本发明涉及快速繁殖领域，具体涉及一种培养树莓波拉纳的培养基及波拉纳的组培方法。
背景技术：
树莓，又名山莓、三月泡、四月泡、山抛子、刺葫芦、悬钩子、馒头菠、高脚菠、龙船泡、牛奶泡、泡儿刺，系蔷薇科悬钩子属多年生落叶小灌木，有750种以上，因其果型、色、味与草莓相似但长在树上，故名树莓，广泛分布在我国除东北、内蒙古、新疆、西藏以外的其他各省、市、自治区，在海拔300～1500m的向阳山坡、溪边、山谷、荒地和灌木丛中生长。树莓的果实性味微甘、酸、温，浙江和福建一带常用其未成熟果实替代覆盆子入药做引，具有涩精益肾助阳明目、醒酒止渴、化痰解毒之功效，主治肾虚、遗精、醉酒、丹毒等症。树莓的天然抗癌物质“鞣花酸”含量超过蓝莓，居各类可食物之首；树莓果实的含糖量为5.58-10.67％，与苹果、梨、柑桔三人水果相似；含酸量0.62-2.17％；此外还含有丰富的维生素C、B1、B2、B12和矿物质，氨基酸含量高于苹果、葡萄；树莓中植物SOD超氧化物歧化酶含量居各种水果之首，维生素E的含量也很丰富，经常食用可抗衰老，具有美容功效并能提高免疫力、防止肿瘤。
树莓品种众多，常见的树莓的品种有丰满红、哈瑞太兹、秋福、红宝玉、费尔杜德、欧洲红和波拉纳等。不同品种的树莓具有品种优势，例如丰满红具有产量高、早果性强、抗高寒、耐贫瘠的特点；秋福具有果大、高产、早熟、品种领先的特点，植株生长健壮。枝条较其他品种粗壮，直立性强；红宝玉具有颜色鲜艳、含糖量高、风味浓、香味浓、适应性强、自花授粉结实能力强、抗病虫害等特点。从快速繁殖角度来看，尽管组织培养是本领域实现快速繁殖的有效手段，但是由于树莓物种存在较大的品种间差异，致使不同品种间组织培养的培养基及组培方法不能通用。而现有技术中没有适用于树莓波拉纳品种的组培方法，因此提供一种树莓波拉纳品种的快速繁殖方法是十分重要的。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于一种培养树莓波拉纳的培养基及其培养方法，使所述培养基能够满足树莓波拉纳组织培养阶段的生长，同时能够保证培养树莓波拉纳的组培方法简易、高效、快速繁育，并且能够获得较高的成活率和生根效果。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种培养树莓波拉纳的扩繁培养基，所述扩繁培养基为含有1.0～2.0mg/L激动素、0.1～0.5mg/L萘乙酸、0.5～2.0mg/L细胞分裂素，18～25g/L蔗糖和5.0～6.0g/L琼脂的MS培养基。
优选的，所述扩繁培养基为含有1.5mg/L激动素、0.2mg/L萘乙酸、1.0mg/L细胞分裂素，20g/L蔗糖和5.6g/L琼脂的MS培养基。
本发明还提供了一种树莓波拉纳的组培方法，包括以下步骤：
1)将灭菌后的带侧芽波拉纳茎段接种至基础培养基上进行培养；
2)待波拉纳茎段的侧芽长到1.5～2.0cm时，切取侧芽接种至权利要求1或2所述的扩繁培养基上进行扩繁培养，得到扩繁苗；
3)待扩繁苗长至2.0～3.0cm时，接种到生根培养基上进行生根培养，得到组培苗。
4、根据权利要求1所述的组培方法，其特征在于，所述步骤1)中培养的条件为：温度为23～27℃，光照强度为1800～2200Lx，光照时间为11～13h/d。
优选的，所述步骤1)中培养的时间为20～30d。
优选的，所述步骤2)的扩繁培养的时间25～35d。
优选的，所述步骤3)的生根培养基包含0.5～1.5mg/L IBA、18～25g/L蔗糖和5.0～6.0g/L琼脂的1/2MS培养基。
优选的，所述步骤3)的生根培养后还包括：将所述步骤3)得到的组培苗置于室温环境中适应性锻炼3～4d后移栽到基质中进行炼苗生长。
