对链核盘菌具有抑制活性的重组山冈单胞菌及其构建方法与应用与流程

本发明涉及生物工程领域中对链核盘菌具有抑制活性的重组山冈单胞菌及其构建方法与应用。

背景技术：

由链核盘菌(Monilinia spp.)引起的褐腐病是桃生产中最重要的病害之一，也是世界范围内核果类最重要的采后病害。此病在采前、采后及贮藏运输期均可造成大量减产，采后尤为严重，在欧美损失高达59-90％。我国桃产量在1000万吨以上，为仅次于苹果的第二大水果。调查表明，北京地区此病能够造成贮藏库果实年损失近1/4，出库后烂果率高达84.6-100％。迄今为止，化学防治是控制桃褐腐病的主要手段，今年桃褐腐病生产上常用的桃褐腐化学杀虫剂产生了抗药性，使得此病的防治受到了极大的威胁；此外，由于化学药剂所造成的环境污染、食品安全和人类健康问题，绿色防控已经逐渐成为热点。微生物制剂具有靶标特异性强、对人畜安全、环境兼容等优点，是非常理想的化学药剂代替品。

草甸山岗(冈)单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004是从西藏林芝色季拉山海拔4530m高山草甸土壤中分离得到的对桃褐腐病菌具有特异的抑菌作用的天然菌株(CN 104004680B)，为了进一步提高该菌株的生防活性，开发防效更好的桃褐腐生防制剂，需要研发抗菌活性更高的新菌株。

技术实现要素：

本发明所要解决的一个技术问题是如何构建对植物褐腐病具有更高抑菌活性的菌株。

为了解决以上技术问题，本发明提供了重组山冈(岗)单胞菌。

本发明所提供的重组山冈(岗)单胞菌，通过赋予受体山冈(岗)单胞菌血红蛋白活性来制备；所述受体山冈(岗)单胞菌和所述重组山冈(岗)单胞菌对链核盘菌具有抑制活性，在抑制链核盘菌的活性上，所述重组山冈(岗)单胞菌高于所述受体山冈(岗)单胞菌。

上述重组山冈单胞菌中，所述受体山冈单胞菌可为不具有血红蛋白活性的山冈(岗)单胞菌。

上述重组山冈单胞菌中，所述赋予受体山冈单胞菌血红蛋白活性通过将血红蛋白的编码基因导入所述受体山冈单胞菌中实现。

上述重组山冈单胞菌中，所述血红蛋白可为如下A1)或A2)的蛋白质：

A1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.1的蛋白质；

A2)将序列表中SEQ ID No.1中的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有血红蛋白活性的由A1)衍生的蛋白质。

其中，SEQ ID No.1由146个氨基酸残基组成。

上述重组山冈单胞菌中，所述受体山冈单胞菌可为草甸山岗(冈)单胞菌(Collimonas pratensis),其菌株号为JZB120004，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.9193。

上述重组山冈单胞菌中，所述血红蛋白的编码基因可为下述A11)-A13)中的任一种DNA分子：

A11)编码序列为序列表中SEQ ID No.2的cDNA分子或基因组DNA；

A12)在严格条件下与A11)限定的DNA分子杂交且编码所述血红蛋白的cDNA分子或基因组DNA；

A13)与A11)或A12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述血红蛋白的cDNA分子或基因组DNA。

其中，SEQ ID No.2由441个核苷酸组成。

上述重组山冈单胞菌中，所述链核盘菌可为植物褐腐病菌。所述植物的果实为核果，如桃。植物褐腐病菌具体可为美澳型核果链核盘菌(Monilinia fructicola)。

上述重组山冈单胞菌中，所述重组山冈(岗)单胞菌可为草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)，其菌株号为ZV261，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.13015。

为解决以上技术问题，本发明提供了含有所述重组山冈(岗)单胞菌或/和所述重组山冈(岗)单胞菌的代谢物的菌剂，所述菌剂对链核盘菌具有抑制活性。。

上述菌剂的活性成分可为所述重组山冈(岗)单胞菌或/和所述重组山冈(岗)单胞菌的代谢物，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据对链核盘菌的抑制效果确定。

所述菌剂中，除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体；所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇或/和聚二醇；所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷或/和十二烷。

所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。

上文中，所述重组山冈(岗)单胞菌的代谢物可从所述重组山冈(岗)单胞菌的发酵液中获得。所述重组山冈(岗)单胞菌的代谢物具体可按照如下方法制备：在液体培养基中培养所述重组山冈(岗)单胞菌，除去液体培养物(发酵液)中的所述重组山冈(岗)单胞菌即得到所述重组山冈(岗)单胞菌的代谢物。

