本发明属于微嫁接技术领域，具体地说涉及一种无核葡萄胚挽救畸形苗的试管微嫁接方法。
背景技术：
葡萄属植物属于葡萄科 (Vitaceae Lindl.) 葡萄属 (Vitis L.)，是世界“四大水果”之一，在我国国民经济中占有重要地位，无核葡萄更是饱受人们青睐。“种子败育型 (stenospermocarpy)”无核，即经过正常授粉和受精作用后，合子胚发育过程中败育而不形成正常的种子，仅存在不影响口感的种痕 (seed trace) 。由于其不能形成合子胚，无法遗传给F1代，所以在无核葡萄育种中很少研究利用。目前新兴的胚挽救技术，实现了以无核品种作为母本，远缘杂交改良葡萄品种成为可能，丰富了杂交组合的配置方式，大大节省了育种周期，后代无核比率也得到了很大的提高。然而在通过胚挽救技术进行葡萄育种的过程中，难免会形成发育不健康的的畸形苗，这些来之不易的胚挽救苗即使在试验室条件下暂时存活，由于它的形态和功能上的缺陷，也会导致它在移植大田后最终死亡，严重影响了无核葡萄育种效率。
根据外观形态的不同，将胚挽救过程中产生的畸形苗分为以下七类：(1) 单子叶畸形苗；(2) 无叶无根苗；(3) 子叶扭曲褶皱状畸形苗；(4) 分化过程中形成的白化苗；(5) 下胚轴形成短根，但没有子叶；(6) 上胚轴形成子叶，但没有根；(7) 萌发后早期停止生长的小苗。
试管微嫁接是一种在无菌条件下将砧木与接穗进行嫁接、培养的技术，是植物组织培养与嫁接技术的结合，具有周期短、占用空间少、见效快、研究结果可靠性强、嫁接体生长条件可人为控制等优点。
为解决来之不易的胚挽救畸形苗由于自身生理缺陷无法最终在大田成活的问题，发明人经过多年的研究，发明了一种无核葡萄胚挽救畸形苗试管的微嫁接方法。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种无核葡萄胚挽救畸形苗试管微嫁接方法，该方法以假单性结实葡萄品种（stenospermocarpy）的胚挽救苗作为砧木，以无核葡萄胚挽救畸形苗作为接穗，简便易行，完善了无核葡萄胚挽救技术体系，提高了无核葡萄育种效率，为葡萄试管苗嫁接相关理论研究提供新的科学研究基础。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的无核葡萄胚挽救畸形苗试管微嫁接方法，包括如下步骤：
（1）砧木准备：在最佳取样期选取无核葡萄品种的种子无菌接种在固体胚培养培养基上，暗培养9~10周后，将发育胚无菌接种于胚萌发培养基上，1周后转为光培养，苗龄2~3周后，两片子叶平展且具一片真叶时即可用于做砧木嫁接，培养室条件为：温度控制在23 ± 1 °C，相对湿度 65% ± 5 %，光照强度 200 ± 50 μmol·m-2s-1，每天 16 h；
（2）接穗选择：在最佳取样期选取无核葡萄品种的种子无菌接种在固体胚培养培养基上，暗培养9~10周后，将发育胚无菌接种于胚萌发培养基上，1周后转为光培养，苗龄2~3周后，选择无核葡萄胚挽救畸形苗为接穗，培养室条件为：温度控制在23 ± 1 °C，相对湿度 65% ± 5 %，光照强度 200 ± 50 μmol·m-2s-1，每天 16 h；
(3) 嫁接：将步骤（1）准备的砧木子叶及其以上部分切去，并将其下胚轴中间纵切形成切口，将步骤（2）准备的接穗下端斜切出“V”形伤口，将接穗插于砧木切口，使砧木和接穗的形成层紧密接触，用parafilm封口膜紧裹接口；
（4）嫁接体再培养：将步骤（3）得到的嫁接苗无菌接种于生根培养基中，置于组培室中进行再培养，培养室条件为：温度控制在25 ± 1 °C，相对湿度 70% ± 5 %，光照强度 400 ± 50 μmol·m-2s-1，每天 16 h；
