专利名称：抗铜绿假单胞菌e血清型脂多糖的抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种抗铜绿假单胞菌E血清型脂多糖的抗体及其应用。更具体地，本发明涉及一种特异性地结合于铜绿假单胞菌菌株E血清型脂多糖的抗体，以及各自均包括任意所述抗体的ー种药物组合物、一种用于铜绿假单胞菌感染的诊断剂和一种铜绿假单胞菌检测试剂盒。
背景技术：
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugiNOsa)是ー种革兰氏阴性需氧杆菌,其广泛而普遍地分布于自然环境中，例如土壌和水中。铜绿假单胞菌是ー种通常对健康受试者来说是非致病性的无致病カ细菌(avirulent bacterium),所述健康受试者对铜绿假单胞菌具有适度的抗体效价以及足够的免疫功能。然而，一旦体弱患者感染了铜绿假单胞菌，铜绿假 单胞菌可引起严重的症状，这可导致所述患者死亡。为此，铜绿假单胞菌作为医院感染和机会感染的ー种主要致病细菌已引起关注，并因此对铜绿假单胞菌感染的预防和治疗已经是医疗领域的重要问题。为了预防或治疗铜绿假单胞菌感染，已主要使用了抗生素或合成抗菌剂。但是，铜绿假单胞菌对此类药物产生了抗药性，因此此类药物在许多情况下不能提供足够的治疗作用。具体而言，用抗生素等治疗耐多药铜绿假单胞菌(MDRP)的感染很难，且具有局限性。为此，作为其替代方法，已实施使用免疫球蛋白制剂的治疗。同吋，已检验了使用抗铜绿假单胞菌的抗体预防或治疗铜绿假单胞菌感染。例如，已开发了每种均特异性地结合特定血清型的铜绿假单胞菌菌株的抗体(专利文献1-5，以及非专利文献I和2)。然而，迄今为止所开发的铜绿假单胞菌抗体在预防或治疗铜绿假单胞菌感染中尚不能提供足够的作用。[引用列表][专利文献][专利文献I]日本未审查专利申请公开号平成6-178688[专利文献2]日本未审查专利申请公开号平成6-178689[专利文献3]日本未审查专利申请公开号平成7-327677[专利文献4]国际公开号W02004/101622
[专利文献5]国际公开号W02006/084758[非专利文献][非专利文献 l]The Journal of Infectious Diseases, 152，6，1985，1290-1299.[非专利文献2] Journal of General Microbiology, 133, 1987, 3581-3590.
发明内容
[技术问题]鉴于上述情况而做出本发明，并且本发明的ー个目标是提供ー种对铜绿假单胞菌具有优良抗菌活性的新型抗体。本发明的ー个主要目标是提供一种特异性地结合铜绿假单胞菌菌株E血清型脂多糖的抗体。[技术方案]为实现上述目标，本发明采用了以下方法。首先，自患有慢性铜绿假单胞菌肺部感染的囊性纤维化病患者和健康志愿者中收集血液样本。具有高比例的特异性针对脂多糖(下文有时简称为“LPS”)的成浆细胞的供体样本用以下方式鉴定=(I)FACS分析，其测定循环血液中成浆细胞和浆细胞的量；(2) ELISP0T分析，其测定循环血液中产生特异性针对特定LPS抗原的抗体的细胞的量；(3) ELISA分析，其測定存在或不存在特异性针对特定LPS抗原的免疫球蛋白。之后，从由此鉴定的供体样本制备识别LPS的抗体。具体而言，存活的成浆细胞是通过使⑶19、⑶38、A轻链和死细胞染色而选择。在选出的成浆细胞上，通过包括多重重叠延伸RT-PCR和后续巢式PCR的两步PCR将来源自相同B细胞的编码重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的DNA序列(图I)结合起来。之后，将 扩增的DNA插入筛选载体,然后转化到大肠杆菌(Escherichia coli)中。从大肠杆菌中纯化全部扩增载体。所得抗体库在动物培养细胞中表达。编码结合于纯化LPS分子的抗体的克隆是通过ELISA来筛选，并选出LPS-特异性的克隆。