本发明还提供了构建上述重组山冈单胞菌的方法。

本发明所提供的构建重组山冈单胞菌的方法，包括将血红蛋白的编码基因导入受体山冈单胞菌中，得到抑制链核盘菌的活性高于所述受体山冈单胞菌的重组山冈单胞菌。

上述方法中，所述血红蛋白可为如下A1)或A2)的蛋白质：

A1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.1的蛋白质；

A2)将序列表中SEQ ID No.1中的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有血红蛋白活性的由A1)衍生的蛋白质。

上述方法中，所述受体山冈单胞菌可为草甸山岗(冈)单胞菌(Collimonas pratensis),其菌株号为JZB120004，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.9193。

上述方法中，所述血红蛋白的编码基因为下述A11)-A13)中的任一种DNA分子：

A11)编码序列为序列表中SEQ ID No.2的cDNA分子或基因组DNA；

A12)在严格条件下与A11)限定的DNA分子杂交且编码所述血红蛋白的cDNA分子或基因组DNA；

A13)与A11)或A12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述血红蛋白的cDNA分子或基因组DNA。

上述方法中，所述链核盘菌可为植物褐腐病菌。所述植物的果实为核果，如桃。植物褐腐病菌具体可为美澳型核果链核盘菌(Monilinia fructicola)。

上述方法中，所述重组山冈(岗)单胞菌可为草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)，其菌株号为ZV261，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.13015。在下文中简称草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)ZV261。

上述重组山冈(岗)单胞菌或上述菌剂的下述任一应用也属于本发明的保护范围：

A)上述重组山冈(岗)单胞菌或上述菌剂在制备植物褐腐病菌抑制剂中的应用；

B)上述重组山冈(岗)单胞菌或上述菌剂在抑制植物褐腐病菌中的应用；

C)上述重组山冈(岗)单胞菌或上述菌剂在制备植物褐腐病抑制剂中的应用；

D)上述重组山冈(岗)单胞菌或上述菌剂在抑制植物褐腐病中的应用。

上述应用中，所述植物的果实为核果，如桃。所述植物褐腐病菌具体可为美澳型核果链核盘菌(Monilinia fructicola)。

实验证明，重组山冈(岗)单胞菌(草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)ZV261)具有比野生型山冈单胞菌(草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004)更高的抗菌活性，重组山冈(岗)单胞菌对桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)的抑菌活性是野生型山冈单胞菌的2.3倍。本发明的重组山冈单胞菌抑菌能力显著提高，可以应用于桃褐腐病生防制剂开发中。

生物材料保藏说明

分类命名：草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)

菌株编号：ZV261

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101

保藏日期：2016年9月19日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.13015

附图说明

图1为血红蛋白基因表达载体pRK415-vhb的HindIII和BamHI酶切结果。

其中，泳道M为DNA分子量标准，1为pRK415-vhb。

图2为CO差光谱法分析山冈单胞菌(Collimonas pratensis)ZV261，山冈单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004CGMCC No.9193血红蛋白活性。

其中，位于下方的曲线是草甸山岗(冈)单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004CGMCC No.9193，位于上方的曲线是草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)ZV261。

图3为草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)ZV261和草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的抑菌活性比较。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的广宿主表达载体pRK415(NTS Keen，SD Tamaki，D Kobayashi，D Trollinger.Improved broad-host-range vectors for DNA cloning in Gram-negative bacteria.《Gene》,1988,70(1):191-7.)公众可从北京市农林科学院获得，以重复本申请实验。

下述实施例中的大肠杆菌S17-1(E.coli S17-1)(Simon R,Priefer U,Puhler A(1983)A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering:transposon mutagenesis in gram negative bacteria.Bio-Technology 1:784–791.)公众可从北京市农林科学院获得，以重复本申请实验。

下述实施例中的病原菌桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)(刘霆，陶万强，王合，花玉鹏，刘伟成。拮抗菌A02代谢产物对几种果树病害的活性.北方园艺,2011,17：13-16)公众可从北京市农林科学院获得，以重复本申请实验。

下述实施例中的草甸山岗(冈)单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004已于2014年5月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其登记入册编号为CGMCC No.9193，为CN 104004680B中已授权的生物材料。

下述实施例中的pRK404-vhb(文莹，李季伦.透明颤菌血红蛋白基因在阿维链霉菌中的表达.微生物学报.40卷1期.2000年2月)公众可从北京市农林科学院获得，以重复本申请实验。