（5）嫁接苗移栽：当嫁接体苗龄3~4周，将成活的嫁接苗于驯化室驯化后，移栽于育苗基质中培养至具4~6片真叶移栽到大田，按常规栽培方式管理。
所述的最佳取样期是指在无核葡萄种子发育至最大重量，即将进入败育程序时。
所述的无核葡萄品种是指假单性结实葡萄品种（stenospermocarpy）。
所述的种子无菌接种是指人工采收未成熟的葡萄浆果，实验室去除其穗轴，置于广口瓶内，自来水冲洗30 min后，超净工作台内用75 % 乙醇浸泡 30 s，再用无菌水冲洗3次，倒入1 %浓度的升汞溶液浸泡果粒6 min，期间振荡2~3次，再用无菌水冲洗3次，将果粒剖开，选取2~5mm的胚珠接种于胚珠发育培养基中，每个150~250mL三角瓶内接种20~30个胚珠，置于组培间架子上盖上黑布，进行暗培养。
所述的固体胚培养培养基为：MM4 + 香蕉泥500 mg/L；胚萌发培养基为：WPM + BA 0.2 mg/L；生根培养基为：2MS + IBA 0.1 mg/L + 6-BA 0.4 mg/L。
所述的发育胚无菌接种是指在超净工作台内，解剖镜下剖开胚珠，将其喙端发育的白色胚接种至胚萌发培养基，每个直径20 mm、长150 mm的试管内接种一个发育胚。
所述的无核葡萄胚挽救畸形苗是指上胚轴形成子叶但没有根的胚挽救畸形苗。
所述的嫁接苗驯化包括如下步骤：将培养瓶置于日光温室中驯化锻炼1周，然后打开瓶口，加入少量自来水保湿锻炼2~3 d，移栽前先用流水洗去幼苗根部附着的培养基，移栽至装有高温灭菌基质的小盆中，用800倍多菌灵和1/10 MS的营养液浇灌，同时加盖口径略小于小盆的透明塑料杯保持湿度，移栽后每3 d浇灌一次营养液和多菌灵溶液，15 d后将塑料杯顶部剪去一个小口，进行气孔闭合锻炼，再过15 d后，塑料杯顶部全部剪开，再15 d后，将塑料杯移去，同时注意适当遮荫和防虫。
所述的嫁接苗驯化栽培基质为：珍珠岩：草炭：园土=4：1：1。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：（1）本发明提供了一种再利用无核葡萄胚挽救畸形苗的育种材料的方法。在通过胚挽救技术进行葡萄育种的过程中，难免会形成发育不健康的的畸形苗，这些来之不易的胚挽救苗即使在试验室条件下暂时存活，由于它的形态和功能上的缺陷，也会导致它在移植大田后最终死亡，严重影响了无核葡萄育种效率。无核葡萄胚挽救畸形苗的微嫁接技术可有效改善这一状况，完善无核葡萄胚挽救技术体系，提高无核葡萄育种效率。（2）本发明去除了砧木子叶和生长点，嫁接操作简单，移栽田间后无需去除砧木上的侧芽，省工省时，并且使营养充分供给接穗。（3）无核葡萄胚挽救苗作为砧木，时间上可以做到无缝衔接，可直接试管内操作形成“无核葡萄砧木-胚挽救畸形苗”嫁接体。（4）无论是作为砧木还是接穗的胚挽救苗，达到幼苗标准即可直接用于嫁接，无需再继代，节约时间。（5）本发明方法易行、操作简便，可有效改善胚挽救畸形苗仅能在试验室条件下暂时存活这一状况，完善无核葡萄胚挽救技术体系，提高无核葡萄育种效率。（6）本发明对微嫁接技术的应用提供了新的途径，也为嫁接相关基础理论研究提供了科学的研究系统。
具体实施方式
本发明的无核葡萄胚挽救畸形苗试管微嫁接方法，包括如下步骤：
