pCLC的氨基酸序列同源比较见图1)。
此外，CLC2A和CLC2B蛋白几乎相同，不同点仅在于CLC2B在N端多出了近30个氨基酸(图1)。因此，这暗示CLC2A和CLC2B是同一基因的不同剪接本。
根据结构决定功能，结构相似功能相关的生物学原理，可以根据已知的不同物种中的CLC基因及其编码蛋白的功能来推测本发明CLC2的生物学功能。
CLC在嗜酸细胞相关炎症反应的组织和分泌物中观察到，这些炎症反应有哮喘，骨髓白血病，过敏反应，寄生虫病等(Beeson,P.B.1977 et al.The eosinopil InProblems in the Internal Medicine,Vol.15.；Ottesen,E,A.et al 1978.The eosinophil,eosinophilia and eosinophil-related disorders.In Allergy:Principles and Practice,Vol.2.E.Middleton,C.E.Reed,and E.F.Ellis,eds.C.V.Mosby Co.,St.Louis,MO,p.584.)。CLC蛋白占嗜酸细胞总蛋白的约10％(Weller,P.F.et al.1984,J.Biol.Chem.259:15100)，是嗜酸细胞的标志性蛋白，在体液和分泌物中鉴定到这种独特的底面为六角的双锥体形晶体-CLC晶体，可作为嗜酸细胞相关的过敏性炎症的标志。
而CLC蛋白与外源凝集素家族的某些成员存在结构、部分功能上的相似性。CLC的cDNA推导蛋白与结合β-半乳糖苷S-样动物外源凝集素(galectin)超家族的成员有相似性(Ackeman,S.J.et al 1993,J.Immun.150:456-468)。CLC基因组顺序的内含子-外显子的结构与galectin的结构相似，全部β-半乳糖苷结合位点由一个外显子-编码，这一特征与目前为止所有的galectin相符合(Dyer,K.D.et al.1997,Genomics 40:17-221)。
对CLC蛋白和人galectin的蛋白序列分析表明，CLC2A与该家族的特征性的13个高度保守残基中的11个相同或相似，它们是第24位的G、第53位的Q、第55位的R、第57位的H、第65位的N、第72位的W、第75位的E、第77位的K、第83位的F、第86位的G和第115位的R。而CLC2B与该家族的特征性的13个高度保守残基中的11个相同或相似，它们是第53位的G、第82位的Q、第84位的R、第86位的H、第97位的V、第101位的W、第104位的E、第106位的K、第112位的F、第115位的G和第144位的R。
CLC蛋白能结合于偶合乳糖的琼脂糖树脂，而且这种结合作用还依赖于糖的剂量(Dyer,K.D.et al.1996,Life Sci.58:2073-2082)。X-射线晶体衍射表明，CLC晶体蛋白的整体结构与galectin-1和-2高度相似。CLC含有保守的galectin的碳水化合物识别结构域的大部分残基(Leonidas,D.D.et al.1995,Structure 3:1379-1393)。这些结果都表明CLC蛋白可能具有外源凝集素相关的一些活性，可能在细胞-细胞，细胞-基质的相互作用中通过β-半乳糖苷结合活性发挥生物功能(Dyer,K.D.et al.1997,Gemonics 40:217-221)。
CLC是嗜酸细胞的标志，但在嗜碱粒细胞中也有CLC。亚显微结构研究表明，CLC存在于嗜酸性细胞和嗜碱粒细胞的颗粒中(Dvorak,A.M.et al.1988,Blood 72:150；Dvorak,A,M.et al.1989,Lab.Invest.60:557)。最近，通过免疫金技术或间接免疫荧光定位，还发现CLC存在于嗜酸性细胞和嗜碱粒细胞中的其他部位，如胞质和核(Dvorak,A.M.et al.1990,Lab.Invest.62:590-607；Dvorak,A.M.rtal.1991,Am.J.Pathol.138:69-82；Dvorak,A.M.et al 1997,Clin.Exp.Allergy 27:452-474)、嗜碱粒细胞的脱粒通道、脱粒通道膜和一类与嗜酸性细胞的初级颗粒相似的颗粒。CLC蛋白分布的变化表明嗜碱粒细胞内含物(包括CLC)有释放与获得的过程变化，CLC的功能可能与其分布的变化过程相关(Dvorak,A.M.et al.1997,Clin.Exp.Allergy 27:452-474)。
本发明的人CLC2除了可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明人CLC2还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。例如将本发明人CLC2的N端与鼠CLC的N端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
本发明的人CLC2还可用于筛选抑制本发明蛋白活性的拮抗剂、或增强本发明蛋白活性的激动剂等。
针对本发明人CLC2的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员)。
此外，本发明人CLC2核酸(编码序列或反义序列)可以被引入细胞，以提高人CLC2的表达水平或者抑制人CLC2的过度表达。本发明的人CLC2蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因人CLC2缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。
实施例3(A)人CLC2A在大肠杆菌中的表达在该实施例中，以实施例1中PCR扩增产物A/B为模板，将编码人CLC2A的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID NO.5和6)进行扩增，获得人CLC2A cDNA作为插人片段。
PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为5-TCAGGTCGACATGTCATCACTACCCTACC-3′(SEQ ID NO.5)，该引物含有SalⅠ限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的人CLC2A编码序列的19个核苷酸；3′端引物序列为5-TAGGAAGCTTTCAATCGCTGATAAGCACT-3(SEQ ID NO.6)，该引物含有HindⅢ限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和人CLC2A的部分编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.,Chatsworth,CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。
用SalⅠ和HindⅢ消化pQE-9载体及插入片段，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacⅠ阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，测序验证人CLC2A的cDNA片段已正确插入了载体。
