专利名称：生物酶法提取鸡蛋蛋黄寡糖的制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物酶法提取鸡蛋蛋黄寡糖的制备工艺。
背景技术：
水解酶PNGase F为N-糖苷酶F(Peptide-N4-(N-acetyl-β-D-glucosaminyl)asparigiene amidase；EC 3.5.1.52)，由314个氨基酸组成，分子量为34779Da。能够从糖肽和糖蛋白表面完整地切下N-糖苷，其作用位点是N-乙酰葡萄糖胺残基和天冬酰胺之间的价键结构。本发明所用PNGase F是将来源于脑膜炎农杆菌(Flavobacterium meningoseptium)的N-糖苷酶F基因重组到S.cerevisiae细胞表面进行表达的，酶活测定结果为20U/L发酵液(1个酶活单位定义为每分钟能够完全水解1μmol核糖核酸酶B)。
研究证明，唾液酸寡糖在细胞识别、病毒感染和中和毒素等生命活动中起着非常重要的作用，其糖链末端的唾液酸残基是多种病原体和毒素侵染细胞的识别结合位点，如流感病毒和造成幼儿腹泻的轮状病毒；同时，对肝廓清机制的研究表明，能够清除血液中异源复合物的肝凝集素，是去唾液酸糖蛋白受体(ASGR)，它能够识别去掉唾液酸的半乳糖残基，因此带有唾液酸寡糖的重组蛋白药物可明显提高药物在血液中的稳定性和半衰期；日本科学家饲喂小鼠的实验证明，日粮中添加一定比例的蛋黄唾液酸寡糖，可明显提高幼鼠的智力(Yamamoto，T.，et al，Oyotosbitsu Kagaku 9，15-18)。因此，寡糖，尤其是唾液酸寡糖在医药、食品等行业中有很大的应用开发潜力。目前，在人乳、牛乳、鸡蛋等材料中，已成功的分离出游离的唾液酸寡糖成分，并进行了结构分析鉴定和其生物学活性的试验，唾液酸寡糖化学合成的研究也是糖合成研究的热点之一，肼解法也成功的从鸡蛋蛋黄中分离出蛋黄唾液酸寡糖(Koketsu，M.，et al，Journal of Food Science 58，743-747)，但由于受材料和成本的限制，以上所得到的唾液酸寡糖只是用于分析鉴定，日本TaiyoKagaku公司里用蛋白酶水解法制备带有唾液酸寡糖的糖肽产品(SunsialTM)已广泛地应用于各类功能食品(Koketsu，M.，et al，1995c，Journal ofAgricultural and Food Chemistry 43，858-861)，利用酸水解法从蛋黄中制备唾液酸的工艺已投入了应用(European Patent，Publication number0474410A2)，我国江南大学工业生物技术重点实验室利用酸水解法在蛋黄中制备高唾液酸含量的水解清液(仇海英等，食品科技，2003，No228-33)。但截止于目前为止，还未见利用鸡蛋蛋黄或生产蛋黄抗体的废液进行规模制备唾液酸寡糖的报道。
鸡蛋使人们公认的具有较高营养价值的食品，作为生命起源的基础，鸡蛋中贮有大量的各类功能化合物，从鸡蛋中提取制备的蛋黄抗体(IgY)、软磷脂等产品目前已广泛的应用于医药、食品和化妆品等行业。近年来的研究证明，鸡蛋蛋黄中的唾液酸含量可高达0.2％，而且还含有2.8μmol/eggyolk(8.0mg/egg yolk，蛋黄干重为9.6克)的带有N-糖苷的游离糖肽，鸡蛋蛋黄是一个具有高含量N-糖苷的物质库。同时，在蛋黄抗体的制备中，其生产废液中还存有大量的糖蛋白，游离糖肽没有损失，而且蛋白未被变性处理，利于进行后续的酶解操作，将此废液作为蛋黄寡糖提取制备的原料，原料成本极为低廉，急需一种适于进行产业化操作的制备方法。
发明内容