然后，測定所选出克隆的碱基序列。之后，检验由此获得的克隆所编码的抗体的各种活性、其血清型特异性和抗原表位。結果，发现所鉴定的抗体结合铜绿假单胞菌E血清型LPS，并具有优良的体外和体内抗菌活性。具体而言，本发明涉及结合于铜绿假单胞菌E血清型LPS的抗体，其显示出优良的抗菌活性。本发明还涉及所述抗体的应用。更具体地，本发明提供了[I] ー种抗体，其识别铜绿假单胞菌脂多糖的B-带LPS，并牢固地(substantially)结合于E血清型铜绿假单胞菌菌株的表面，但不与A、B、C、D、F、G、H、I和M血清型铜绿假单胞菌菌株的表面中的任ー种牢固地结合。[2]条款I所述的抗体，其对E血清型铜绿假单胞菌菌株具有调理素活性。[3]条款2所述的抗体，其中对标识为ATCC29260的铜绿假单胞菌菌株的调理素活性的EC50为I u g/ml或以下。[4]条款I至3中任一项所述的抗体，其对E血清型铜绿假单胞菌菌株具有凝集活性。[5]条款4所述的抗体，其中单位量(U g) IgG对标识为ATCC29260的铜绿假单胞菌菌株的凝集效价为100或以上。[6]条款I至5中任一项所述的抗体，其对E血清型铜绿假单胞菌菌株的全身性感染具有抗菌作用。[7]条款6所述的抗体，其中对全身感染的中性白细胞减少症小鼠模型的抗菌作用的ED50不大于Venilon的1/30，所述全身感染是标识为ATCC29260的铜绿假单胞菌菌株的全身感染。[8]条款I至7中任一项所述的抗体，其对E血清型铜绿假单胞菌菌株的肺部感染具有抗菌作用。[9]条款8的抗体，其中对肺部感染的小鼠模型的抗菌作用具有至少ー种选自以下的性质，所述肺部感染是标识为ATCC29260的铜绿假单胞菌菌株的肺部感染
(a)当给小鼠接种标识为ATCC29260的铜绿假单胞菌菌株后立即给予小鼠所述抗体吋，对所述小鼠的抗菌作用的ED50不大于Venilon的1/500 ;和(b)当给小鼠接种标识为ATCC29260的铜绿假单胞菌菌株8小时后给予小鼠所述抗体时，对所述小鼠的抗菌作用的ED50不大于Venilon的1/3000。[10]条款I至9中任一项所述的抗体，其对E血清型铜绿假单胞菌菌株引起的烧伤创面感染(burn wound infection)具有抗菌作用。[11]条款10所述的抗体，其中对创面感染的小鼠模型的抗菌作用具有至少ー种选自以下的性质，所述烧伤创面感染为标识为ATCC29260的铜绿假单胞菌菌株的烧伤创面感染 (a)当给小鼠接种标识为ATCC29260的铜绿假单胞菌菌株后立即给予小鼠所述抗体吋，对所述小鼠的抗菌作用的ED50不大于Venilon的1/1500 ;和(b)当给小鼠接种标识为ATCC29260的铜绿假单胞菌菌株后25小时给予小鼠所述抗体时，对所述小鼠的抗菌作用的ED50不大于Venilon的1/2000。[12]具有以下(a)和(b)特征中任ー项的抗体(a)包含ー个轻链可变区，其包括SEQ ID NO: 1-3中所述的氨基酸序列，或其中在至少ー个序列中置換、缺失、增加和/或插入ー个或多个氨基酸的SEQ ID NO: 1-3中所述的氨基酸序列，和ー个重链可变区，其包括SEQ ID N0:4_6中所述的氨基酸序列，或其中在至少ー个序列中置換、缺失、增加和/或插入ー个或多个氨基酸的SEQ ID NO:4-6中所述的氨基酸序列，和(b)包含ー个轻链可变区，其包括SEQ ID N0:9_ll中所述的氨基酸序列，或其中在至少ー个序列中置換、缺失、增加和/或插入ー个或多个氨基酸的SEQ ID N0:9-ll中所述的氨基酸序列，和ー个重链可变区，其包括SEQ ID NO: 12-14中所述的氨基酸序列，或其中在至少ー个序列中置換、缺失、增加和/或插入ー个或多个氨基酸的SEQ ID NO: 12-14中所述的氨基酸序列。