实施例1、构建抗链核盘菌的重组山冈单胞菌

1、血红蛋白基因表达载体pRK415-vhb的构建

本实施例构建的血红蛋白基因表达载体名称为pRK415-vhb，该载体中含有血红蛋白基因及自身启动子约1.4kb的序列。

pRK415-vhb的具体构建方法如下：

用HindIII和BamHI酶切pRK404-vhb,得到含vhb基因及其自身启动子的1.4kb片段，将它连接到经同样酶切的pRK415上，得到含有血红蛋白基因(SEQ ID No.2)及自身启动子的重组载体，将该重组载体命名为pRK415-vhb。pRK415-vhb表达SEQ IDNo.1所示的血红蛋白(名称为vhb)。

pRK415-vhb转化大肠杆菌S17-1，以四环素抗性筛选从而获得携带血红蛋白基因的转化子，该转化子以p1(5'-ATGTTAGACCAGCAAACCA-3)和p2(5'-TTATTCAACCGCTTGAGCGT-3')为引物进行PCR扩增得到441bp的血红蛋白ORF片段，用HindIII和BamHI酶切pRK415-vhb得到10.5kb的pRK415质粒片段及1.4kb的血红蛋白基因及自身启动子片段(图1)，从而确定血红蛋白基因片段正确连接到pRK415载体中。

2、利用pRK415-vhb将血红蛋白基因导入草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004得到具有血红蛋白活性的重组山冈单胞菌

将pRK415-vhb载体转化E.coli S17-1，通过两亲接合的方法，转化山冈单胞菌JZB120004，通过四环素抗性筛选得到阳性转化子，PCR验证得到正确的转化子。具体转化方法如下：

1)将pRK415-vhb载体转化去甲基化E.coli S17-1

通过热激法将pRK415-vhb载体导入E.coliS17-1并经过12.5μg/ml四环素抗性筛选得到转入pRK415-vhb载体的重组菌E.coliS17-1/pRK415-vhb。

2)两亲接合构建抗桃褐腐病的重组山冈单胞菌

参考文献(Bierman M et al.1992)进行两亲接合，具体方法如下：

(1)将重组菌E.coliS17-1/pRK415-vhb接种到含有四环素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm，培养过夜，次日早晨按1％的接种量接到新鲜LB培养基中培养至OD₆₀₀＝0.4-0.6，收集菌液，4℃，4000rpm，离心2min，弃上清，用20mL冰冷的纯的LB培养液重悬沉淀，4℃，4000rpm，离心2min，弃上清，目的是洗去抗生素。用2mL冰冷的纯的LB培养液重悬沉淀。(2)将PDA斜面生长3天的草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004接种到改良King’B(改良KB培养基)(Atlas R.M.1995.Handbook of media for environmental microbiology.Boca Raton FL:CRC)培养基上，25℃，200rpm，培养过夜，次日早晨按1％的接种量接到新鲜改良KB培养基中培养至OD₆₀₀＝0.8-1.0，收集菌液，4℃，4000rpm，离心2min，弃上清，用20mL无菌水反复清洗菌体，目的是洗去细菌表面粘液。(3)将步骤(1)和(2)的菌体混合均匀，点到固体改良KB培养基上4-6小时，稀释涂布在含有四环素抗性的固体改良KB培养基上。1天后挑取单菌落到新的加入上述抗生素溶液的改良KB平板上。挑取在该改良KB平板上的菌落用上述p1和p2进行PCR，将其中一株可以得到0.44kb的扩增产物的重组菌命名为草甸山冈(岗)单胞菌(Collimonas pratensis)ZV261。草甸山冈(岗)单胞菌(Collimonas pratensis)ZV261已于2016年9月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.13015，下文简称草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)ZV261。

3)草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)ZV261的血红蛋白活性

将野生型菌株-草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004和重组菌株-草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)ZV261分别接种到改良KB固体培养基2天后转接于改良KB液体培养基中培养3天，进行CO差光谱法分析血红蛋白活性。

具体方法如下：

培养3天的细胞培养液,以4 000-6 000r/min离心10min,收集细胞。将离心后的细胞重悬于磷酸盐缓冲液(100mmol/L,pH 7.5)中,超声波破碎3min后，分别加入Na₂S₂O₄或NADH进行还原处理,然后将CO鼓泡入试样端一定时间,在分光光度计上扫描400～470nm的差光谱。实验结果表明在菌株ZV261中表达出的VHb蛋白在420nm处有明显吸收峰,草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)ZV261具有血红蛋白活性，而野生型菌株-草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的蛋白粗提物中没有出现特征性吸收峰，野生型菌株-草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004不具有血红蛋白活性(图2)。

本实施例构建的草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)ZV261具有血红蛋白活性，为抗链核盘菌的重组山冈单胞菌。

实施例2、草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)ZV261(重组山冈单胞菌)的抑菌活性高于草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004(野生型山冈单胞菌)