（1）砧木准备：当无核葡萄种子发育至最大重量，即将进入败育程序时，选取假单性结实葡萄品种（stenospermocarpy）即无核葡萄品种的种子，种子无菌接种在固体胚培养培养基上。所述的种子无菌接种是指人工采收未成熟的葡萄浆果，实验室去除其穗轴，置于广口瓶内，自来水冲洗30 min后，超净工作台内用75 % 乙醇浸泡 30 s，再用无菌水冲洗3次，倒入1 %浓度的升汞溶液浸泡果粒6 min，期间振荡2~3次，再用无菌水冲洗3次，将果粒剖开，选取2~5mm的胚珠接种于胚珠发育培养基中，每个150~250mL三角瓶内接种20~30个胚珠，置于组培间架子上盖上黑布，进行暗培养。所述的固体胚培养培养基为：MM4 + 香蕉泥500 mg/L。暗培养9~10周后，将发育胚无菌接种于胚萌发培养基上，所述的发育胚无菌接种是指在超净工作台内，解剖镜下剖开胚珠，将其喙端发育的白色胚接种至胚萌发培养基，每个直径20 mm、长150 mm的试管内接种一个发育胚。所述的胚萌发培养基为：WPM + BA 0.2 mg/L。再培养1周后转为光培养，苗龄2~3周后，两片子叶平展且具一片真叶时即可用于做砧木嫁接。上述培养的培养室条件为：温度控制在23 ± 1 °C，相对湿度 65% ± 5 %，光照强度 200 ± 50 μmol·m-2s-1，每天 16 h。
（2）接穗选择：当无核葡萄种子发育至最大重量，即将进入败育程序时，选取假单性结实葡萄品种（stenospermocarpy）即无核葡萄品种的种子，种子无菌接种在固体胚培养培养基上。所述的种子无菌接种是指人工采收未成熟的葡萄浆果，实验室去除其穗轴，置于广口瓶内，自来水冲洗30 min后，超净工作台内用75 % 乙醇浸泡 30 s，再用无菌水冲洗3次，倒入1 %浓度的升汞溶液浸泡果粒6 min，期间振荡2~3次，再用无菌水冲洗3次，将果粒剖开，选取2~5mm的胚珠接种于胚珠发育培养基中，每个150~250mL三角瓶内接种20~30个胚珠，置于组培间架子上盖上黑布，进行暗培养。所述的固体胚培养培养基为：MM4 + 香蕉泥500 mg/L。暗培养9~10周后，将发育胚无菌接种于胚萌发培养基上，所述的发育胚无菌接种是指在超净工作台内，解剖镜下剖开胚珠，将其喙端发育的白色胚接种至胚萌发培养基，每个直径20 mm、长150 mm的试管内接种一个发育胚。所述的胚萌发培养基为：WPM + BA 0.2 mg/L。再培养1周后转为光培养，苗龄2~3周后，选择无核葡萄胚挽救畸形苗为接穗，所述的无核葡萄胚挽救畸形苗是指上胚轴形成子叶但没有根的胚挽救畸形苗。培养室条件为：温度控制在23 ± 1 °C，相对湿度 65% ± 5 %，光照强度 200 ± 50 μmol·m-2s-1，每天 16 h。
(3) 嫁接：将步骤（1）准备的砧木子叶及其以上部分切去，并将其下胚轴中间纵切形成切口，将步骤（2）准备的接穗下端斜切出“V”形伤口，将接穗插于砧木切口，使砧木和接穗的形成层紧密接触，用parafilm封口膜紧裹接口。
（4）嫁接体再培养：将步骤（3）得到的嫁接苗无菌接种于生根培养基中，所述的生根培养基为：2MS + IBA 0.1 mg/L + 6-BA 0.4 mg/L。置于组培室中进行再培养，培养室条件为：温度控制在25 ± 1 °C，相对湿度 70% ± 5 %，光照强度 400 ± 50 μmol·m-2s-1，每天 16 h。
（5）嫁接苗移栽：当嫁接体苗龄3~4周，将成活的嫁接苗于驯化室驯化，所述的嫁接苗驯化包括如下步骤：将培养瓶置于日光温室中驯化锻炼1周，然后打开瓶口，加入少量自来水保湿锻炼2~3 d，移栽前先用流水洗去幼苗根部附着的培养基，移栽至装有高温灭菌基质的小盆中，用800倍多菌灵和1/10 MS的营养液浇灌，同时加盖口径略小于小盆的透明塑料杯保持湿度，移栽后每3 d浇灌一次营养液和多菌灵溶液，15 d后将塑料杯顶部剪去一个小口，进行气孔闭合锻炼，再过15 d后，塑料杯顶部全部剪开，再15 d后，将塑料杯移去，同时注意适当遮荫和防虫。当嫁接苗在育苗基质中培养至具4~6片真叶移栽到大田，按常规栽培方式管理。所述的嫁接苗驯化栽培基质为：珍珠岩：草炭：园土=4：1：1。