愈伤组织诱导培养基及其制备方法、使用方法与流程

本发明涉及植物组织培养的技术领域，更具体地说，涉及一种愈伤组织诱导培养基及其制备方法、使用方法。

背景技术：

绿萝(学名:Epipremnum aureum)，属于天南星科麒麟叶属植物，大型常绿藤本，生长于热带地区，常攀援生长在雨林的岩石和树干上，其缠绕性强，气根发达，可以水培种植。

绿萝是非常优良的室内装饰植物之一，攀藤观叶花卉。萝茎细软，叶片娇秀。在家具的柜顶上高置套盆，任其蔓茎从容下垂，或在蔓茎垂吊过长后圈吊成圆环，宛如翠色浮雕。这样既充分利用了空间，净化了空气，又为呆板的柜面增加了线条活泼、色彩明快的绿饰，极富生机，给居室平添融融情趣。形态特征：绿萝藤长数米，节间有气根，随生长年龄的增加，茎增粗，叶片亦越来越大。叶互生，绿色，少数叶片也会略带黄色斑驳，全缘，心形。它的花语“守望幸福”也增加了其可观赏度。

环保学家发现，一盆绿萝在8～10平方米的房间内就相当于一个空气净化器，能有效吸收空气中甲醛、苯和三氯乙烯等有害气体。绿萝不但生命力顽强，而且在室内摆放，其净化空气的能力不亚于常春藤和吊兰。新铺的地板非常容易产生有害物质。由于绿萝能同时净化空气中的苯、三氯乙烯和甲醛，因此非常适合摆放在新装修好的居室中。

绿萝还具有很好的药用价值，具有活血散瘀的功效。可以治疗跌打损伤。

植物组织培养中要用到各种培养基。培养基是供微生物、植物组织和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)以及维生素和水等。不同培养基可根据实际需要，添加一些自身无法合成的化合物，即生长因子。

但是目前，还没有专门适合于绿萝组织培养的培养基，严重影响了对绿萝这种经典材料的研究。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的缺陷，提供了一种愈伤组织诱导培养基，培养基原料包括6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、噻苯隆、2,4-二氯苯氧乙酸、蔗糖、琼脂粉，以及第一基础培养基MS培养基；

第一基础培养基MS培养基pH值为5.5-5.8；

第一基础培养基MS培养基以MS培养基为基础，在其它成分不变的条件下调整大量元素的含量为原量的1/4，微量元素为原量的1/2，调整肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇和烟酸的含量分别为：1～5mg/L、3～6mg/L、0.5～2mg/L、0.5～3mg/L，并添加精氨酸50mg/L、天冬氨酸100mg/L、谷氨酸150mg/L。

在某些实施方式中，如权利要求1所述的愈伤组织诱导培养基，所述6-苄氨基腺嘌呤的浓度为2.0mg/L、萘乙酸的浓度为0.2mg/L、蔗糖20-30g/L、琼脂粉7g/L、噻苯隆0.1mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.05mg/L。

本发明还提供了一种愈伤组织诱导培养基的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：将6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、蔗糖、、噻苯隆、2,4-二氯苯氧乙酸、琼脂粉分别灭菌，3-5℃保存备用；

步骤二：第一基础培养基MS培养基溶解，加入6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、蔗糖、噻苯隆、2,4-二氯苯氧乙酸、琼脂粉溶液，制得愈伤组织诱导培养基；

步骤三：将定容好的的培养基PH调到5.5-5.8。

步骤四：将配制好的培养基进行高温灭菌，制得第一愈伤组织诱导培养基。

在某些实施方式中，所述步骤一中的灭菌方法为抽滤灭菌或高温灭菌；灭菌完成后20-25℃放置。

在某些实施方式中，所述步骤三中高温灭菌的温度为121℃，灭菌时间为30min。

本发明还提供了一种愈伤组织诱导培养基，培养基原料包括6-苄氨基腺嘌呤、6-糠基氨基嘌呤、萘乙酸、吲哚丁酸、水解酪蛋白、蔗糖、琼脂粉，以及第二基础培养基MS培养基；

