棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢发酵培养基及其培养方法和优化方法与流程

本发明涉及一种培养基，特别是涉及一种棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢发酵培养基及其培养方法和优化方法。

背景技术：

我国棉花黄萎病主要是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的一种世界范围的毁灭性种传和土传性病害，俗称“棉花癌症”。大丽轮枝菌寄主广泛，达到600多种，主要是锦葵科、豆科、十字花科和茄科等双子叶植物，且易受环境和寄主变化的影响而产生新的生理型，并且形成的微菌核在土壤中存活时间长达十几年，给防治造成一定的困难。目前国内外对棉花黄萎病的防治主要是采用轮作倒茬、选育抗病品种、化学防治和生物防治等手段，其中生物防治具有环境友好、绿色环保、不易产生抗性、发展潜力大等优势备受大家关注和青睐。芽孢杆菌不仅能产生抗菌物质，并且可形成抗逆性的芽孢，便于运输和储藏，是一种理想的生防微生物。目前应用的农业生防制剂多采用芽孢杆菌作为菌种资源。其中，枯草芽孢杆菌在生物防治中应用最为广泛，其对棉花黄萎病病菌的生长以及孢子萌发具有较强的抑制作用，盆栽施用其发酵产物对棉花黄萎病发生的防效显著，具备生防菌剂产业化开发的潜力。然而在生防菌剂的生产和应用中，该菌株的芽孢含量是影响其发挥生防防效的关键因素，微生物的发酵过程十分复杂，培养基配方的组成以及培养条件的变化对菌体的生长和芽孢的产生影响较大。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于，提供一种棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢发酵培养基及其培养方法和优化方法，所要解决的技术问题是使其提高棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢的数量，从而更加适于实用。

本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的一种棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢发酵培养基，培养基组分及质量配比为：氮源:1％-2％，碳源：1％-2％，NaH₂PO₄·2H₂O：0.2％，Na₂HPO₄·2H₂O：0.4％，其他无机盐：0.02％-0.1％，其中其他无机盐为CaCO₃、K₂HPO₄和MnSO₄·H₂O中的至少一种，其余为蒸馏水，pH为6.0-8.0。

本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。

优选的，前述的棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢发酵培养基，其中所述的氮源为牛肉膏、大豆蛋白胨和豆饼粉中的至少一种。

优选的，前述的棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢发酵培养基，其中所述的碳源为玉米粉、麦芽糖和葡萄糖中的至少一种。

优选的，前述的棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢发酵培养基，其中所述的培养基组分及质量配比为：大豆蛋白胨：1.51％，玉米粉：1.31％，CaCO₃：0.08％，NaH₂PO₄·2H₂O：0.2％，Na₂HPO₄·2H₂O：0.4％，其余为蒸馏水，pH为7.0。

本发明的目的及解决其技术问题还采用以下的技术方案来实现。依据本发明提出的一种棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢培养方法，包括以下步骤：

1)将斜面保存的棉花黄萎病生防芽孢杆菌菌株接种于NA培养基平板上，28-35℃培养14-20h，得到活化的菌株；

2)将所述活化的菌株接种于NB培养基中，28-35℃、180-220r·min^-1振荡培养12-16h，得到种子液；

3)将所述的种子液接种于发酵培养基中培养，其中，所述的种子液和发酵培养基的体积比为3％-7％；所述的发酵培养基的组分及质量配比为：氮源:1％-2％，碳源：1％-2％，NaH₂PO₄·2H₂O：0.2％，Na₂HPO₄·2H₂O：0.4％，其他无机盐：0.02％-0.1％，其中其他无机盐为CaCO₃、K₂HPO₄和MnSO₄·H₂O中的至少一种，其余为蒸馏水；其中，发酵培养条件为：转速为180-220r·min^-1，培养温度为25-35℃，培养时间为60-96h，培养基初始pH为6.0-8.0，培养基的装液量为60-80mL/200mL。本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。

优选的，前述的棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢培养方法，所述的发酵培养基组分及质量配比为：大豆蛋白胨：1.51％，玉米粉：1.31％，CaCO₃：0.08％，NaH₂PO₄·2H₂O：0.2％，Na₂HPO₄·2H₂O：0.4％，其余为蒸馏水。

