重组菌株及其制备方法和生产L‑缬氨酸的方法与流程

本发明涉及微生物
技术领域：
，特别涉及重组菌株及其制备方法和生产L-缬氨酸的方法。
背景技术：
：L-缬氨酸(L-valine)，化学名称为L-α-氨基异戊酸，分子式为C5H11NO2，相对分子质量为117.15。呈白色结晶或结晶性粉末，无臭，味苦，在水中溶解度：25℃为88.5g/L，50℃为96.2g/L，不溶于冷乙醇，乙醚，丙酮。等电点为5.96，熔点315℃。L-缬氨酸是人体八种必需氨基酸之一，又是三种支链氨基酸(包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)之一，因其特殊的结构和功能，在人类生命代谢中具有特别重要的地位。可以广泛应用于医药工业、食品工业和饲料工业等。医药工业中，可作氨基酸输液、综合氨基酸制剂的主要成分，可治疗肝功能衰竭、中枢神经系统功能紊乱，如缺乏可引起神经障碍、停止发育、体重下降、贫血等。食品工业中，可用作食品添加剂、营养增补液及风味剂等；米制糕饼中添加缬氨酸(1g/kg)，产品有芝麻香，用于面包亦能改善风味；L-缬氨酸也可用作氨基酸功能性饮料与运动员饮料，有形成肌肉、强化肝功能、减轻肌肉疲劳等作用。饲料工业中，对动物的乳腺组织分泌乳汁有重要的促进作用，将其用于雏鸡饲料中，可提高雏鸡对鸡新城疫病毒的免疫能力；而且L-缬氨酸是动物饲料中的一种限制性氨基酸，所以L-缬氨酸可作为饲料添加剂改善动物日粮中氨基酸含量的不足。L-缬氨酸的生产方法有三种：提取法、化学合成法、微生物发酵法。提取法和化学合成法由于原料来源受限制、生产成本高、污染环境，难以实现工业化生产。微生物发酵法生产L-缬氨酸具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点，是目前生产L-缬氨酸最主要的方法。通过菌株的选育，以解除代谢调节中的反馈抑制和阻遏，达到过量积累L-缬氨酸的目的，是微生物发酵法工业应用最为广泛的手段。棒杆菌是用于生产L-氨基酸的代表性微生物，特别是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、北京棒杆菌(Corynebacteriumpekinense)和黄色短杆菌(Breviabacteriumflavum)。为了改善这些微生物的L-缬氨酸生产能力，可以通过传统诱变和代谢工程等方法对生产菌株进行不断地改造。但传统诱变育种由于随机突变造成菌株生长缓慢及产生较多副产物，不易获得高产菌株。2010年徐大庆报道了一株黄色短杆菌基因工程菌株，其L-缬氨酸的产量为5.0g/L，副产物丙氨酸为3.55g/L。对于L-缬氨酸产量高、副产物少的基因工程菌株仍有需求。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了重组菌株及其制备方法和生产L-缬氨酸的方法。本发明提供的重组菌株经发酵培养，L-缬氨酸的产量可达12.2g/L，丙氨酸的浓度低至0.6g/L。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种重组菌株，以棒状杆菌为出发菌株进行改造，其改造包括：将ilvN基因进行点突变和敲除avtA基因。在本发明中，点突变具体为：将乙酰羟酸合成酶的第20位的甘氨酸被天冬氨酸替代，第21位的异亮氨酸被天冬氨酸替代，以及第22位的异亮氨酸被苯丙氨酸替代。在本发明中，出发菌株为棒状杆菌ATCC14067。在本发明提供的具体实施例中，重组菌株的保藏编号为CGMCCNo.13406。本发明还提供了一种重组菌株的构建方法，包括：以棒状杆菌为出发菌株进行改造，其改造包括：将ilvN基因进行点突变和敲除avtA基因。在本发明中，改造采用sacB方法对棒状杆菌基因组进行遗传改造。本发明还提供了一种生产L-缬氨酸的方法，采用本发明提供的重组菌株或本发明构建方法构建得到的重组菌株为发酵菌株。作为优选，生产L-缬氨酸的方法为：将重组菌株接种到种子活化培养基进行活化，然后接种到种子培养基进行种子培养，最后接种到发酵培养基进行发酵培养。作为优选，以质量百分含量计，种子活化培养基包括：酵母提取物1％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，葡萄糖0.5％，琼脂2％，pH7.2。作为优选，种子培养基包括：玉米浆2.5％，葡萄糖1.0％，硫酸铵0.4％，硫酸镁0.04％，磷酸二氢钾0.1％，尿素0.1％，CaCO30.5％，pH7.2。