在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD600)为0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacⅠ阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g,20分钟)。超声裂解培养物，收集细胞裂解液并将其稀释于6M盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的人CLC2A。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱人CLC2A。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。或者，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出的纯化蛋白。纯化后的蛋白质被结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小约为16kDa。
此外，用常规方法对达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。
(B)人CLC2B在大肠杆菌中的表达采用与实施例3(A)相同的程序对人CLC2B进行表达，不同点仅在于以实施例1中PCR扩增产物A′/B′为模板，用对应于人CLC2B的cDNA序列5′和3′端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID NO.13和6)代替SEQ ID NO:5和6所示的引物。
PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为5-CAAGGTCGACATGTCCCTGACCCACAGGC-3′(SEQ ID NO.13)，该引物含有SalⅠ限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的人CLC2B编码序列的19个核苷酸；3′端引物序列为5-TAGGAAGCTTTCAATCGCTGATAAGCACT-3(SEQ ID NO.6)，该引物含有HindⅢ限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和人CLC2B的部分编码序列。
随后，用SalⅠ和HindⅢ消化pQE-9载体及插入片段，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接昆合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，测序验证人CLC2B的cDNA片段已正确插入了载体。
获得的表达蛋白用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小约为20kDa。用常规方法对人CLC2B蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.12的序列一致。
实施例4(A)人CLC2A在真核细胞(CHO细胞株)中的表达在该实施例中，以实施例1中PCR扩增产物A/B为模板，将编码人CLC2A的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID NO.7和8)进行扩增，获得人CLC2A cDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为5′-TCAGAAGCTTATGTCATCACTACCCTACC-3′(SEQ ID NO.7)该引物含有HindIⅢ限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的人CLC2A编码序列的19个核苷酸；3′端引物序列为5-TAGGGGATCCTCAATCGCTGATAAGCACT-3(SEQ ID NO.8)该引物含有BamHⅠ限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和人CLC2A的部分编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr和Neor)、一个噬菌体复制起点(flori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。
用HindⅢ和BamHⅠ消化pcDNA3载体及插入片段，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，测序验证人CLC2A的cDNA片段已正确插入了载体。
质粒转染CHO细胞是采用脂转染法，用Lipofectin(GiBco Life)进行的。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mM Tris.HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris.HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris.HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小约为16kDa。
此外，用常规方法对达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。
(B)人CLC2B在真核细胞(CHO细胞株)中的表达采用与实施例4(A)相同的程序对人CLC2B进行表达，不同点仅在于以实施例1中PCR扩增产物A′/B′为模板，用对应于人CLC2B的cDNA序列5′和3′端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID NO.14和8)代替SEQ ID NO:7和8所示的引物。
PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为5′-CAAGAAGCTTATGTCCCTGACCCACAGGC-3′(SEQ ID NO.14)该引物含有HindⅢ限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的人CLC2B编码序列的19个核苷酸；3′端引物序列为5-TAGGGGATCCTCAATCGCTGATAAGCACT-3(SEQ ID NO.8)该引物含有BamHⅠ限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和人CLC2B的部分编码序列。
随后，用HindⅢ和BamHⅠ消化pcDNA3载体及插入片段，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，测序验证人CLC2B的cDNA片段已正确插入了载体。