优选的，前述的棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢培养方法，其中所述的发酵培养条件为：转速为200r·min^-1，培养温度为35℃，培养时间为84h，培养基初始pH为7.0，培养基的装液量为60mL/200mL。

优选的，前述的棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢培养方法，其中所述的种子液和发酵培养基的体积比为5％。

本发明的目的及解决其技术问题还采用以下的技术方案来实现。依据本发明提出的一种棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢发酵培养基的优化方法，包括以下步骤：

通过单因素实验确定影响棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢培养基的碳源、氮源和无机盐的考察因素，采用Plackett-Burman实验设计确定影响棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢的主要因素为玉米粉、大豆蛋白胨、CaCO₃；根据Plackett-Burman实验结果，采用Box-Behnken实验设计方法获得最佳制备花黄萎病生防芽孢杆菌产生芽孢培养基为：玉米粉：13.1g，大豆蛋白胨：15.1g，CaCO₃：0.8g，NaH₂PO₄·2H₂O：2g，Na₂HPO₄·2H₂O：4g，蒸馏水定容至1000mL。

借由上述技术方案，本发明棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢发酵培养基及其培养方法和优化方法至少具有下列优点：

本发明的发酵培养基提高了棉花黄萎病生防芽孢杆菌产生芽孢的数量，可以很好的培养出该菌株的芽孢。以单因素实验、Plackett-Burman实验和Box-Behnken实验优化了培养基的配方和培养条件，降低了生产成本，为该菌株的工业化发酵生产奠定技术基础，本发明产芽孢的方法简单，适用于工业生产。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是六种碳源对棉花黄萎病生防芽孢杆菌芽孢产量的影响图。

图2是六种氮源对棉花黄萎病生防芽孢杆菌芽孢产量的影响图。

图3是六种无机盐对棉花黄萎病生防芽孢杆菌芽孢产量的影响图。

图4是玉米粉和大豆蛋白胨含量对芽孢产量交互影响的三维曲面图(A)和相应等高线图(B)。

图5是玉米粉和CaCO₃含量对芽孢产量交互影响的三维曲面图(A)和相应等高线图(B)。

图6大豆蛋白胨和CaCO₃含量对芽孢产量交互影响的三维曲面图(A)和相应等高线图(B)。

图7培养时间对本发明的菌株芽孢产量的影响。

图8培养温度对本发明的菌株芽孢产量的影响。

图9培养基初始pH对本发明的菌株芽孢产量的影响。

图10接种量对本发明的菌株芽孢产量的影响。

图11装液量对本发明的菌株芽孢产量的影响。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明提出的棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢发酵培养基及其培养方法和优化方法其具体实施方式、特征及其功效，详细说明如后。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征或特点可由任何合适形式组合。

本发明的一个实施例提出的一种棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢发酵培养基，该发酵培养基组分及质量配比为：氮源:1％-2％，碳源：1％-2％，NaH₂PO₄·2H₂O：0.2％，Na₂HPO₄·2H₂O：0.4％，其他无机盐：0.02％-0.1％，其中其他无机盐为CaCO₃、K₂HPO₄和MnSO₄·H₂O中的至少一种，其余为蒸馏水，pH为6.0-8.0。

较佳的，本实施例棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢发酵培养基中的氮源为牛肉膏、大豆蛋白胨和豆饼粉中的至少一种。

较佳的，本实施例棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢发酵培养基中的碳源为玉米粉、麦芽糖和葡萄糖中的至少一种。

较佳的，本实施例棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢发酵培养基中的培养基组分及质量配比为：大豆蛋白胨：1.51％，玉米粉：1.31％，CaCO₃：0.08％，NaH₂PO₄·2H₂O：0.2％，Na₂HPO₄·2H₂O：0.4％，其余为蒸馏水，pH为7.0。

本发明的另一个实施例提出一种棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢培养方法，包括以下步骤：