为解决上述技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种生物酶法提取鸡蛋蛋黄寡糖的制备工艺，该制备方法是以新鲜鸡为蛋黄原料，价格适中，而且寡糖资源无任何损失，产品收率高，容易产业化。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是提供一种生物酶法提取鸡蛋蛋黄寡糖的制备工艺，其工艺流程包括以下步骤筛选蛋黄原料、脱脂、蛋白酶水解变性处理、离心后取上清液、N-糖苷酶F水解、离心后取上清液、超滤、脱盐、离子交换、减压干燥、蛋黄寡糖产品、产品检测、包装、成品。
所述蛋黄原料包括有A)新鲜鸡蛋中的蛋黄；B)商品化的蛋黄粉；C)蛋黄抗体生产的下脚料废液。
所述脱脂为低温离心脱脂法，其条件为温度-10℃-4℃，转速为3000-6000rpm，时间为1-3hr。
所述蛋白酶水解中的蛋白酶为木瓜蛋白酶，最适酶解温度为50-70℃，最适pH值为7.0，酶解作用时间2-24hr。
所述N-糖苷酶F水解工艺，是利用在酿酒酵母表面表达的N-糖苷酶，直接加入水解液进行酶解或利用固定化细胞的方法水解液过柱进行酶解择一，酶解条件温度为25-42℃，时间2-48hr。
所述超滤为截留分子量为10000的膜过滤。
所述酶解最佳条件为30-37℃，20-36hr。
所述超滤为采用截留分子量为10000的膜过滤，操作压力为0.4Mpa，操作温度为40-55℃。
所述超滤的最佳温度条件为45-50℃。
所述脱盐为通过葡聚糖凝胶G25的脱盐柱或纳滤进行脱盐，脱盐后电导率低于200μs/cm。
本发明的效果是利用在酿酒酵母表面高效表达的N-糖苷酶F，通过酶法水解鸡蛋蛋黄中糖蛋白和糖肽，提取制备蛋黄N-寡糖，尤其是提取制备N-唾液酸寡糖的技术工艺，它可利用低廉的生物材料，大量提取制备某些具有重要生物学功能和应用价值的寡糖，与合成法相比，本方法的寡糖制造成本大大降低，有利于产业化操作。采用不同的蛋黄原料进行蛋黄寡糖的制备，并取得了较高纯度的蛋黄N-寡糖的混合物，本制备方法特别是以新鲜鸡为蛋黄原料，价格适中，而且寡糖资源无任何损失，产品收率高。
图1为本发明的工艺流程图。
具体实施例方式
结合附图及实施例对本发明的生物酶法提取鸡蛋蛋黄寡糖的制备工艺加以说明。
本发明的蛋黄寡糖主要是存在于鸡蛋蛋黄中糖蛋白和糖肽所携带的N-寡糖，所提取的酸性寡糖的主要结构为N连接双天线唾液酸寡糖链，其结构为 如图1所示，本发明工艺技术流程为以下步骤筛选蛋黄原料A.新鲜鸡蛋中的蛋黄；B.商品化的蛋黄粉；C.蛋黄抗体生产的下脚料废液。
脱脂所述的脱脂工艺包括有有机溶剂脱脂法(适于蛋黄粉)和低温离心脱脂法(适于液体原料)，从环保和操作安全考虑，本发明推荐使用后者。低温离心脱脂的条件为-10℃-4℃，3000rpm，1hr。
蛋白酶水解所用蛋白酶为木瓜蛋白酶，最适酶解温度为50-70℃，最适pH为7.0，酶解作用时间2-24hr。
变性处理变性处理是指加热至90℃，时间20min处理，使蛋白酶灭活，并增加N-糖苷酶F的酶解效率。
离心后取上清液N-糖苷酶F水解所指N-糖苷酶F水解工艺，是利用在酿酒酵母表面表达的PNGase，直接加入水解液进行酶解，或利用固定化细胞的方法，水解液过柱进行酶解。酶解条件为25-42℃，2-48hr。最佳条件为30-37℃，20-36hr。
离心后取上清液超滤(分子量截留为10kD)所述的超滤工艺为截留分子量为10000的膜过滤，操作压力为0.4Mpa，操作温度为40-55℃，最佳温度条件为45-50℃。
脱盐所述的脱盐工艺为通过葡聚糖凝胶G25的脱盐柱或纳滤进行脱盐，脱盐后电导率低于200μs/cm，其中，纳滤在脱盐的同时还起到了浓缩的作用，可减低后续工艺的负担。
离子交换减压干燥后得到蛋黄寡糖产品经产品检测所述产品检测方法是指纯度和含量测定，可用薄层层析法(TLC)或高效薄层层析法(HPTLC)进行纯度检测，酸性寡糖可通过间苯二酚法测定的唾液酸含量来确定酸性寡糖的含量，蛋黄寡糖总含量的测定可利用酸水解后测定还原糖的含量来确定。