第二基础培养基MS培养基pH值为5.5-5.8；

第二基础培养基MS培养基是以MS培养基为基础，在其它成分不变的条件下调整大量元素的含量为原量的1/2，调整肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇和烟酸的含量分别为：1～5mg/L、3～6mg/L、0.5～2mg/L、0.5～3mg/L，并添加精氨酸100mg/L、天冬氨酸50mg/L、谷氨酸200mg/L。

在某些实施方式中，所述6-苄氨基腺嘌呤的浓度为3.0mg/L、6-糠基氨基嘌呤0.1mg/L、吲哚丁酸的浓度为0.1mg/L、蔗糖20-30g/L、萘乙酸0.2mg/L、琼脂粉7g/L。

本发明还提供了一种愈伤组织诱导培养基的使用方法：将绿萝茎段消毒后在无菌条件下切割成小段，将其接种于愈伤组织诱导培养基中诱导形成愈伤组织后接种于愈伤组织的继代培养基中增殖获得致密愈伤组织。

在某些实施方式中，所述诱导增殖的步骤包括：

步骤一：利用第一愈伤组织诱导培养基在温度为23～25℃、湿度为50～65％的条件下，黑暗培养5～15天后给予1500～20001x光照继续培养，15～25天得到初期绿萝愈伤组织；

步骤二：将初期绿萝愈伤组织转接于第二愈伤组织诱导培养基在温度为25～28℃、湿度为50～65％条件下，暗培养一周后给予光照条件20001x，继续培养，加速愈伤组织的形成。

在某些实施方式中，所述绿萝茎段消毒后在无菌条件下切割成小段；小段的长度为2～3cm；常规消毒后用可溶性聚乙烯吡硌烷酮2g/L浸泡10～15分钟。

本发明提供的愈伤组织诱导培养基相对于现有技术的有益效果是：愈伤组织一方面可研究植物生长发育及分化的机制、遗传变异规律，对植物遗传育种具有特殊意义。

另一方面可用于大规模工厂化生产有用化合物，或用于细胞培养筛选工业、农业、医药生产上有用的无性系，或用于原生质体培养中的原生质体来源等。实践证明，愈伤组织培养不仅是一种植物快繁的新手段，同时也是植物改良，种质保存和有用化合物生产的理想途径。本发明利用愈伤组织诱导培养基进行绿萝的生产，通过组织培养技术对绿萝顶芽或带节茎段进行培养与快速繁殖，繁育处的绿萝种苗品质优良，为绿萝规模化生产提供了较好的技术支持。

实验结果表明组织培养的绿萝无菌苗，可大量节约母本地，缩短生产周期，避免或减小天气等不良因素引起的病虫害。

同时，以该愈伤组织诱导培养基诱导绿萝顶芽或带节茎段为繁殖材料更容易诱导成功。

愈伤组织诱导培养基原料包括6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、蔗糖、琼脂粉，以及基础培养基MS培养基。

其中，6-苄氨基腺嘌呤有味6-BA。是人工合成的细胞分裂素。6-BA具有抑制植物叶内叶绿素、核酸、蛋白质的分解，保绿防老；将氨基酸、生长素、无机盐等向处理部位调运等多种效能。

其中，萘乙酸(1-NapHthaleneacetic acid)，简称NAA。萘乙酸是促进植物根系生长的植物生长调节剂，也是萘乙酰胺的中间体。萘乙酸具有促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根，增加坐果，防止落果，改变雌、雄花比率等。萘乙酸可经叶片、树枝的嫩表皮、种子进入到植物体内，随同营养流输导到作用部位。通常用于小麦、水稻、棉花、茶、桑、番茄、苹果、瓜类、马铃薯、林木等，是一种良好的植物生长刺激素。

其中，蔗糖为细胞的分裂、扩大、增至提供必要的能量。

琼脂粉是从植物里提取出来的藻胶。琼脂因为有特殊的胶凝性质，尤其有显着的稳固性、滞度和滞后性，并且易吸收水分，有特殊的稳定效应；具有增量剂、增稠剂、乳化剂、胶凝剂、稳定剂、赋形剂、助悬剂、水分保持剂等功效。

