本发明涉及一种结球甘蓝花粉诱导培养基配方，具体涉及一种可以大大提高结球甘蓝花粉胚性愈伤的诱导效率、具有重要的应用价值的结球甘蓝花粉诱导培养基配方，属于农业生物技术领域。
背景技术：
结球甘蓝（Brassica oleraca L. var capitata L.）简称甘蓝，又名洋白菜、包心菜、疙瘩白、圆白菜、卷心菜等，属于十字花科芸薹属二年生植物。甘蓝是世界上公认的保健蔬菜之一，营养丰富，含有20多种营养元素，如异硫氰酸盐、类胡萝卜素、维生素C等，特别是含有对胃及十二指肠溃疡有明显止痛和促进愈合作用的稀有维生素-维生素U，而且甘蓝还具有适应性强、耐寒性强、耐储运、四季均可种植的优点，因此深受人们喜爱。甘蓝在我国蔬菜结构中占有举足轻重的地位，种植面积仅次于大白菜，是我国第二大叶用蔬菜。近年来随着国内周年供应需求及出口贸易的增加，甘蓝种植面积呈逐年扩大的趋势，现已达到了每年约90万hm2。
出于甘蓝产业发展的需要，加强高产、优质、抗病甘蓝育种显得尤为重要。甘蓝为异花授粉作物，具有显著的杂种优势，生产上甘蓝种子绝大多数为F1代杂种，因而杂交育种成为甘蓝育种的主要方式。杂种F1的选配是由优良的自交系亲本杂交获得的，而甘蓝优良自交系选育主要采用杂交后代连续自交定向选择获得，这种方法纯和速度慢、育种时间长，一般需要6-8年，且连续自交多代后容易出现植株衰退现象。
花粉培养，又叫游离小孢子培养，是一种快速纯合自交系和创制新育种材料的有效育种途径，选育周期短，仅需1-2年，育种效率显著。近年来，十字花科单倍体育种逐步得到发展，花粉培养作为人工诱导单倍体的有效途径具有实用性、单细胞单倍体性和较高胚胎发生率及较高同步性等特点，不仅可作为重要的细胞筛选系统和基因转移的受体，而且也是获得纯合双单倍体的快捷方法，目前已成为当前生物技术育种中的方法之一。
在十字花科芸薹属作物中，先后对油菜、芥菜、甘蓝、大白菜、小白菜和花椰菜等进行了花粉培养并获得了再生植株。国内外学者对影响芸薹属作物花粉培养的一些因素进行了研究，取得了显著的进展，但甘蓝花粉培养研究进展缓慢，多数具有价值的甘蓝材料花粉诱导胚性愈伤产量低而不稳定，限制了该方法在甘蓝育种中的应用。因此，只有掌握了甘蓝花粉培养技术的关键影响因素，完善甘蓝花粉培养体系，才能在最短的时间内获得纯合自交系，配制优良的杂交组合，选育更多新的优良品种，提高结球甘蓝育种效率和育种水平。
培养基是花粉培养的物质基础，培养基组分对花粉的刺激和启动，是花粉能否诱导成功的最关键的因素。不仅基本培养基组分的配比可显著影响小孢子诱导效率，而且多种有机和无知添加物可以显著提高小孢子诱导效率。现有研究证明，相对于禾本科和茄科作物，低离子浓度的基本培养基配方对十字花科花粉诱导更加有利，活性炭、硝酸银等一些添加物可以显著提高甘蓝花粉的诱导能力。
前人试验中甘蓝花粉愈伤诱导率的低下，主要还是由于培养基活性添加物开发不足的结果。因此，不仅根据十字花科作物单倍体培养的前人研究，而参照禾本科、茄科等其它植物相对比较成熟的花培体系所采用的活性添加物，来试验开发适合于甘蓝花粉培养的活性添加物，是研发高效的甘蓝花粉诱导培养基的可行之路。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种可以大大提高结球甘蓝花粉胚性愈伤的诱导效率、具有重要的应用价值的结球甘蓝花粉诱导培养基配方。
本发明的目的是通过以下技术方案解决的：
一种结球甘蓝花粉诱导培养基配方，其特征在于：该培养基的配方如下：
KNO3 56-64mg/L，MgSO4∙7H2O 60-65mg/L，KH2PO4 65-70mg/L，Ca(NO3)2∙4H2O 200-250mg/L，Na2-EDTA 11-14mg/L，FeSO4∙7H2O 12-15mg/L，MnSO4∙4H2O 23-27mg/L，AgNO3 8-12mg/L，H3BO3 8.0-8.5mg/L，ZnSO4∙7H2O 8.5-9.5mg/L，KI 0.8-0.85mg/L，Na2MoO4∙2H2O 0.2-0.3mg/L，CuSO4∙5H2O 0.02-0.03mg/L，CoCl2∙6H2O 0.02-0.03mg/L，L-谷氨酰胺 750-850mg/L，N-乙酰基-5-甲氧基色胺 180-220mg/L，维生素B1 0.45-0.55mg/L，维生素B6 0.45-0.55mg/L，2-吗啉乙磺酸 560-620mg/L，烟酸 4.5-5.5mg/L，叶酸 0.04-0.06mg/L，生物素 0.04-0.06mg/L，肌醇 90-110mg/L，山梨醇 12～14g/L，甘氨酸 3.5-4.5mg/L，脯氨酸 45-55mg/L，丝氨酸 25-35mg/L，阿拉伯半乳聚糖 12-16mg/L，甲基亚硝基脲 1.2-1.8g/L，蔗糖 120-140g/L，植物凝胶 3.0-3.5g/L，6-BA 0.18-0.22mg/L，胰岛素 8-12mg/L，水解蛋白 0.5-0.7g/L，活性炭 0.03-0.05g/L，pH 6.2-6.4。