作为优选，发酵培养基包括：玉米浆0.5％，葡萄糖12.0％，硫酸铵4.0％，硫酸镁0.04％，磷酸二氢钾0.1％，CaCO34％，VH50μg/L，VB1·HCl100μg/L，pH7.2。作为优选，种子培养的温度为33℃，转速为220r/min，时间为16～22h。作为优选，发酵培养的温度为33℃，转速为220r/min，时间为72h。本发明提供了重组菌株及其制备方法和生产L-缬氨酸的方法。该重组菌株以棒状杆菌为出发菌株进行改造，其改造包括：将ilvN基因进行点突变和敲除avtA基因。本发明至少具有如下有益效果之一：1、本发明对缬氨酸代谢路径中的ilvN进行点突变，将编码转氨酶的avtA基因敲除，得到重组菌株，经发酵培养，L-缬氨酸的产量可达12.2g/L。2、本发明构建得到的重组菌株在发酵培养过程中大大减少了副产物丙氨酸的生成。生物保藏说明分类命名：谷氨酸棒杆菌，Corynebacteriumglutamicum，于2016年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.13406。附图说明图1示重组质粒pK18mobsacB-ilvNM13；图2示重组质粒pK18mobsacB-ΔavtA。具体实施方式本发明公开了重组菌株及其制备方法和生产L-缬氨酸的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。乙酰羟酸合酶(AHAS)是L-缬氨酸合成路径中的第一个酶，也是关键酶，催化2分子丙酮酸脱羧合成1分子乙酰乳酸。乙酰羟酸合酶由大小两个亚基组成，大亚基由ilvB基因编码，具有催化活性；小亚基由ilvN基因编码，起到反馈抑制的调控作用。该酶受到缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸的反馈抑制，其中缬氨酸的半抑制浓度为0.9mmol/L，由此可见，胞内高浓度的缬氨酸会降低该酶的活性，从而不利于菌体积累缬氨酸。缬氨酸合成路径的前体物为丙酮酸，丙酮酸在生物体内的转化速度非常快，可以经过丙酮酸脱氢酶复合物的催化生成乙酰辅酶A进入三羧酸循环，也可以通过转氨酶的催化以谷氨酸或者缬氨酸为氨基供体生成丙氨酸。在谷氨酸棒杆菌中，编码该转氨酶的基因有2个，分别为avtA和alaT。三羧酸循环为生物体的生长提供充足的前体物质，丙酮酸到丙氨酸的代谢通路由两个酶催化，因此弱化丙酮酸到丙氨酸的代谢通路，为缬氨酸的合成提供充足的前体物，有利于提高缬氨酸的产量。根据棒状杆菌中L-缬氨酸的代谢路径，本发明以野生型ATCC14067为出发菌株，在其基因组上进行相关改造，对缬氨酸代谢路径中的ilvN进行点突变，使得乙酰羟酸合成酶的第20位的甘氨酸被天冬氨酸替代，第21位的异亮氨酸被天冬氨酸替代以及第22位的异亮氨酸被苯丙氨酸替代，解除L-缬氨酸对乙酰羟酸合酶的反馈抑制。在此基础上将编码转氨酶的avtA基因敲除，弱化其竞争途径，使得更多的丙氨酸流向缬氨酸的合成通路，降低副产物丙氨酸的积累。棒状杆菌ATCC14067工程菌株的从头构建工作，利用了sacB方法对棒状杆菌基因组进行遗传改造。以下实施例中使用引物序列见下表：表1引物序列引物名称SEQIDNO.序列ilvNM13-f11cggggatcctctagaaacaacggaaacctilvNM13-r12cgtcgggtgaacatacctgatacgcgggaaaagtcatcgtctacgtcctgaacgagtacilvNM13-f23gatgacttttcccgcgtatcaggtatgtilvNM13-r24gccaagctttgcaattagacggtgtttgaavtA-f15cggggatccttgtctcttatgaagccaagavtA-r16cgtcatggagaagtacttggacaaggtaccccggggtaggcattgccacaavtA-f27ggtaccttgtccaagtacttavtA-r28gccaagctttctccgattttgcgcacacc本发明中涉及的基因名称解释如下：ilvBN：乙酰羟酸合酶；avtA：转氨酶；VH：生物素；VB1·HCl：盐酸硫胺素，化学式为C12H17ClN4OS·HCl。以下实施例中，所用试剂均可由市场购得。本发明提供的L-缬氨酸生产菌种的亲代菌株为ATCC14067，菌种的拉丁学名是CorynebacteriumglutamicumATCC14067。