本发明还提供了一种愈伤组织诱导培养基，培养基原料包括6-苄氨基腺嘌呤、6-糠基氨基嘌呤、萘乙酸、吲哚丁酸、水解酪蛋白、蔗糖、琼脂粉，以及第二基础培养基MS培养基。

其中，吲哚丁酸促进植物主根生长，提高发芽率，成活率。用于促使插条生根。

吲哚丁酸可以作为植物主根生长促进剂，常用于木本和草本植物的浸根移栽，硬枝杆插，能加速根的生长，提高植物生根的百分率，也可用于植物种子的浸种和拌种，可提高发芽率和成活率。高浓度吲哚丁酸也可促进部分组培苗的增殖。

综上所述，本发明提供的愈伤组织诱导培养基其具有上述诸多的优点及价值，并在同类产品中未见有类似的方法公开发表或使用而确属创新，产生了好用且实用的效果，较现有的技术具有增进的多项功效，从而较为适于实用，并具有广泛的产业价值。

附图说明

应当理解的是，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为诱导出的绿萝茎段膨大体；

图2为诱导出的绿萝愈伤组织。

具体实施方式

下面结合具体实施例的方式对本发明的权利要求做进一步的详细说明，在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。

但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

提供了一种愈伤组织诱导培养基，培养基原料包括6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、噻苯隆、2,4-二氯苯氧乙酸、蔗糖、琼脂粉，以及第一基础培养基MS培养基；

第一基础培养基MS培养基pH值为5.5-5.8；

第一基础培养基MS培养基以MS培养基为基础，在其它成分不变的条件下调整大量元素的含量为原量的1/4，微量元素为原量的1/2，调整肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇和烟酸的含量分别为：1～5mg/L、3～6mg/L、0.5～2mg/L、0.5～3mg/L，并添加精氨酸50mg/L、天冬氨酸100mg/L、谷氨酸150mg/L。

上述，需要理解的是，MS培养基为组织的生长提供所需的碳源,氮源,水,无机物和生长因子。

可以理解的是，6-苄氨基腺嘌呤有味6-BA。是人工合成的细胞分裂素。6-BA具有抑制植物叶内叶绿素、核酸、蛋白质的分解，保绿防老；将氨基酸、生长素、无机盐等向处理部位调运等多种效能。

可以理解的是，萘乙酸(1-NapHthaleneacetic acid)，简称NAA。萘乙酸是促进植物根系生长的植物生长调节剂，也是萘乙酰胺的中间体。萘乙酸具有促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根，增加坐果，防止落果，改变雌、雄花比率等。萘乙酸可经叶片、树枝的嫩表皮、种子进入到植物体内，随同营养流输导到作用部位。通常用于小麦、水稻、棉花、茶、桑、番茄、苹果、瓜类、马铃薯、林木等，是一种良好的植物生长刺激素。

可以理解的是，蔗糖为细胞的分裂、扩大、增至提供必要的能量。

可以理解的是，琼脂粉是从植物里提取出来的藻胶。琼脂因为有特殊的胶凝性质，尤其有显着的稳固性、滞度和滞后性，并且易吸收水分，有特殊的稳定效应；具有增量剂、增稠剂、乳化剂、胶凝剂、稳定剂、赋形剂、助悬剂、水分保持剂等功效。

在本发明实施例中，所述6-苄氨基腺嘌呤的浓度为2.0mg/L、萘乙酸的浓度为0.2mg/L、蔗糖20-30g/L、琼脂粉7g/L、噻苯隆0.1mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.05mg/L。

本发明还提供了一种愈伤组织诱导培养基的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：将6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、蔗糖、、噻苯隆、2,4-二氯苯氧乙酸、琼脂粉分别灭菌，3-5℃保存备用；

步骤二：第一基础培养基MS培养基溶解，加入6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、蔗糖、噻苯隆、2,4-二氯苯氧乙酸、琼脂粉溶液，制得愈伤组织诱导培养基；