本发明相比现有技术有如下优点：
本发明针对甘蓝花粉的孢子体发育特性，继续优化并组合基本培养基配比，低离子浓度基本培养基的组配，有利于甘蓝花粉胚的诱导；采用低含量的植物凝胶，使配制成的培养基半固体化，对甘蓝花粉诱导更有利；开发试验针对于提高甘蓝花粉胚诱导能力的有机和无机添加物，AgNO3、N-乙酰基-5-甲氧基色胺、2-吗啉乙磺酸、叶酸、生物素、山梨醇、脯氨酸、丝氨酸、阿拉伯半乳聚糖、甲基亚硝基脲、胰岛素、水解蛋白和活性炭等物质的合适浓度的添加，均不同程度的提高了甘蓝花粉胚的诱导率。
本发明所提供的甘蓝花粉诱导培养基，是在现有研究发现基础之上进一步创造性改良的成果，是经过大量单因子、多因子试验所筛选的最优组合，我们进行了大量的实验研究亦得出本发明的组分配比是最优的。采用本发明所提供的培养基可以大大提高结球甘蓝花粉胚性愈伤的诱导效率，因此具有重要的应用价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
一种结球甘蓝花粉诱导培养基配方，其特征在于：该培养基的配方如下：
KNO3 56-64mg/L，MgSO4∙7H2O 60-65mg/L，KH2PO4 65-70mg/L，Ca(NO3)2∙4H2O 200-250mg/L，Na2-EDTA 11-14mg/L，FeSO4∙7H2O 12-15mg/L，MnSO4∙4H2O 23-27mg/L，AgNO3 8-12mg/L，H3BO3 8.0-8.5mg/L，ZnSO4∙7H2O 8.5-9.5mg/L，KI 0.8-0.85mg/L，Na2MoO4∙2H2O 0.2-0.3mg/L，CuSO4∙5H2O 0.02-0.03mg/L，CoCl2∙6H2O 0.02-0.03mg/L，L-谷氨酰胺 750-850mg/L，N-乙酰基-5-甲氧基色胺 180-220mg/L，维生素B1 0.45-0.55mg/L，维生素B6 0.45-0.55mg/L，2-吗啉乙磺酸 560-620mg/L，烟酸 4.5-5.5mg/L，叶酸 0.04-0.06mg/L，生物素 0.04-0.06mg/L，肌醇 90-110mg/L，山梨醇 12～14g/L，甘氨酸 3.5-4.5mg/L，脯氨酸 45-55mg/L，丝氨酸 25-35mg/L，阿拉伯半乳聚糖 12-16mg/L，甲基亚硝基脲 1.2-1.8g/L，蔗糖 120-140g/L，植物凝胶 3.0-3.5g/L，6-BA 0.18-0.22mg/L，胰岛素 8-12mg/L，水解蛋白 0.5-0.7g/L，活性炭 0.03-0.05g/L，pH 6.2-6.4。
结球甘蓝种子在前一年秋季播于大田，自然越冬后于第2年春季3-4月结球甘蓝始花期取材，选择花蕾长度3.0-4.0mm、单核晚期花粉粒占多数的主花序中的花蕾带回实验室，置于33℃人工气候箱内热激预处理2d，预处理结束后开始接种。接种时，将花蕾转移入超净工作台无菌烧杯中，倒入70%酒精进行表面消毒，浸泡1min后倒掉酒精，再加入0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10min，然后用无菌水冲洗三次以充分除去氯化汞残毒。沥干水分后，在B5液体洗涤培养基中用平头玻棒碾压花蕾，挤出小孢子。悬浮液经50μm无菌微孔纱布过滤，收集滤液于10ml离心管，1000rpm下离心5min，沉淀物加5mL B5洗涤培养基，摇匀，1000rpm下再离心5min，所得沉淀物即为结球甘蓝花粉。将结球甘蓝花粉转移入本发明的结球甘蓝花粉诱导培养基中，25℃暗培养直至胚性愈伤组织形成。
实施例
配制本发明所述的一种结球甘蓝花粉诱导培养基，培养基配方具体如下：