如上用质粒转染CHO细胞、表达蛋白并分离纯化。获得的蛋白用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为20kDa。用常规方法对人CLC2B蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.12的序列一致。
实施例5制备抗体将实施例3和4中获得的CLC2A或CLC2B重组蛋白分别用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund′s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人CLC2A基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白发生沉淀。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人复旦大学(ⅱ)发明名称人夏科-莱登晶体2及其编码序列，以及制法和用途(ⅲ)序列数目14(2)SEQ ID NO.1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度23碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.1:CGAAGAGCTG CCCAGAAGGAGAG 23(2)SEQ ID NO.2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度24碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2TCCTCAACAA TGAGGAGTCTGATC 24(2)SEQ ID NO.3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度478bp(B)类型核酸
(C)链性双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.3:CGAAGAGCTG CCCAGAAGGA GAGAACAATG TCATCACTAC CCGTACCATA CACACTGCCT 60GTTTCCTTGC CTGTTGGTTC GTGCGTGATA ATCACAGGGA CACCGATCCT CACTTTTGTC 120AAGGACCCAC AGCTGGAGGT GAATTTCTAC ACTGGGATGG ATGAGGACTC AGATATTGCT 180TTCCAATTCC GACTGCACTT TGGTCATCCT GCAATCATGA ACAGTCGTGT GTTTGGCATA 240TGGAGATATG AGGAGAAATG CTACTATTTA CCCTTTGAAG ATGGCAAACC ATTTGAGCTG 300TGCATCTATG TGCGTCACAA GGAATACAAG GTAATGGTAA ATGGCCAACG CATTTACAAC 360TTTGCCCATC GATTCCCGCC AGCATCTGTG AAGATGCTGC AAGTCTTGAG AGATATCTCC 420CTGACCAGAG TGCTTATCAG CGATTGAGGG AGATGATCAG ACTCCTCATT GTTGAGGA478(2)SEQ ID NO.4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度139个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.4:Met Ser Ser Leu Pro Val Pro Tyr Thr Leu Pro Val Ser Leu Pro 15Val Gly Ser Cys Val Ile Ile Thr Gly Thr Pro Ile Leu Thr Phe 30Val Lys Asp Pro Gln Leu Glu Val Asn Phe Tyr Thr Gly Met Asp 45Glu Asp Ser Asp Ile Ala Phe Gln Phe Arg Leu His Phe Gly His 60Pro Ala Ile Met Ash Ser Arg Val Phe Gly Ile Trp Arg Tyr Glu 75Glu Lys Cys Tyr Tyr Leu Pro Phe Glu Asp Gly Lys Pro Phe Glu 90Leu Cys Ile Tyr Val Arg His Lys Glu Tyr Lys Val Met Val Asn 105Gly Gln Arg Ile Tyr Ash Phe Ala His Arg Phe Pro Pro Ala Ser 120Val Lys Met Leu Gln Val Leu Arg Asp Ile Ser Leu Thr Arg Val 135Leu Ile Ser Asp 139(2)SEQ ID NO.5的信息(ⅰ)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.5TCAGGTCGAC ATGTCATCACTACCCTACC 29(2)SEQ ID NO.6的信息(ⅰ)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.6:TAGGAAGCTT TCAATCGCTG ATAAGCACT 29(2)SEQ ID NO.7的信息(ⅰ)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.7TCAGAAGCTT ATGTCATCAC TACCCTACC 29(2)SEQ ID NO.8的信息(ⅰ)序列特征(A)长度29碱基
(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.8TAGGGGATCC TCAATCGCTG ATAAGCACT 29(2)SEQ ID NO.9的信息(ⅰ)序列特征(A)长度23碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.9:GTGACAGAGC AAGACCCTAT CTC 23(2)SEO ID NO.10的信息(ⅰ)序列特征(A)长度23碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10CAATGAGGAG TCTGATCATC TCC 23(2)SEQ ID NO.11的信息(ⅰ)序列特征(A)长度617bp(B)类型核酸(C)链性双链