步骤三：将定容好的的培养基PH调到5.5-5.8。

步骤四：将配制好的培养基进行高温灭菌，制得第一愈伤组织诱导培养基。

在本发明实施例中，所述步骤一中的灭菌方法为抽滤灭菌或高温灭菌；灭菌完成后20-25℃放置。

在本发明实施例中，所述步骤三中高温灭菌的温度为121℃，灭菌时间为30min。

本发明还提供了一种愈伤组织诱导培养基，培养基原料包括6-苄氨基腺嘌呤、6-糠基氨基嘌呤、萘乙酸、吲哚丁酸、水解酪蛋白、蔗糖、琼脂粉，以及第二基础培养基MS培养基；

第二基础培养基MS培养基pH值为5.5-5.8；

第二基础培养基MS培养基是以MS培养基为基础，在其它成分不变的条件下调整大量元素的含量为原量的1/2，调整肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇和烟酸的含量分别为：1～5mg/L、3～6mg/L、0.5～2mg/L、0.5～3mg/L，并添加精氨酸100mg/L、天冬氨酸50mg/L、谷氨酸200mg/L。

上述，可以理解的是，吲哚丁酸促进植物主根生长，提高发芽率，成活率。用于促使插条生根。

吲哚丁酸可以作为植物主根生长促进剂，常用于木本和草本植物的浸根移栽，硬枝杆插，能加速根的生长，提高植物生根的百分率，也可用于植物种子的浸种和拌种，可提高发芽率和成活率。高浓度吲哚丁酸也可促进部分组培苗的增殖。

在本发明实施例中，所述6-苄氨基腺嘌呤的浓度为3.0mg/L、6-糠基氨基嘌呤0.1mg/L、吲哚丁酸的浓度为0.1mg/L、蔗糖20-30g/L、萘乙酸0.2mg/L、琼脂粉7g/L。

本发明还提供了一种愈伤组织诱导培养基的使用方法：将绿萝茎段消毒后在无菌条件下切割成小段，将其接种于愈伤组织诱导培养基中诱导形成愈伤组织后接种于愈伤组织的继代培养基中增殖获得致密愈伤组织。

上述，愈伤组织一方面可研究植物生长发育及分化的机制、遗传变异规律，对植物遗传育种具有特殊意义。

另一方面可用于大规模工厂化生产有用化合物，或用于细胞培养筛选工业、农业、医药生产上有用的无性系，或用于原生质体培养中的原生质体来源等。实践证明，愈伤组织培养不仅是一种植物快繁的新手段，同时也是植物改良，种质保存和有用化合物生产的理想途径。本发明利用愈伤组织诱导培养基进行绿萝的生产，通过组织培养技术对绿萝顶芽或带节茎段进行培养与快速繁殖，繁育处的绿萝种苗品质优良，为绿萝规模化生产提供了较好的技术支持。

需要理解的是，组织培养的绿萝无菌苗，可大量节约母本地，缩短生产周期，避免或减小天气等不良因素引起的病虫害。

同时，以该愈伤组织诱导培养基诱导绿萝顶芽或带节茎段为繁殖材料更容易诱导成功。

在本发明实施例中，所述诱导增殖的步骤包括：

步骤一：利用第一愈伤组织诱导培养基在温度为23～25℃、湿度为50～65％的条件下，黑暗培养5～15天后给予1500～20001x光照继续培养，15～25天得到初期绿萝愈伤组织；

步骤二：将初期绿萝愈伤组织转接于第二愈伤组织诱导培养基在温度为25～28℃、湿度为50～65％条件下，暗培养一周后给予光照条件20001x，继续培养，加速愈伤组织的形成。

在本发明实施例中，所述绿萝茎段消毒后在无菌条件下切割成小段；小段的长度为2～3cm；常规消毒后用可溶性聚乙烯吡硌烷酮2g/L浸泡10～15分钟。

为了便于理解本发明，下面结合实施例来进一步说明本发明的技术方案。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明应依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