最后包装、成品。
本发明是一种适于进行规模化操作的，利用生物酶法提取制备鸡蛋蛋黄寡糖的工艺流程。
具体实施例
实施例1利用蛋黄粉制备蛋黄寡糖1.1蛋黄粉的脱脂1.1.1丙酮萃取取蛋黄粉2000克(购自大连生化制药公司)，加入10升丙酮，加热至回流(57-58℃)，回流2小时后，停止加热，静止30分钟，弃去上清液(橙黄色)，重复上述操作2次。
1.1.2甲醇萃取丙酮萃取结束后，用相同体积的甲醇按上述方法萃取三次。
1.1.3脱脂蛋黄粉(DEY，dilapidated egg yolk)的制备萃取结束后，45℃干燥过夜，将干燥产品称重结果为813克，将DEY至于干燥处室温放置备用。
1.2蛋白酶处理DEY将制备的800克DEY溶于8000ml 0.01mol/l的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，并加入32克木瓜蛋白酶(Fisher Scientific Ltd.)，在搅拌状态下65℃酶解反应4小时后，90℃减压浓缩至2000ml。
浓缩后的酶水解液离心处理(3000g，30分钟，室温)，上清液用0.22μm滤膜过滤，收集体积为1220ml，放置已灭菌的2000ml三角瓶中备用。
1.3 N-糖苷酶F酶解1.3.1 N-糖苷酶F的制备培养细胞表面表达N-糖苷酶F的酿酒酵母细胞(Saccharomyces cereviae，此重组酵母菌种为本课题组构建)2000ml，诱导表达后，离心收集湿菌体26克，备用。
1.3.2酶解条件在上述收集的1220ml水解液中加入乙酸钠1.09克，SDS 1.2克，用浓乙酸调pH至5.5。在旋转震荡条件下(80rpm)，37℃，酶解24小时。
1.3.3酶解液后处理酶解结束后，水解液离心处理，其工艺条件为温度4℃，转速6000rpm，时间10min，收集上清液约1250ml备用。
1.4寡糖分离1.4.1超滤处理用搅拌杯式超滤器，选用截留分子量为10000的滤膜，氮气加压过滤，滤层用去离子水洗涤4次，30ml/次。收集滤过液，共1300ml，70℃减压浓缩至200ml，4℃放置备用。
1.4.2纳滤浓缩、除盐在纳滤过程中，由DS-11型电导仪检测透过液的电导率，并不断用去离子水进行洗涤，直至电导率降至180μs/cm，收集纳滤后的浓缩液，共50ml，4℃放置备用。
1.4.3离子交换柱分离寡糖选用东洋曹达DEAE-Toyopearl 650M阴离子交换树脂，5mM Tris-HCl缓冲液pH值8.0平衡交换柱，用NaCl溶液进行梯度洗脱为0-0.1M，流速30ml/min，10ml/收集管，HPTLC检测，最后收集第10-18管，检测阳性，合并，按1.4.2所述方法，再次进行纳滤脱盐，直至透过液电导率恒定至150μs/cm，共收集得到50ml脱盐浓缩液。
1.4.4减压、冷冻干燥用RE 52A型上海亚荣生化仪器厂生产的旋转蒸发仪，先将50ml脱盐浓缩液在60℃条件下，减压浓缩至20ml体积，再利用冷冻干燥去出剩余水分，共得到2.1克干品。
实施例2利用新鲜鸡蛋制备蛋黄寡糖2.1脱脂蛋黄的制备取100个新鲜鸡蛋，破碎后取蛋黄，得到1.6升蛋黄液，将此蛋黄液冰浴冷冻至4℃，加入5倍体积的等离子水，温度为4℃，剧烈搅拌1小时(整个操作过程中，溶液温度在-10℃-4℃之间)，离心处理的工艺条件为温度4℃，转速4000rpm，时间1hr后，收集上清液，共9.2升，即为脱脂蛋黄溶液。在此过程中温度掌握在-10℃-4℃之间，均能达到上述同样的结果。
2.2蛋白酶酶解在制备蛋黄溶液中，并加入30克木瓜蛋白酶(Fisher Scientific Ltd.)，在搅拌状态下65℃酶解反应4小时后，90℃减压浓缩至2000ml。