1)将斜面保存的棉花黄萎病生防芽孢杆菌菌株接种于NA培养基平板上，28-35℃培养14-20h，得到活化的菌株；

2)将所述活化的菌株接种于NB培养基中，28-35℃、180-220r·min^-1振荡培养12-16h，得到种子液；

3)将所述的种子液接种于发酵培养基中培养，其中，所述的种子液和发酵培养基的体积比为3％-7％；所述的发酵培养基的组分及质量配比为：氮源:1％-2％，碳源：1％-2％，NaH₂PO₄·2H₂O：0.2％，Na₂HPO₄·2H₂O：0.4％，其他无机盐：0.02％-0.1％，其中其他无机盐为CaCO₃、K₂HPO₄和MnSO₄·H₂O中的至少一种，其余为蒸馏水；其中，发酵培养条件为：转速为180-220r·min^-1，培养温度为25-35℃，培养时间为60-96h，培养基初始pH为6.0-8.0，培养基的装液量为60-80mL/200mL。

较佳的，本发明实施例的棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢培养方法中的发酵培养基组分及质量配比为：大豆蛋白胨：1.51％，玉米粉：1.31％，CaCO₃：0.08％，NaH₂PO₄·2H₂O：0.2％，Na₂HPO₄·2H₂O：0.4％，其余为蒸馏水。

较佳的，本发明实施例的棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢培养方法中的发酵培养条件为：转速为200r·min^-1，培养温度为35℃，培养时间为84h，培养基初始pH为7.0，培养基的装液量为60mL/200mL。

较佳的，本发明实施例的棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢培养方法中的种子液和发酵培养基的体积比为5％。

本发明的另一个实施例提出一种棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢发酵培养基的优化方法，包括以下步骤：通过单因素实验确定影响棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢培养基的碳源、氮源和无机盐的考察因素，采用Plackett-Burman实验设计确定影响棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢的主要因素为玉米粉、大豆蛋白胨、CaCO₃；根据Plackett-Burman实验结果，采用Box-Behnken实验设计方法获得最佳制备花黄萎病生防芽孢杆菌产生芽孢培养基为：玉米粉：13.1g，大豆蛋白胨：15.1g，CaCO₃：0.8g，NaH₂PO₄·2H₂O：2g，Na₂HPO₄·2H₂O：4g，蒸馏水定容至1000mL。

本发明对发酵培养基的接种量和发酵培养条件如初始pH、培养温度、培养时间、转速和装液量进行单因素实验和正交实验，确定培养基的最佳接种量为培养基体积的5％，最佳培养条件为：转速为200r·min^-1，培养温度为35℃，培养时间为84h，培养基初始pH为7.0，培养基的装液量为60mL/200mL。

在前期工作的基础上，本团队分离获得1株对棉花黄萎病具有较高防治效果的枯草芽孢杆菌S12，其对棉花黄萎病病菌的生长以及孢子萌发具有较强的抑制作用，盆栽施用其发酵产物对棉花黄萎病发生的防效显著。

实施例1

本实施例棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢发酵培养基的组分及质量配比为：牛肉膏：2.0％，玉米粉：2.0％，Na₂HPO₄：0.4％，NaH₂PO₄：0.2％，MgSO₄·7H₂O：0.05％，CaCl₂：0.02％，其余为蒸馏水；该培养基的培养条件为：转速为180r·min^-1，培养温度为30℃，培养时间为60h，培养基初始pH为6.0，培养基的装液量为80mL/200mL；该培养基中棉花黄萎病生防芽孢杆菌种子液的接种量为培养基体积的3％。本实施例中棉花黄萎病生防芽孢杆菌芽孢的产量为4.8×10⁸CFU/mL。

实施例2

本实施例棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢发酵培养基的组分及质量配比为：牛肉膏：1％，麦芽糖：2％，Na₂HPO₄：0.4％，NaH₂PO₄：0.2％，MnSO₄·H₂O，0.05％，其余为蒸馏水；该培养基的培养条件为：转速为180r·min^-1，培养温度为30℃，培养时间为84h，培养基初始pH为7.0，培养基的装液量为80mL/200mL；该培养基中棉花黄萎病生防芽孢杆菌种子液的接种量为发酵培养基体积的4％。本实施例中棉花黄萎病生防芽孢杆菌芽孢的产量为5.2×10⁸CFU/mL。