[13]具有以下(a)和(b)特征中任ー项的抗体(a)包含ー个轻链可变区，其包括SEQ ID NO: 7中所述的氨基酸序列，或其中置換、缺失、增加和/或插入ー个或多个氨基酸的SEQ ID NO:7中所述的氨基酸序列，和ー个重链可变区，其包括SEQ ID N0:8中所述的氨基酸序列，或其中置換、缺失、增加和/或插入ー个或多个氨基酸的SEQ ID NO:8中所述的氨基酸序列，和(b)包含ー个轻链可变区，其包括SEQ ID NO: 15中所述的氨基酸序列，或其中置換、缺失、增加和/或插入ー个或多个氨基酸的SEQ ID NO: 15中所述的氨基酸序列，和ー个重链可变区，其包括SEQ ID NO: 16中所述的氨基酸序列，或其中置换、缺失、增加和/或插入ー个或多个氨基酸的SEQ ID NO: 16中所述的氨基酸序列。
[14] ー种肽，包含所述抗体的轻链或轻链可变区，所述肽具有以下(a)和(b)特征中任ー项(a)包含SEQ ID NO: 1_3中所述的氨基酸序列或其中在至少ー个序列中置换、缺失、增加和/或插入ー个或多个氨基酸的SEQ ID NO: 1-3中所述的氨基酸序列；和(b)包含SEQ ID N0:9-ll中所述的氨基酸序列或其中在至少ー个序列中置换、缺失、增加和/或插入ー个或多个氨基酸的SEQ ID N0:9-ll中所述的氨基酸序列。[15] ー种肽，包含所述抗体的轻链或轻链可变区，所述肽具有以下(a)和(b)特征中任ー项(a)包含SEQ ID NO:7中所述的氨基酸序列或其中置換、缺失、增加和/或插入ー个或多个氨基酸的SEQ ID NO:7中所述的氨基酸序列；和
(b)包含SEQ ID NO: 15中所述的氨基酸序列或其中置換、缺失、增加和/或插入ー个或多个氨基酸的SEQ ID NO: 15中所述的氨基酸序列。[16] ー种肽，包含所述抗体的重链或重链可变区，所述肽具有以下(a)和(b)特征中任ー项(a)包含SEQ ID N0:4_6中所述的氨基酸序列或其中在至少ー个序列中置换、缺失、增加和/或插入ー个或多个氨基酸的SEQ ID NO:4-6中所述的氨基酸序列；和(b)包含SEQ ID NO: 12-14中所述的氨基酸序列或其中在至少ー个序列中置换、缺失、增加和/或插入ー个或多个氨基酸的SEQ ID NO: 12-14中所述的氨基酸序列。[17] ー种肽，包含所述抗体的重链或重链可变区，所述肽具有以下(a)和(b)特征中任ー项(a)包含SEQ ID N0:8中所述的氨基酸序列或其中置換、缺失、增加和/或插入ー个或多个氨基酸的SEQ ID NO:8中所述的氨基酸序列；和(b)包含SEQ ID NO: 16中所述的氨基酸序列或其中置換、缺失、增加和/或插入ー个或多个氨基酸的SEQ ID NO: 16中所述的氨基酸序列。[18] ー种抗体，其与以下(a)和(b)中任一项所述的抗体的表位结合，所述表位是E血清型铜绿假单胞菌菌株的脂多糖的B-带LPS中的(a) —种包括轻链可变区和重链可变区的抗体，其中所述轻链可变区包括SEQ IDNO:7中所述的氨基酸序列，所述重链可变区包括SEQ ID N0:8中所述的氨基酸序列；和(b) —种包括轻链可变区和重链可变区的抗体，其中所述轻链可变区包括SEQ IDNO: 15中所述的氨基酸序列，所述重链可变区包括SEQ ID NO: 16中所述的氨基酸序列。[19] ー种DNA，其编码条款I至18中任一项所述的抗体或肽。[20] 一种杂交瘤，其产生条款1-13和18中任一项所述的抗体。[21] 一种用于与铜绿假单胞菌有关的疾病的药用组合物，所述药用组合物包含条款1-13和18中任ー项的抗体，和任选地至少ー种可药用载体和/或稀释剂。[22]条款21所述的药用组合物，其中所述与铜绿假单胞菌有关的疾病是由铜绿假单胞菌感染引起的全身感染性疾病。[23]条款21所述的药用组合物，其中所述与铜绿假单胞菌有关的疾病是由铜绿假单胞菌感染引起的肺部感染性疾病。