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1：重组质粒pK18mobsacB-ilvNM13的构建及在ATCC14067中引入点突变(1)pK18mobsacB-ilvNM13质粒的构建以ATCC14067基因组为模板，以ilvNM13-f1/ilvNM13-r1引物对进行PCR扩增得到上游片段ilvNM13-up。以ATCC14067基因组为模板，以ilvNM13-f2/ilvNM13-r2引物对进行PCR扩增得到下游片段ilvNM13-dn。以ilvNM13-up、ilvNM13-dn两片段混合物为模板，以ilvNM13-f1/ilvNM13-r2引物对进行PCR扩增，得到突变的ilvNM13片段。ilvNM13片段用BamHI、HindIII进行双酶切，pK18mobsacB用同样的酶双酶切。两酶切产物以T4DNALigase进行连接，转化Trans1T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-ilvNM13(图1)。(2)ATCC14067中引入点突变按照谷棒经典方法(C.glutamicumHandbook,Charpter23)制备ATCC14067感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-ilvNM13以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株，命名为MHZ-1012-1。实施例2：重组质粒pK18mobsacB-ΔavtA的构建及在MHZ-1012-1中敲除avtA(1)pK18mobsacB-ΔavtA质粒的构建以ATCC14067基因组为模板，以avtA-f1/avtA-r1引物对进行PCR扩增得到上游片段avtA-up。以ATCC14067基因组为模板，以avtA-f2/avtA-r2引物对进行PCR扩增得到下游片段avtA-dn。以avtA-up、avtA-dn两片段混合物为模板，以avtA-f1/avtA-r2引物对进行PCR扩增，得到avtA敲除片段。avtA敲除片段用BamHI、HindIII进行双酶切，pK18mobsacB用同样的酶双酶切。两酶切产物以T4DNALigase进行连接，转化Trans1T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-ΔavtA(图2)。(2)MHZ-1012-1中敲除avtA按照谷棒经典方法(C.glutamicumHandbook,Charpter23)制备MHZ-1012-1感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-ΔavtA以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株，命名为MHZ-1012-2(保藏编号为CGMCCNo.13406)。实施例3：L-缬氨酸基因工程菌发酵生产L-缬氨酸1.培养基种子活化培养基：酵母提取物1％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，葡萄糖0.5％，琼脂2％，pH7.2。种子培养基：玉米浆2.5％，葡萄糖1.0％，硫酸铵0.4％，硫酸镁0.04％，磷酸二氢钾0.1％，尿素0.1％，CaCO30.5％，pH7.2。发酵培养基：玉米浆0.5％，葡萄糖12.0％，硫酸铵4.0％，硫酸镁0.04％，磷酸二氢钾0.1％，CaCO34％，VH50μg/L，VB1·HCl100μg/L,pH7.2。2.MHZ1012-1摇瓶发酵生产L-缬氨酸(1)种子培养：挑取ATCC14067、MHZ1012-1、斜面种子1环接至装有20mL种子培养基的500mL三角瓶中，33℃、220r/min振荡培养16-22h；(2)发酵培养：将2mL种子液接种至装有20mL发酵培养基的500mL三角瓶中，33℃、220r/min振荡培养72h。(3)取1mL发酵液离心(12000rpm，2min)，收集上清液，用HPLC检测工程菌与对照菌发酵液中的L-缬氨酸及丙氨酸含量，其浓度如下表所示。