实施例3

本实施例棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢发酵培养基的组分及质量配比为：大豆蛋白胨：1％，玉米粉：2％，Na₂HPO₄：0.4％，NaH₂PO₄：0.2％，CaCO₃：0.1％，其余为蒸馏水；该培养基的培养条件为：转速为180r·min^-1，培养温度为30℃，培养时间为70h，培养基初始pH为8.0，培养基的装液量为80mL/200mL；该培养基中棉花黄萎病生防芽孢杆菌种子液的接种量为发酵培养基体积的5％。本实施例中棉花黄萎病生防芽孢杆菌芽孢的产量为6.2×10⁸CFU/mL。

实施例4

1)将斜面保存的棉花黄萎病生防芽孢杆菌株接种于NA培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)平板上，30℃培养20h，得到活化的菌株；

2)将所述活化的菌株接种于NB培养基(营养肉汤培养基)中，在30℃、180r·min^-1振荡培养14h，得到种子液；

3)将所述的种子液接种于发酵培养基中培养，其中，所述的种子液和发酵培养基的发酵液的体积比为5％；所述的发酵培养基的质量组分为：玉米粉：2％，大豆蛋白胨：1％，Na₂HPO₄·2H₂O：0.4％，NaH₂PO₄·2H₂O：0.2％，K₂HPO₄：0.04％，CaCO₃：0.02％，其余为蒸馏水；所述的发酵培养基的培养条件为：转速为180r·min^-1，培养温度为30℃，培养时间为80h，培养基初始pH为6.0，培养基的装液量为60mL/200mL。

本实施例中棉花黄萎病生防芽孢杆菌芽孢的产量为5.4×10⁸CFU/mL。

实施例5

1)将斜面保存的棉花黄萎病生防芽孢杆菌株接种于NA培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)平板上，35℃培养14h，得到活化的菌株；

2)将所述活化的菌株接种于NB培养基(营养肉汤培养基)中，在35℃、220r·min^-1振荡培养12h，得到种子液；

3)将所述的种子液接种于发酵培养基中培养，其中，所述的种子液和发酵培养基的发酵液的体积比为5％；所述的发酵培养基的重量组分为：豆饼粉：2％，麦芽糖：1％，NaH₂PO₄·₂H₂O：0.2％，Na₂HPO₄·2H₂O：0.4％，CaCO₃：0.06％，其余为蒸馏水；所述的发酵培养基的培养条件为：转速为180r·min^-1，培养温度为35℃，培养时间为96h，培养基初始pH为7.0，培养基的装液量为80mL/250mL。

本实施例中棉花黄萎病生防芽孢杆菌芽孢的产量为6.0×10⁸CFU/mL。

实施例6

以质量百分比计：以2％牛肉膏、0.4％Na₂HPO₄、0.2％NaH₂PO₄、0.05％MgSO₄·7H₂O、0.02％CaCl₂为基础培养基，分别加入1.0％、2.0％的6种不同碳源，其余为蒸馏水，作为棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢培养基，进行棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢发酵试验；六种碳源分别为葡萄糖、淀粉、麦芽糖、蔗糖、甘露醇和玉米粉；芽孢产量如图1所示，图1中G为葡萄糖，D为淀粉，W为麦芽糖，S为蔗糖，M为甘露醇，Y为玉米粉，由图1可知，2％玉米粉为碳源时，芽孢产量最高，为5.8×10⁸CFU/mL；其次为麦芽糖和葡萄糖，因此选择玉米粉、麦芽糖和葡萄糖作为Plackett-Burman试验的碳源考察因子。

实施例7

以质量百分比计：以2.0％玉米粉、0.4％Na₂HPO₄、0.2％NaH₂PO₄、0.05％MgSO₄·7H₂O、0.02％CaCl₂为基础培养基，分别加入1.0％、2.0％的六种不同氮源，其余为蒸馏水，作为棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢培养基，进行棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢发酵试验；六种氮源分别为牛肉膏、大豆蛋白胨、豆饼粉、酵母粉、胰蛋白胨和硫酸铵；芽孢产量如图2所示，图2中Y为酵母粉，D为豆饼粉，B为牛肉膏，S为大豆蛋白胨，T为胰蛋白胨，A为硫酸铵，由图2可知六种氮源对棉花黄萎病生防芽孢杆菌芽孢产量的影响依次为：牛肉膏＞大豆蛋白胨＞豆饼粉＞酵母粉＞胰蛋白胨＞硫酸铵；其中1.0％牛肉膏为氮源时芽孢产量最高，为5.3×10⁸CFU/mL，因此选择牛肉膏、大豆蛋白胨和豆饼粉作为Plackett-Burman试验的氮源考察因子。