[24]条款21所述的药用组合物，其中所述与铜绿假单胞菌有关的疾病是由铜绿假单胞菌感染引起的烧伤创面感染性疾病。[25] 一种用于检测铜绿假单胞菌的诊断剂，所述诊断剂包含条款1、12、13和18中任一项所述的抗体。[26] 一种用于检测铜绿假单胞菌的试剂盒，所述试剂盒包含条款I、12、13和18中任一项所述的抗体。[有益效果]本发明涉及一种结合铜绿假单胞菌E血清型LPS并显示出优良的抗菌活性的抗体。本发明的抗体可对铜绿假单胞菌引起的全身感染、肺部感染或烧伤创面感染显示出优良的调理素作用和优良的抗菌作用。此外，由于本发明的抗体来源自患有慢性铜绿假单胞菌肺部感染的囊性纤维化病患者，可预期对临床铜绿假单胞菌菌株的优良作用。本发明的
抗体可被制备为人类抗体的形式，因此是高度安全的。使用本发明的抗体使得可有效地治疗或预防由铜绿假单胞菌(包括耐多药铜绿假单胞菌)引起的感染，例如HAP/VAP、菌血症、败血症和烧伤创面感染。
图I是显示为获得编码本发明抗体的DNA而实施的两步PCR的图。图2是显示用于结合编码重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的序列的00-VP-002载体的图，所述重链可变区和轻链可变区源自相同的B细胞。图3是显示通过SPR测量获得的对抗体“2459”与抗体“ 1656”的加合性效应的分
析结果的曲线。
具体实施例方式本发明提供一种结合铜绿假单胞菌E血清型LPS的新型抗体。本发明中的“抗体”包括免疫球蛋白的所有类和所有子类。“抗体”包括多克隆抗体和单克隆抗体，还包括抗体的功能性片段形式。“多克隆抗体”指的是包含针对不同表位的不同种类抗体的抗体制剂。同吋，“单克隆抗体”表示由基本上同质的抗体群获得的抗体(包括抗体片段)。与多克隆抗体相比，单克隆抗体识别抗原上的单ー决定簇。本发明中的多克隆抗体还包括能够识别抗原上多种表位的多种单克隆抗体的结合物。本发明的抗体为分离的抗体，即，自自然环境中的组分中分离和/或回收的抗体。本发明的抗体结合的“脂多糖(LPS)”是指革兰氏阴性菌细胞壁外膜的成分，是由脂质和多糖(糖脂)形成的物质。糖链由称为核心多糖(或核心寡糖)的部分，和称为0抗原(0侧链多糖)的部分形成。“A-带LPS”是其多糖形成的0抗原具有以下结构的LPS。具体而言，在所述结构中，重复每个均由“ 3)-a -D-Rha-(I —2)-a -D-Rha-(I —3)-a -D-Rha-(I”组成的单元。在这些单元中，D-鼠李糖由a-1,2键和a-1,3键连接。其结构式如下所示；然而，由a -1，2键连接的D-鼠李糖和a -I, 3键连接的D-鼠李糖的支化模式不限于如下
所示的模式。
权利要求
1.ー种抗体，其识别铜绿假单胞菌脂多糖的B-带LPS，并且与E血清型铜绿假单胞菌菌株表面牢固地结合，但不与A、B、C、D、F、G、H、I和M血清型铜绿假单胞菌菌株表面中的任何ー种牢固地结合。
2.权利要求I的抗体，其对E血清型铜绿假单胞菌菌株具有调理素活性。
3.权利要求2的抗体，其中对标识为ATCC29260的铜绿假单胞菌菌株的调理素活性的EC50为I u g/ml或以下。
4.权利要求I至3中任ー项的抗体，其对E血清型铜绿假单胞菌菌株具有凝集活性。
5.权利要求4的抗体，其中单位量(Ug) IgG对标识为ATCC29260的铜绿假单胞菌菌株的凝集效价为100或以上。
6.权利要求I至5中任ー项的抗体，其对E血清型铜绿假单胞菌菌株的全身感染具有抗菌作用。
7.权利要求6的抗体，其中对全身感染的中性白细胞減少症小鼠模型的抗菌作用的ED50不大于Venilon的1/30，所述全身感染是标识为ATCC29260的铜绿假单胞菌菌株的全身感染。
8.权利要求I至7中任ー项的抗体，其对E血清型铜绿假单胞菌菌株的肺部感染具有抗菌作用。
9.权利要求8的抗体，其中对肺部感染的小鼠模型的抗菌作用具有至少ー种选自以下的性质，所述肺部感染是标识为ATCC29260的铜绿假单胞菌菌株的肺部感染 (a)当给小鼠接种标识为ATCC29260的铜绿假单胞菌菌株后立即给予小鼠所述抗体吋，对所述小鼠的抗菌作用的ED50不大于Venilon的1/500 ;和 (b)当给小鼠接种标识为ATCC29260的铜绿假单胞菌菌株8小时后给予小鼠所述抗体时，对所述小鼠的抗菌作用的ED50不大于Venilon的1/3000。