表2L-缬氨酸的产量及丙氨酸浓度菌株名称L-缬氨酸浓度g/LL-丙氨酸浓度g/LATCC14067(出发菌)0.5-MHZ-1012-1(工程菌)6.32.4如上表中所示，出发菌株ATCC14067L-缬氨酸的积累量仅为0.5g/L，而本发明的工程菌MHZ-1012-1的L-缬氨酸产量为6.3g/L，比出发菌株产量提高12.6倍，实现了缬氨酸产量从无到有的突破。由此可见ilvN编码的蛋白质的20位甘氨酸被天冬氨酸替代，21位的异亮氨酸被天冬氨酸替代以及22位的异亮氨酸被苯丙氨酸替代即可解除缬氨酸对该蛋白的反馈抑制。MHZ-1012-1不仅积累了6.3g/L缬氨酸，副产物丙氨酸的积累量达到了2.4g/L，副产物丙氨酸的积累说明乙酰羟酸合酶在解除缬氨酸反馈抑制的同时，其酶活有所下降，使得缬氨酸合成路径的前体物丙酮酸积累，丙酮酸通过avtA、alaT编码的转氨酶的催化下生成丙氨酸，造成发酵液中有2.4g/L的丙氨酸的积累。在基因组上对ilvN进行改造，解除缬氨酸对乙酰强酸合酶的反馈抑制与将该基因整合在质粒上相比，避免了质粒稳定性对缬氨酸产量的影响，同时也不需要诱导，降低了生产的成本，简化了工业发酵的工艺流程，菌株缬氨酸的生产能力更加稳定。3.MHZ1012-2摇瓶发酵生产L-缬氨酸(1)种子培养：挑取ATCC14067、MHZ1012-1、MHZ1012-2、斜面种子1环接至装有20mL种子培养基的500mL三角瓶中，33℃、220r/min振荡培养16-22h；(2)发酵培养：将2mL种子液接种至装有20mL发酵培养基的500mL三角瓶中，33℃、220r/min振荡培养72h。(3)取1mL发酵液离心(12000rpm，2min)，收集上清液，用HPLC检测工程菌与对照菌发酵液中的L-缬氨酸及丙氨酸含量，其浓度如下表所示。表3L-缬氨酸的产量及丙氨酸浓度菌株名称L-缬氨酸浓度g/LL-丙氨酸浓度g/LATCC14067(出发菌)0.5-MHZ-1012-1(工程菌)6.32.4MHZ-1012-2(工程菌)12.20.6如上表中所示本发明的工程菌MHZ-1012-2的L-缬氨酸产量为12.2g/L，比出发菌株产量提高24.4倍；与MHZ-1012-1相比，其缬氨酸的产量是MHZ-1012-1的1.9倍，副产物丙氨酸的浓度由2.4g/L下降到0.6g/L。由此可见avtA的敲除弱化了丙酮酸到丙氨酸的代谢通路，降低了该代谢通路对缬氨酸合成代谢通路的竞争，使得更多地丙酮酸流向缬氨酸合成代谢通路。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。SEQUENCELISTING<110>廊坊梅花生物技术开发有限公司<120>重组菌株及其制备方法和生产L-缬氨酸的方法<130>MP1623789<160>8<170>PatentInversion3.3<210>1<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>1cggggatcctctagaaacaacggaaacct29<210>2<211>59<212>DNA<213>人工序列<400>2cgtcgggtgaacatacctgatacgcgggaaaagtcatcgtctacgtcctgaacgagtac59<210>3<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>3gatgacttttcccgcgtatcaggtatgt28<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>4gccaagctttgcaattagacggtgtttga29<210>5<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>5cggggatccttgtctcttatgaagccaag29<210>6<211>50<212>DNA<213>人工序列<400>6cgtcatggagaagtacttggacaaggtaccccggggtaggcattgccaca50<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>7ggtaccttgtccaagtactt20<210>8<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>8gccaagctttctccgattttgcgcacacc29当前第1页1 2 3