实施例8

以质量百分比计：以2.0％玉米粉、1.0％牛肉膏、0.4％Na₂HPO₄、0.2％NaH₂PO₄作为基础培养基，分别加入0.05％、0.1％的6种不同无机盐，其余为水，作为棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢培养基，进行棉花黄萎病生防芽孢杆菌产芽孢发酵试验；六种不同无机盐分别为MgSO₄·7H₂O，CaCl₂，CaCO₃，ZnCl₂，K₂HPO₄，MnSO₄·H₂O；芽孢产量如图3所示，图3中Mg为MgSO₄·7H₂O，Cl为CaCl₂，Ca为CaCO₃，Zn为ZnCl₂，K为K₂HPO₄，Mn为MnSO₄·H₂O，由图3可知0.1％CaCO₃为无机盐时芽孢产量最高，芽孢产量为6.2×10⁸CFU/mL，其次为K₂HPO₄，MnSO₄·H₂O；因此，以CaCO₃，K₂HPO₄，MnSO₄·H₂O作为Plackett-Burman试验的无机盐考察因子。

实施例9

确定玉米粉、麦芽糖、葡萄糖、豆饼粉、大豆蛋白胨、牛肉膏、CaCO₃、K₂HPO₄和MnSO₄·H₂O作为产芽孢的主要影响因素后，采用9因子2水平试验次数N＝12的Plackett-Burman试验设计，表1和表2中A、B、C、D、E、F、G、J和K分别代表玉米粉、麦芽糖、葡萄糖、豆饼粉、大豆蛋白胨、牛肉膏、K₂HPO₄、MnSO₄·H₂O、CaCO₃，用H和L代表虚拟因子以考察试验误差，每个因子取低水平(-1)和高水平(+1)，2个水平见表1，通过不同的组合，检测发酵液中芽孢产量，试验设计方案及结果见表2。通过Design Expert软件对芽孢产量测定结果进行统计分析，获得多元一次回归方程：Y₁＝165.50+51.83A-14.83B-8.17C-6.50D+80.50E-6.50F-9.83G-12.50J+23.50K，式中Y₁为芽孢产量的预测值，A、B、C、D、E、F、G、H、J、K、L分别为玉米粉、麦芽糖、葡萄糖、豆饼粉、大豆蛋白胨、牛肉膏、K₂HPO₄、MnSO₄·H₂O、CaCO₃含量的编码水平。表3为实验设计的方差分析。

表1 Plackett-Burman试验因素及水平设置

表2 Plackett-Burman试验设计及结果

表3 Plackett-Burman实验设计方差分析

由芽孢产量影响因素主效应分析结果可知，回归模型的P值为0.0078<0.05，说明该模型显著，即该模型在被研究的整个回归区域拟合很好。培养基中各因素对菌株芽孢产量的影响效应大小顺序依次为：玉米粉>大豆蛋白胨>CaCO₃>麦芽糖>MnSO4·H₂O>K₂HPO₄>葡萄糖>豆饼粉、牛肉膏。其中玉米粉(P＝0.0033)、大豆蛋白胨(P＝0.0014)、CaCO₃(P＝0.0160)是主要的影响因子。因此，本试验结果确定玉米粉、大豆蛋白胨、CaCO₃为影响菌株芽孢产量的主要因素，利用响应面分析法对培养基的这3个组分进行更深入研究。

采用Box-Behnken设计法，在培养基中玉米粉为1.5％、大豆蛋白胨为1.5％、CaCO₃为0.08％的条件下，如表4进行3因素(玉米粉、大豆蛋白胨、CaCO₃)3水平(-1、0、1)的响应面分析实验。通过Design Expert软件对优化实验数据进行二次多项式回归拟合，获得芽孢产量对玉米粉、大豆蛋白胨、CaCO₃含量的二次多项式回归方程为：Y₂＝724.00+21.50A+46.50E+33.00K+80.00AE+35.00AK-17.00EK+43.00A²-187.00E²-32.00K²(Y₂芽孢产量的预测值，A、E、K分别为玉米粉、大豆蛋白胨、CaCO₃含量)。