KNO3 60mg/L，MgSO4∙7H2O 62.5mg/L，KH2PO4 67.5mg/L，Ca(NO3)2∙4H2O 225mg/L，Na2-EDTA 12.5mg/L，FeSO4∙7H2O 13.5mg/L，MnSO4∙4H2O 25mg/L，AgNO3 10mg/L，H3BO3 8.25mg/L，ZnSO4∙7H2O 9mg/L，KI 0.825mg/L，Na2MoO4∙2H2O 0.25mg/L，CuSO4∙5H2O 0.025mg/L，CoCl2∙6H2O 0.025mg/L，L-谷氨酰胺 800mg/L，N-乙酰基-5-甲氧基色胺 200mg/L，维生素B1 0.5mg/L，维生素B6 0.5mg/L，2-吗啉乙磺酸 590mg/L，烟酸 5mg/L，叶酸 0.05mg/L，生物素 0.05mg/L，肌醇 100mg/L，山梨醇 13g/L，甘氨酸 4mg/L，脯氨酸 50mg/L，丝氨酸 30mg/L，阿拉伯半乳聚糖 14mg/L，甲基亚硝基脲 1.5g/L，蔗糖 130g/L，植物凝胶 3.25g/L，6-BA 0.2mg/L，胰岛素 10mg/L，水解蛋白 0.6g/L，活性炭 0.04g/L，pH 6.3。
试验品种选择中甘15号和京丰1号，将中甘15号和京丰1号的种子在2014年9月下旬播种，自然越冬后于2015年3月上旬结球甘蓝始花期时，选择花蕾长度为2.8-3.8mm、单核晚期花粉粒占多数的主花序花蕾带回实验室，置于33℃人工气候箱内热激预处理2d，预处理结束后开始接种。接种时，将花蕾转移入超净工作台无菌烧杯中，倒入70%酒精进行表面消毒，浸泡1min后倒掉酒精，再加入0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10min，然后用无菌水冲洗三次以充分除去氯化汞残毒。沥干水分后，在B5液体洗涤培养基中用平头玻棒碾压花蕾，挤出花粉。悬浮液经50μm无菌微孔纱布过滤，收集滤液于10ml离心管，1000rpm离心5min，沉淀物加5mL B5洗涤培养基，摇匀，1000rpm再离心5min得到结球甘蓝花粉。将结球甘蓝花粉转移入本发明的结球甘蓝花粉诱导培养基中，25℃条件下暗培养直至胚性愈伤组织形成，3周后统计胚性愈伤组织的诱导频率。花粉愈伤组织诱导率=花粉愈伤块数/接种花蕾总数×100%。
为了比较本发明所提供的结球甘蓝花粉诱导培养基与前人采用的培养基对结球甘蓝花粉胚性愈伤组织诱导效率的差异，我们另外选择了2种前人采用过的结球甘蓝花粉诱导培养基，试验品种亦采用中甘15号和京丰1号，花粉分离方法、组培操作方法、培养方法均相同，花粉愈伤形成后分别统计中甘15号和京丰1号的花粉在该2种培养基内的花粉愈伤诱导率。
其它2种结球甘蓝花粉诱导培养基配方为：
NLN-13培养基+0.3g/L活性炭，pH为5.8（对比文件来自于蒋武生等《结球甘蓝游离小孢子培养胚的形成和再生植株》）；
NLN-13培养基+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.05mg/L+AgNO35mg/L+2，4-D 0.2mg/L+AC 0.1mg/L，pH为5.8（对比文件来自于方淑桂等《结球甘蓝游离小孢子培养及植株再生》）。
培养基对比实验
将采用本发明所提供的结球甘蓝花粉诱导培养基诱导中甘15号和京丰1号花粉统计所得的花粉愈伤组织诱导率与对比实施例中的另外两种前人所用的培养基中中甘15号和京丰1号花粉愈伤诱导率进行比较，比较的结果如下表1所示。
由表1可以发现，本发明所提供的结球甘蓝花粉诱导培养基对结球甘蓝品种中甘15号和京丰1号的花粉愈伤组织诱导率平均值达到了27.4个/蕾，而前人所采用的另外两种培养基对结球甘蓝品种中甘15号和京丰1号的花粉愈伤组织诱导率平均值分别仅为3.9个/蕾和10.7个/蕾，可以发现本发明所提供的结球甘蓝花粉诱导培养基对结球甘蓝花粉的诱导能力做出了显著的提升。
本发明所提供的甘蓝花粉诱导培养基，是在现有研究发现基础之上进一步创造性改良的成果，是经过大量单因子、多因子试验所筛选的最优组合，我们进行了大量的实验研究亦得出本发明的组分配比是最优的。采用本发明所提供的培养基可以大大提高结球甘蓝花粉胚性愈伤的诱导效率，因此具有重要的应用价值。
以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。