优选的，所述基质包括体积比为2:(0.8～1.5)的蛭石与草炭。
优选的，所述炼苗的环境温度为22～27℃，所述炼苗的环境湿度为75％～90％。
本发明提供了一种培养树莓波拉纳的扩繁培养基，为含有1.0～2.0mg/L激动素、0.1～0.5mg/L萘乙酸和0.5～2.0mg/L细胞分裂素，18～25g/L蔗糖和5.0～6.0g/L琼脂的MS培养基。在本发明中，所述激动素、萘乙酸和细胞分裂素作为植物生长调节剂协同发挥作用，激动素和细胞分裂素具有促细胞分裂、控制培养组织的形态建成、延迟衰老和促营养物质移动、促细胞扩大、促侧芽发育、参与叶绿体生物发生等重要的作用；萘乙酸与激动素和细胞分裂素一起使用能够刺激组织生长、适应新的培养环境，使树莓波拉纳达到快速繁殖的效果。
本发明还提供了一种树莓波拉纳的组培方法，将灭菌后的带侧芽波拉纳茎段接种至基础培养基上进行培养；待波拉纳茎段的侧芽长到1.5～2.0cm时，将侧芽接种所述的扩繁培养基上进行扩繁培养，得到扩繁苗；待扩繁苗长至2.0～3.0cm时，接种到生根培养基上进行生根培养，得到组培苗。本发明提供的组培方法选择侧芽为诱导材料，在扩繁培养基上培养后待扩繁苗长为2.0～3.0cm时，接种至生根培养得到生根苗，能够成功培养波拉纳的组培苗，并且采用所述培养方法组培的成活率达到96％以上。
具体实施方式
本发明提供了一种培养树莓波拉纳的扩繁培养基，为含有1.0～2.0mg/L激动素、0.1～0.5mg/L萘乙酸和0.5～2.0mg/L细胞分裂素，18～25g/L蔗糖和5.0～6.0g/L琼脂的MS培养基。
本发明中，所述扩繁培养基优选为含有0.5～1.5mg/L激动素、0.2～0.4mg/L萘乙酸和1.0～1.5mg/L细胞分裂素，20～23g/L蔗糖和5.6～5.8g/L琼脂的MS培养基。
本发明中，所述激动素、萘乙酸、细胞分裂素、蔗糖和琼脂的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的上述物质的来源即可。本发明中，所述激动素、萘乙酸和细胞分裂素均购自Sigma-Aldrich Co.LLC.。本发明中，所述蔗糖购自天津市福晨化学试剂厂；所述琼脂购自JAPAN公司。
本发明中，所述MS培养基优选包括以下的组分含量：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1650mg/L，磷酸二氢钾700mg/L，硫酸镁370mg/L，氯化钙440mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L。所述MS培养基的pH值优选为5.6～6.0，更优选为5.8。
本发明中，所述扩繁培养基的制备方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的培养基的制备方法即可。本发明中实施例中，将激动素、萘乙酸和细胞分裂素、蔗糖和琼脂与MS培养基中包含各组分混合即可。
本发明提供了一种树莓波拉纳的组培方法，包括以下步骤：
1)将灭菌后的带侧芽波拉纳茎段接种至基础培养基上进行培养；
2)待波拉纳茎段的侧芽长到1.5～2.0cm时，将侧芽切取接种至权利要求1或2所述的扩繁培养基上进行扩繁培养，得到扩繁苗；
3)待扩繁苗长至2.0～3.0cm时，接种到生根培养基上进行生根培养，得到组培苗。
本发明将将灭菌后的带侧芽波拉纳茎段接种至基础培养基上进行培养。本发明中，所述波拉纳茎段优选为当年生茎段。所述带侧芽波拉纳茎段的长度优选为1.5～2cm，更优选为1.8cm。所述侧芽的数量优选大于1个。