表4 Box-Behnken实验设计及结果

表5 Box-Behnken实验设计方差分析

该二次多项模型及其各项的方差分析结果表明，该模型回归P值<0.0001，失拟项P值为0.5542>0.05，说明回归方程的显著性和可靠性很高，因此该模型可以用于本实施例的菌株芽孢产量发酵优化的理论分析和预测。另外，二次响应面回归模型的决定系数R²值为0.9806，说明回归方程的拟合程度较好，预测值和实测值之间具有高度的相关性，可以用于该菌株芽孢产量的理论预测。

本研究根据二次多项模型并利用Design Expert软件绘制出响应面分析图如图4、图5、图6所示，每个响应面分别代表2个独立变量之间的相互作用，此时第3个变量保持在0水平。其中，图4是CaCO₃含量编码值为0时，玉米粉和大豆蛋白胨含量对芽孢产量的交互影响；图5是大豆蛋白胨含量编码值为0时玉米粉和CaCO₃含量对芽孢产量的交互影响；图3是玉米粉含量编码值为0时，大豆蛋白胨和CaCO₃含量对芽孢产量的交互影响。回归方程中各变量对响应值影响的显著性由F检验来判定，P值越小，则响应变量的显著程度越高。

从图4可以看出，在本实验条件下，大豆蛋白胨浓度的变化芽孢产量变化的影响较大，其中在中浓度时能获得较高的芽孢产量。从图5可以看出，玉米粉和CaCO₃浓度的变化对芽孢产量变化的影响较小。从图6可以看出，大豆蛋白胨浓度的变化芽孢产量变化的影响较大，其中在中浓度时能获得较高的芽孢产量。因此，可以确定该菌株产芽孢培养基中大豆蛋白胨含量处于中间水平时能获得较高的芽孢产量。

最佳芽孢产量验证：为了得到菌株芽孢产量的最佳培养基组成，将所得回归方程分别对各自变量取一阶偏导等于零。得到如下方程式：

21.5+80E+35K+86A＝0

46.5+80A-17K-374E＝0

33+35A-17E-64K＝0

求解方程组，可得模型极值坐标为:A＝-0.3941，E＝0.0267，K＝0.293，相当于玉米粉含量为1.30％，大豆蛋白粉含量为1.51％，CaCO₃含量为0.08％。按照优化后的培养基组分即玉米粉1.30％，大豆蛋白胨1.51％，CaCO₃含量为0.08％，NaH₂PO₄·2H₂O 0.2％，Na₂HPO₄·2H₂O 0.4％，优化后芽孢产量达到7.46×10⁸CFU·mL^-1，与预测芽孢产量7.29×10⁸CFU·mL^-1接近，可见该模型能较好地预测芽孢的实际产量。

实施例10

根据实施例6在获得的最优培养基的基础上，分别研究不同培养时间(24、36、48、60、72h、84h)、培养温度(20、25、30、35、40℃)、起始pH(5、6、7、8、9)、接种量(0.5％、1％、3％、5％、7％、9％)和装液量(40、60、80、100、120mL/200mL)对芽孢产量的影响，实验结果如图7-图11所示。根据图7至图11的试验结果，分别选取72h、30℃、5％接种量和80mL/200mL装液量作为正交试验各因素的中间水平。

实施例11

根据实施例7单因素的试验结果，各因素对菌株芽孢产量都有影响，其中影响较大的是培养时间(A)、接种量(B)、温度(C)和装液量(D)。为此，采用L₉(3⁴)正交表，设计4因素3水平的正交试验，以进一步确定影响本实施例菌株发酵产芽孢各因子的最佳配比，结果见表6。

表6 L₉(3⁴)正交试优化培养条件的极差评价结果

∑M为芽孢数量

采用单因素试验和正交试验设计，在最优培养基的基础上通过摇瓶培养对其发酵培养条件进行了优化。结合表6极差的结果可知：影响本实施例菌株芽孢产量的因素主次顺序为：装液量>培养温度>接种量>培养时间；优化后的菌株培养条件为装瓶量60mL/200mL、温度35℃、接种量5％、pH7.0、培养时间84h，此时发酵液中菌株芽孢含量为5.80×10⁹CFU·mL^-1。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。