10.权利要求I至9中任ー项的抗体，其对E血清型铜绿假单胞菌菌株的烧伤创面感染具有抗菌作用。
11.权利要求10的抗体，其中对烧伤创面感染的小鼠模型的抗菌作用具有至少ー种选自以下的性质，所述烧伤创面感染为标识为ATCC29260的铜绿假单胞菌菌株的烧伤创面感染 (a)当给小鼠接种标识为ATCC29260的铜绿假单胞菌菌株后立即给予小鼠所述抗体吋，对所述小鼠的抗菌作用的ED50不大于Venilon的1/1500 ;和 (b)当给小鼠接种标识为ATCC29260的铜绿假单胞菌菌株25小时后给予小鼠所述抗体时，对所述小鼠的抗菌作用的ED50不大于Venilon的1/2000。
12.具有以下(a)和(b)特征中任ー项的抗体 (a)包含 ー个轻链可变区，其包括SEQ ID NO: 1-3中所述的氨基酸序列，或其中在至少ー个序列中置換、缺失、增加和/或插入ー个或多个氨基酸的SEQ ID NO: 1-3中所述的氨基酸序列，和 ー个重链可变区，其包括SEQ ID N0:4-6中所述的氨基酸序列，或其中在至少ー个序列中置換、缺失、增加和/或插入ー个或多个氨基酸的SEQ ID N0:4-6中所述的氨基酸序列，和(b)包含 一个轻链可变区，其包括SEQ ID N0:9-ll中所述的氨基酸序列，或其中在至少一个序列中置换、缺失、增加和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID N0:9-ll中所述的氨基酸序列，和 一个重链可变区，其包括SEQ ID NO: 12-14中所述的氨基酸序列，或其中在至少一个序列中置换、缺失、增加和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO: 12-14中所述的氨基酸序列。
13.具有以下(a)和(b)特征中任一项的抗体 (a)包含 一个轻链可变区，其包括SEQ ID NO: 7中所述的氨基酸序列，或其中置换、缺失、增加和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID N0:7中所述的氨基酸序列，和 一个重链可变区，其包括SEQ ID N0:8中所述的氨基酸序列，或其中置换、缺失、增加和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID N0:8中所述的氨基酸序列，和 (b)包含 一个轻链可变区，其包括SEQ ID NO: 15中所述的氨基酸序列，或其中置换、缺失、增加和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO: 15中所述的氨基酸序列，和 一个重链可变区，其包括SEQ ID NO: 16中所述的氨基酸序列，或其中置换、缺失、增加和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO: 16中所述的氨基酸序列。
14.一种肽，包含所述抗体的轻链或轻链可变区，所述肽具有以下(a)和(b)特征中任一项 (a)包含SEQID NO: 1-3中所述的氨基酸序列或其中在至少一个序列中置换、缺失、增加和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO: 1-3中所述的氨基酸序列；和 (b)包含SEQID N0:9-ll中所述的氨基酸序列或其中在至少一个序列中置换、缺失、增加和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID N0:9-ll中所述的氨基酸序列。