本发明所述带侧芽波拉纳茎段优选是通过带侧芽波拉纳枝条截取一段。本发明优选将所述带侧芽波拉纳枝条进行前处理。所述前处理的方法优选为：将带侧芽枝条在流水中冲洗20～30min，再用蒸馏水浸泡5～8min，将带有侧芽的枝条切割成茎段后进行灭菌处理。在本发明中，所述冲洗的时间优选为25min；所述蒸馏水浸泡的时间优选为6min。
本发明对所述灭菌的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的组培领域灭菌方法即可。在本发明实施例中，所述灭菌的具体步骤如下：将带侧芽茎段用体积浓度为70％～75％乙醇水溶液洗涤50～70s；将所述洗涤后的茎段用无菌水进行第一冲洗1～2次；将所述第一冲洗后的茎段用体积浓度为0.05～0.15％的升汞浸泡5～10min；将所述浸泡后的茎段用无菌水进行第二冲洗4～5次；用无菌滤纸吸干所述第二冲洗后的茎段表面水分。在本发明中，所述乙醇水溶液的体积浓度更优选为72％；所述乙醇溶液洗涤的时间优选为60s。在本发明中，所述升汞的体积浓度优选为0.1％；所述升汞浸泡的时间优选为8min。
本发明对所述接种的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的接种方法即可。本发明中，在带侧芽波拉纳茎段接种前优选切去两端创面。
本发明中，所述基础培养基优选为包含0.08～0.12mg/LNAA、0.3～0.8mg/L6BA(细胞分裂素)、15～25g/L蔗糖和5.0～6.0g/L琼脂的MS培养基，更优选为包含0.1mg/LNAA、0.5mg/L 6BA、20g/L蔗糖和5.6g/L琼脂的MS培养基。所述MS培养基的组成含量与上述方案中所述MS培养基一致。
本发明中，所述培养的条件优选为：温度22～27℃，光照强度1800～2200Lx，光照时间11～13h/d；更优选为温度25℃，光照强度为2000Lx，光照时间为12h/d。本发明中，所述培养的时间优选为20～30d，更优选为25d。本发明中所述培养的目的是使侧芽生长。
得到培养的侧芽后，本发明待波拉纳茎段的侧芽长到1.5～2.0cm时，将侧芽接种至上述技术方案所述的扩繁培养基上进行扩繁培养，得到扩繁苗。具体的，本发明将茎段上的侧芽切取后接种至扩繁培养基上。本发明优选待所述波拉纳茎段的侧芽长到1.8cm时，将侧芽接种至扩繁培养基上。
本发明中，用于接种的侧芽的长度优选为0.8～1.5cm，更优选为1.0～1.2cm。
本发明中，所述扩繁培养的时间优选为25～35d，更优选为30d。所述扩繁培养的温度优选为23～26℃，更优选为25℃；所述扩繁培养的湿度优选为70％～80％，更优选为75％。所述扩繁培养的光照的强度优选为180～2200Lx，更优选为2000Lx。
待扩繁苗长至2.0～3.0cm时，本发明将扩繁苗接种到生根培养基上进行生根培养，得到组培苗。本发明中，所述生根培养基优选为包含0.5～1.5mg/LIBA、18～25g/L蔗糖和5.0～6.0g/L琼脂的1/2MS培养基，更优选为包括1.0mg/LIBA、20g/L蔗糖和5.6g/L琼脂的1/2MS培养基。
本发明中，所述1/2MS培养基组分优选为硝酸钾950mg/L，硝酸铵825mg/L，磷酸二氢钾350mg/L，硫酸镁185mg/L，氯化钙220mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L。
本发明中，所述生根培养的时间优选为30d；所述生根培养的温度优选为23～26℃，更优选为25℃；所述生根培养的湿度优选为70％～80％，更优选为75％。所述生根培养的光照的强度优选为180～2200Lx，更优选为2000Lx。
所述生根培养得到组培苗后，本发明优选将所述组培苗适应性锻炼3～4d后移栽到基质中进行炼苗生长，得到适于户外的生长的拉波纳种苗。在本发明中，所述适应性锻炼优选在室温环境中进行。