浓缩后的酶水解液离心处理(8000g，30分钟，4℃)，上清液用0.22μm滤膜过滤，收集体积为1850ml，放置已灭菌的2000ml三角瓶中备用。
2.3 N-糖苷酶F酶解2.3.1 N-糖苷酶F的制备培养重组酿酒酵母细胞1500ml，诱导表达后，离心收集湿菌体20克，备用。
2.3.2酶解条件在上述收集的1850ml水解液中加入乙酸钠1.65克，SDS 1.85克，用浓乙酸调pH至5.5。在震荡条件下，37℃，酶解24小时。
2.3.3酶解液后处理酶解结束后，水解液离心处理工艺条件温度4℃，转速6000rpm，时间10分钟后，收集上清液约1800ml备用。
2.4寡糖分离2.4.1超滤处理用搅拌杯式超滤器，选用截留分子量为10000的滤膜，氮气加压过滤，滤层用去离子水洗涤3次，30ml/次，收集滤过液，共1900ml，70℃减压浓缩至400ml，4℃放置备用。
2.4.2纳滤浓缩、除盐在纳滤过程中，由DS-11型电导仪检测透过液的电导率，并不断用去离子水进行洗涤，直至电导率降至180μs/cm，收集纳滤后的浓缩液，共30ml，4℃放置备用。
2.4.3离子交换柱分离寡糖选用东洋曹达DEAE-Toyopearl 650M阴离子交换树脂，5mM Tris-HCl缓冲液pH值8.0平衡交换柱，用NaCl溶液进行梯度洗脱为0-0.1M，流速30ml/min，10ml/收集管，HPTLC检测，最后收集第10-18管(检测阳性)，合并，按2.4.2所述方法，再次进行纳滤脱盐，直至透过液电导率恒定至150μs/cm，共收集得到50ml脱盐浓缩液。
2.4.4冷冻干燥利用冷冻干燥去出剩余水分，共得到3.3克蛋黄寡糖产品。
2.5产品检测间苯二酚法检测结果产品唾液酸含量为0.31克；还原糖检测结果为产品还原糖含量为91％(以葡萄糖为基准)。
实施例3利用蛋黄抗体制备废液制备蛋黄寡糖3.1原料脱脂取9升原料液(山东省农科院家禽研究所提供)，1000克冰块，剧烈搅拌1小时(整个操作过程中，溶液温度不高于4℃)，离心处理(4℃，4000g，1hr)后，收集上清液，共9.6升，即为脱脂蛋黄溶液。
3.2蛋白酶酶解在制备蛋黄溶液中，并加入20克木瓜蛋白酶(Fisher Scientific Ltd.)，在搅拌状态下65℃酶解反应4小时后，90℃减压浓缩至2000ml。
浓缩后的酶水解液离心处理(8000g，30分钟，4℃)，上清液用0.22μm滤膜过滤，收集体积为1920ml，放置已灭菌的2000ml三角瓶中备用。
3.3 N-糖苷酶F酶解
3.3.1 N-糖苷酶F的制备培养重组酿酒酵母细胞1000ml，诱导表达后，离心收集湿菌体13克，备用。
3.3.2酶解条件在上述收集的1900ml水解液中加入乙酸钠1.70克，SDS 1.90克，用浓乙酸调pH至5.5。在旋转震荡条件下(80rpm)，37℃，酶解24小时。
3.3.3酶解液后处理酶解结束后，水解液离心处理(4℃，6000rpm，10min)，收集上清液约1850ml备用。
3.4寡糖分离3.4.1超滤处理用搅拌杯式超滤器，选用截留分子量为10000的滤膜，氮气加压过滤，滤层用去离子水洗涤(50ml/次)3次，收集滤过液，共2000ml，70℃减压浓缩至300ml，4℃放置备用。
3.4.2纳滤浓缩、除盐在纳滤过程中，由DS-11型电导仪检测透过液的电导率，并不断用去离子水进行洗涤，直至电导率降至180μs/cm，收集纳滤后的浓缩液，共30ml，4℃放置备用。
3.4.3离子交换柱分离寡糖选用东洋曹达DEAE-Toyopearl 650M阴离子交换树脂，5mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)平衡交换柱，用NaCl溶液进行梯度洗脱(0-0.1M)，流速30ml/min，10ml/收集管，HPTLC检测，最后收集第10-18管(检测阳性)，合并，按2.4.2所述方法，再次进行纳滤脱盐，直至透过液电导率恒定至150μs/cm，共收集得到50ml脱盐浓缩液。