1、植物褐腐病抑制剂的制备

1.1草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)ZV261发酵液的制备

取一环草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)ZV261，接种到装有5mL改良KB液体培养基的试管中，在26℃培养至OD_600nm为0.6(以未接菌的改良KB液体培养基为空白对照)，作为种子液，按照2％(体积比)接种量接入装有200mL改良KB液体培养基的500mL三角瓶中，在改良KB液体培养基中在26℃培养3天，得到草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)ZV261发酵液。

1.2草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004发酵液的制备

与1.1的区别仅在于将草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)ZV261替换为草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004，具体方法如下：

取一环草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004，接种到装有5mL改良KB液体培养基的试管中，在26℃培养至OD_600nm为0.6(以未接菌的改良KB液体培养基为空白对照)，作为种子液，按照2％(体积比)接种量接入装有200mL改良KB液体培养基的500mL三角瓶中，在改良KB液体培养基中在26℃培养3天，得到草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004发酵液。

1.3植物褐腐病抑制剂的制备

将1.1的草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)ZV261发酵液和1.2的草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004发酵液均分别5000rpm/min离心10－15min，上清液用0.45μm的无菌微孔滤膜过滤，收集滤液(该滤液中无菌体)，分别得到草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)ZV261无菌滤液和草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004无菌滤液，这两种无菌滤液即为植物褐腐病抑制剂。

2、抑菌活性试验

供试靶标病原菌为桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)。

刮取PDA平板上培养产生的桃褐腐病菌(M.fructicola)的分生孢子，用无菌水制成菌悬液，均匀地涂于新制备的PDA平板上，置超净工作台内吹干；用直径7mm的无菌打孔器在平板四周对称位置打孔，然后每孔中注入1.3的草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)ZV261无菌滤液100μl或1.3的草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004无菌滤液100μl,28℃下培养3天，十字交叉法测量抑菌圈直径。每处理十个重复。

实验结果表明草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)ZV261无菌滤液和草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004无菌滤液在PDA平板上对桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)均产生明显的抑菌圈，草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)ZV261无菌滤液对桃褐腐病菌(M.fructicola)抑菌圈直径为1.8cm±0.08cm，草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004无菌滤液对桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)抑菌圈直径为0.8cm±0.06cm(图3)。说明草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)ZV261无菌滤液对桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)的抑菌圈直径是草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004无菌滤液对桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)的抑菌圈直径的2.3倍；重组山冈(岗)单胞菌(草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)ZV261)具有比野生型山冈单胞菌(草甸山冈单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004更高的抗菌活性，重组山冈(岗)单胞菌对桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)的抑菌活性是野生型山冈单胞菌的2.3倍。

<110> 北京市农林科学院

<120> 对链核盘菌具有抑制活性的重组山冈单胞菌及其构建方法与应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 146

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

Met Leu Asp Gln Gln Thr Ile Asn Ile Ile Lys Ala Thr Val Pro Val

1 5 10 15

Leu Lys Glu His Gly Val Thr Ile Thr Thr Thr Phe Tyr Lys Asn Leu

20 25 30

Phe Ala Lys His Pro Glu Val Arg Pro Leu Phe Asp Met Gly Arg Gln

35 40 45

Glu Ser Leu Glu Gln Pro Lys Ala Leu Ala Met Thr Val Leu Ala Ala

50 55 60

Ala Gln Asn Ile Glu Asn Leu Pro Ala Ile Leu Pro Ala Val Lys Lys

65 70 75 80

Ile Ala Val Lys His Cys Gln Ala Gly Val Ala Ala Ala His Tyr Pro

85 90 95

Ile Val Gly Gln Glu Leu Leu Gly Ala Ile Lys Glu Val Leu Gly Asp

100 105 110

Ala Ala Thr Asp Asp Ile Leu Asp Ala Trp Gly Lys Ala Tyr Gly Val

115 120 125

Ile Ala Asp Val Phe Ile Gln Val Glu Ala Asp Leu Tyr Ala Gln Ala

130 135 140

Val Glu

145

<210> 2

<211> 441

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

atgttagacc agcaaaccat taacatcatc aaagccactg ttcctgtatt gaaggagcat 60

ggcgttacca ttaccacgac tttttataaa aacttgtttg ccaaacaccc tgaagtacgt 120

cctttgtttg atatgggtcg ccaagaatct ttggagcagc ctaaggcttt ggcgatgacg 180

gtattggcgg cagcgcaaaa cattgaaaat ttgccagcta ttttgcctgc ggtcaaaaaa 240

attgcagtca aacattgtca agcaggcgtg gcagcagcgc attatccgat tgtcggtcaa 300

gaattgttgg gtgcgattaa agaagtattg ggcgatgccg caaccgatga cattttggac 360

gcgtggggca aggcttatgg cgtgattgca gatgtgttta ttcaagtgga agcagatttg 420

tacgctcaag cggttgaata a 441