(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.11:GTGACAGAGC AAGACCCTAT CTCAAAAATA CAGAAAAATC ATCAACCACT TGCAGTCGTC 60GTAGAAATCA ATCATTCCCT CCAGTTATGT CCCTGACCCA CAGGCTTCAT TTGTGCAAGT 120ACTGGGGCTG TGCTGTCAGT AATGTGTGCC GCTTCTGGGA AGGACGTCCA TTGCCCTTGA 180TGATTGTGGT ACCATACACA CTGCCTGTTT CCTTGCCTGT TGGTTCGTGC GTGATAATCA 240CAGGGACACC GATCCTCACT TTTGTCAAGG ACCCACAGCT GGAGGTGAAT TTCTACACTG 300GGATGGATGA GGACTCAGAT ATTGCTTTCC AATTCCGACT GCACTTTGGT CATCCTGCAA 360TCATGAACAG TCGTGTGTTT GGCATATGGA GATATGAGGA GAAATGCTAC TATTTACCCT 420TTGAAGATGG CAAACCATTT GAGCTGTGCA TCTATGTGCG TCACAAGGAA TACAAGGTAA 480TGGTAAATGG CCAACGCATT TACAACTTTG CCCATCGATT CCCGCCAGCA TCTGTGAAGA 540TGCTGCAAGT CTTGAGAGAT ATCTCCCTGA CCAGAGTGCT TATCAGCGAT TGAGGGAGAT 600GATCAGACTC CTCATTG 617(2)SEQ ID NO.12的信息(ⅰ)序列特征(A)长度168个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.12:Met Ser Leu Thr His Arg Leu His Leu Cys Lys Tyr Trp Gly Cys 15Ala Val Ser Ash Val Cys Arg Phe Trp Glu Gly Arg Pro Leu Pro 30Leu Met Ile Val Val Pro Tyr Thr Leu Pro Val Ser Leu Pro Val 45Gly Ser Cys Val Ile Ile Thr Gly Thr Pro Ile Leu Thr Phe Val 60Lys Asp Pro Gln Leu Glu Val Asn Phe Tyr Thr Gly Met Asp Glu 75Asp Ser Asp Ile Ala Phe Gln Phe Arg Leu His Phe Gly His Pro 90Ala Ile Met Ash Ser Arg Val Phe Gly Ile Trp Arg Tyr Glu Glu 105Lys Cys Tyr Tyr Leu Pro Phe Glu Asp Gly Lys Pro Phe Glu Leu 120Cys Ile Tyr Val Arg His Lys Glu Tyr Lys Val Met Val Asn Gly 135Gln Arg Ile Tyr Asn Phe Ala His Arg Phe Pro Pro Ala Ser Val 150Lys Met Leu Gln Val Leu Arg Asp Ile Ser Leu Thr Arg Val Leu 165Ile Ser Asp 168(2)SEQ ID NO.13的信息(ⅰ)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.13:CAAGGTCGAC ATGTCCCTGA CCCACAGGC 29(2)SEQ ID NO.14的信息(ⅰ)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.14:CAAGAAGCTT ATGTCCCTGA CCCACAGGC 29
权利要求
1．一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有人CLC2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸28-447位的核苷酸序列或SEQID NO.11中从核苷酸87-593位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸28-447位的核苷酸序列或SEQ ID NO.11中从核苷酸87-593位的核苷酸序列杂交。
2．如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4或12所示的序列。
3．如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸28-447位的核苷酸序列或SEQ ID NO.11中从核苷酸87-593位的核苷酸序列。
4．一种分离的人CLC2蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4或12氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
5．如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO.4或12序列的多肽。
6．一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。
7．一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。
8．一种产生具有人CLC2蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括(a)将编码具有人CLC2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人CLC2蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸28-447位的核苷酸序列或SEQ ID NO.11中从核苷酸87-593位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人CLC2蛋白的重组细胞；(c)在适合表达人CLC2蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人CLC2蛋白活性的多肽。
9．一种能与权利要求4所述的人CLC2蛋白多肽特异性结合的抗体。
10．一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。
全文摘要
本发明提供了人夏科－莱登晶体2(Charcot－Leyden Crystal 2,简称为“CLC6”)的cDNA序列,该cDNA编码的蛋白是人夏科－莱登晶体蛋白的同系物。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽,这些多核苷酸和多肽的应用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。
文档编号C07K16/00GK1303940SQ99119870
公开日2001年7月18日 申请日期1999年10月27日 优先权日1999年10月27日
发明者余龙, 傅强, 赵勇, 张宏来, 赵寿元 申请人:复旦大学