15.一种肽，包含所述抗体的轻链或轻链可变区，所述肽具有以下(a)和(b)特征中任一项 (a)包含SEQID NO:7中所述的氨基酸序列或其中置换、缺失、增加和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:7中所述的氨基酸序列；和 (b)包含SEQID NO: 15中所述的氨基酸序列或其中置换、缺失、增加和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO: 15中所述的氨基酸序列。
16.一种肽，包含所述抗体的重链或重链可变区，所述肽具有以下(a)和(b)特征中任一项 (a)包含SEQID N0:4-6中所述的氨基酸序列或其中在至少一个序列中置换、缺失、增加和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:4-6中所述的氨基酸序列；和 (b)包含SEQID NO: 12-14中所述的氨基酸序列或其中在至少一个序列中置换、缺失、增加和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO: 12-14中所述的氨基酸序列。
17.一种肽，包含所述抗体的重链或重链可变区，所述肽具有以下(a)和(b)特征中任一项 (a)包含SEQ ID N0:8中所述的氨基酸序列或其中置换、缺失、增加和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:8中所述的氨基酸序列；和 (b)包含SEQ ID NO: 16中所述的氨基酸序列或其中置換、缺失、增加和/或插入ー个或多个氨基酸的SEQ ID NO: 16中所述的氨基酸序列。
18.ー种抗体，其与以下(a)和(b)中任一项所述抗体的表位结合，所述表位是E血清型铜绿假单胞菌菌株的脂多糖的B-带LPS中的 (a)—种包括轻链可变区和重链可变区的抗体，其中所述轻链可变区包括SEQID NO:7中所述的氨基酸序列，所述重链可变区包括SEQ ID N0:8中所述的氨基酸序列；和 (b)ー种包括轻链可变区和重链可变区的抗体，其中所述轻链可变区包括SEQ IDNO: 15中所述的氨基酸序列，所述重链可变区包括SEQ ID NO: 16中所述的氨基酸序列。
19.ー种DNA，其编码权利要求I至18中任ー项的抗体或肽。
20.一种杂交瘤，其产生权利要求1-13和18中任ー项的抗体。
21.一种用于与铜绿假单胞菌相关的疾病的药物组合物，所述药物组合物包含 权利要求1-13和18中任ー项的抗体；和任选地 至少ー种可药用载体和/或稀释剂。
22.权利要求21的药物组合物，其中所述与铜绿假单胞菌相关的疾病是由铜绿假单胞菌感染引起的全身感染性疾病。
23.权利要求21的药物组合物，其中所述与铜绿假单胞菌有关的疾病是由铜绿假单胞菌感染弓I起的肺部感染性疾病。
24.权利要求21的药物组合物，其中所述与铜绿假单胞菌有关的疾病是由铜绿假单胞菌感染引起的烧伤创面感染性疾病。
25.一种用于检测铜绿假单胞菌的诊断剂，所述诊断剂包含权利要求1、12、13和18中任ー项的抗体。
26.一种用于检测铜绿假单胞菌的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1、12、13和18中任ー项的抗体。
全文摘要
本发明提供了一种新的抗体，其具有优良的抗铜绿假单胞菌的抗菌活性。通过用获自患有慢性铜绿假单胞菌肺部感染的囊性纤维化病患者的成浆细胞作为起始材料，成功获得结合于E血清型铜绿假单胞菌菌株的LPS且具有优良的体外和体内抗菌活性的抗体。
文档编号A61P31/04GK102858974SQ20118001024
公开日2013年1月2日 申请日期2011年2月18日 优先权日2010年2月18日
发明者田中二朗, P·S·安德森, 奥富隆文, 稻叶常良, 大冢圭子, 赤羽宏友, 星名由佳利, 斋藤淳, 长曽宏, 熊谷正志, 荻原康世 申请人:明治制果药业株式会社, 西福根有限公司