实施例1

愈伤组织诱导培养基诱导增殖的步骤包括：将绿萝茎段消毒后在无菌条件下切割成2cm小段，常规消毒后用可溶性聚乙烯吡硌烷酮2g/L浸泡10分钟；

步骤一：利用第一愈伤组织诱导培养基在温度为23℃、湿度为50％的条件下，黑暗培养10天后给予1500x光照继续培养，20天得到初期绿萝愈伤组织；

步骤二：将初期绿萝愈伤组织转接于第二愈伤组织诱导培养基在温度为25℃、湿度为50％条件下，暗培养一周后给予光照条件20001x，继续培养，加速愈伤组织的形成；

其中，第一愈伤组织诱导培养基中包括6-苄氨基腺嘌呤的浓度为2.0mg/L、萘乙酸的浓度为0.2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂粉7g/L、噻苯隆0.1mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.05mg/L，以及第一基础培养基MS培养基；

第一基础培养基MS培养基pH值为5.5；

第一基础培养基MS培养基以MS培养基为基础，在其它成分不变的条件下调整大量元素的含量为原量的1/4，微量元素为原量的1/2，调整肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇和烟酸的含量分别为：1mg/L、3mg/L、0.5mg/L、0.5mg/L，并添加精氨酸50mg/L、天冬氨酸100mg/L、谷氨酸150mg/L。

实施例2

愈伤组织诱导培养基诱导增殖的步骤包括：将绿萝茎段消毒后在无菌条件下切割成4cm小段，常规消毒后用可溶性聚乙烯吡硌烷酮2g/L浸泡10分钟；

步骤一：利用第一愈伤组织诱导培养基在温度为25℃、湿度为65％的条件下，黑暗培养15天后给予21000x光照继续培养，25天得到初期绿萝愈伤组织；

步骤二：将初期绿萝愈伤组织转接于第二愈伤组织诱导培养基在温度为28℃、湿度为65％条件下，暗培养一周后给予光照条件20001x，继续培养，加速愈伤组织的形成；

其中，第一愈伤组织诱导培养基中包括6-苄氨基腺嘌呤的浓度为2.0mg/L、萘乙酸的浓度为0.2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂粉7g/L、噻苯隆0.1mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.05mg/L，以及第一基础培养基MS培养基；

第一基础培养基MS培养基pH值为5.8；

第一基础培养基MS培养基以MS培养基为基础，在其它成分不变的条件下调整大量元素的含量为原量的1/4，微量元素为原量的1/2，调整肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇和烟酸的含量分别为：5mg/L、6mg/L、2mg/L、3mg/L，并添加精氨酸50mg/L、天冬氨酸100mg/L、谷氨酸150mg/L。

实施例3

愈伤组织诱导培养基诱导增殖的步骤包括：将绿萝茎段消毒后在无菌条件下切割成3cm小段，常规消毒后用可溶性聚乙烯吡硌烷酮2g/L浸泡15分钟；

步骤一：利用第一愈伤组织诱导培养基在温度为25℃、湿度为65％的条件下，黑暗培养10天后给予2000lx光照继续培养，25天得到初期绿萝愈伤组织；

步骤二：将初期绿萝愈伤组织转接于第二愈伤组织诱导培养基在温度为26℃、湿度为60％条件下，暗培养一周后给予光照条件2000lx，继续培养，加速愈伤组织的形成；

其中，第一愈伤组织诱导培养基中包括6-苄氨基腺嘌呤的浓度为2.0mg/L、萘乙酸的浓度为0.2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂粉7g/L、噻苯隆0.1mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.05mg/L，以及第一基础培养基MS培养基；

第一基础培养基MS培养基pH值为5.8；

第一基础培养基MS培养基以MS培养基为基础，在其它成分不变的条件下调整大量元素的含量为原量的1/4，微量元素为原量的1/2，调整肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇和烟酸的含量分别为：3mg/L、4mg/L、1.5mg/L、1.5mg/L，并添加精氨酸50mg/L、天冬氨酸100mg/L、谷氨酸150mg/L。