3.4.4冷冻干燥利用冷冻干燥去出剩余水分，共得到1.45克蛋黄寡糖产品。
3.5产品检测间苯二酚法检测结果产品唾液酸含量为0.13克；还原糖检测结果为产品还原糖含量为94％(以葡萄糖为基准)。
通过以上实例可以看出，本发明利用重组N-糖苷酶F，采用不同的蛋黄原料进行蛋黄寡糖的制备，并取得了较高纯度的蛋黄N-寡糖的混合物，证明本发明的制备方法是可行的。特别是以新鲜鸡为蛋黄原料，价格适中，而且寡糖资源无任何损失，产品收率高，其产业化开发的潜力很大。
权利要求
1.一种生物酶法提取鸡蛋蛋黄寡糖的制备工艺，其工艺流程如下筛选蛋黄原料→脱脂→蛋白酶水解→变性处理→离心后取上清液→N-糖苷酶F水解→离心后取上清液→超滤→脱盐→离子交换→减压干燥→蛋黄寡糖产品→产品检测→包装→成品。
2.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征是所述蛋黄原料包括有A)新鲜鸡蛋中的蛋黄；B)商品化的蛋黄粉；C)蛋黄抗体生产的下脚料废液。
3.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征是所述脱脂为低温离心脱脂法，其所需离心温度为-10℃-4℃，转速为3000-6000rpm，时间为1-3hr。
4.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征是所述蛋白酶水解中的蛋白酶为木瓜蛋白酶，最适酶解温度为50-70℃，最适pH值为7.0，酶解作用时间2-24hr。
5.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征是所述N-糖苷酶F水解工艺，是利用在酿酒酵母表面表达的PNGase，直接加入水解液进行酶解或利用固定化细胞的方法水解液过柱进行酶解，酶解条件温度为25-42℃，时间2-48hr。
6.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征是所述超滤为截留分子量为10000的膜过滤。
7.根据权利要求5所述的制备工艺，其特征是所述酶解最佳条件为30-37℃，20-36hr。
8.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征是所述超滤为采用截留分子量为10000的膜过滤，操作压力为0.4Mpa，操作温度为40-55℃。
9.根据权利要求7所述的制备工艺，其特征是所述超滤的最佳温度条件为45-50℃。
10.根据权利要求7所述的制备工艺，其特征是所述脱盐为通过葡聚糖凝胶G25的脱盐柱或纳滤进行脱盐，脱盐后电导率低于200μs/cm。
全文摘要
本发明提供一种生物酶法提取鸡蛋蛋黄寡糖的制备工艺，其工艺流程包括以下步骤筛选蛋黄原料、脱脂、蛋白酶水解变性处理、离心后取上清液、N－糖苷酶F水解、离心后取上清液、超滤、脱盐、离子交换、减压干燥、蛋黄寡糖产品、产品检测、包装、成品。有益效果是利用低廉的生物材料，大量提取制备某些具有重要生物学功能和应用价值的寡糖，与合成法相比，本方法的寡糖制造成本大大降低，有利于产业化操作。采用不同的蛋黄原料进行蛋黄寡糖的制备，并取得了较高纯度的蛋黄N－寡糖的混合物，本制备方法特别是以新鲜鸡为蛋黄原料，价格适中，而且寡糖资源无任何损失，产品收率高。
文档编号C12P19/08GK1680570SQ20051001310
公开日2005年10月12日 申请日期2005年1月17日 优先权日2005年1月17日
发明者王鹏 申请人:天津科贝思生物试剂有限公司