本发明中，所述基质优选包括体积比为2:(0.8～1.5)的蛭石与草炭，更优选为体积比为2:1的蛭石与草炭。本发明对所述蛭石和草炭的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的蛭石和草炭即可。在本发明中，所述蛭石在使用前优选进行消毒；所述消毒用消毒剂优选为质量浓度为0.1～0.3％的高锰酸钾水溶液。本发明对所述消毒的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的采用高锰酸钾溶液进行消毒的技术方案即可。
本发明中，所述炼苗的环境温度优选为22～27℃，更优选为25℃；所述炼苗的环境湿度优选为75％～90％，更优选为85％。本发明中，所述适应性锻炼的目为组培苗移栽至室外提供一个过渡培养。
本发明中，所述移栽的方法没有特殊限制采用本领域技术人员所熟知的移栽方法即可。
下面结合实施例对本发明提供的一种用于培养树莓波拉纳的培养基及波拉纳的组培方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
取树莓波拉纳当年生带侧芽枝条，在流水中冲洗20min，再用蒸馏水泡5min，将带有侧芽的茎段切成1.5cm，在超净工作台上进行灭菌处理。用70％乙醇洗涤60S，用无菌水冲洗1次，再用0.1％升汞浸泡5min，无菌水冲洗4次，再用无菌滤纸吸干表面水分。
灭菌后的茎段切去两端创面，接种至附加NAA0.1mg/L，6BA0.5mg/L，添加蔗糖20g/L、琼脂5.6g/L的MS培养基上进行无菌培养20天。培养条件为：温度25℃，光照强度为2000Lx，光照时间为12h/d。
当侧芽长到1.5cm时，切取接种至附加1.0mg/LKT、0.5mg/LNAA和0.5mg/L 6-BA，添加蔗糖20g/L、琼脂5.6g/L的MS培养基上进行扩繁培养。
当组培苗长至2.0cm时，25天，切取2.0cm的组培苗接种到1/2MS培养基添加0.5mg/LIBA、蔗糖25g/L、琼脂6.0g/L的培养基上进行生根培养。
将生根组培苗瓶拿到温室揭盖适应性锻炼4天，再从组培瓶中用钝头镊子将苗小心夹出取出，洗净培养基移栽到用0.2％高锰酸钾消毒后的蛭石与草炭的体积比为2:1的基质中炼苗，温度27度，湿度75％，即获得波拉纳种苗。采用该方法得到的波拉纳种苗的成活率96％。
实施例2
取树莓波拉纳当年生带侧芽枝条，在流水中冲洗30min，再用蒸馏水泡10min，将带有侧芽的茎段切成2cm，在超净工作台上进行灭菌处理。用75％乙醇洗涤70s，用无菌水冲洗1次，再用0.08％升汞浸泡10min，无菌水冲洗4次，再用无菌滤纸吸干表面水分，优选7min。
灭菌后的茎段切去两端创面，接种至附加NAA0.1mg/L，6BA0.5mg/L，添加蔗糖15g/L、琼脂5.0g/L的MS培养基上进行无菌培养30天。培养条件为：温度25℃，光照强度为2000Lx，光照时间为12h/d。
当侧芽长到2.0cm时，切取接种至附加2.0mg/L KT、0.1mg/LNAA和2.0mg/L6-BA，添加蔗糖15g/L、琼脂5.0g/L的MS培养基上进行扩繁培养。
当组培苗长至3.0cm时，35天，切取2.0cm的组培苗接种到1/2MS培养基添加1.5mg/LIBA、蔗糖25g/L、琼脂6.0g/L的培养基上进行生根培养。
将生根组培苗瓶拿到温室揭盖适应性锻炼4天，再从组培瓶中用钝头镊子将苗小心夹出取出，洗净培养基移栽到用0.1％高锰酸钾消毒后的蛭石与草炭的体积比为2:1的基质中炼苗，温度22℃，湿度75％，即获得波拉纳种苗。采用该方法得到的波拉纳种苗的成活率99％。
实施例3
取树莓波拉纳当年生带侧芽枝条，在流水中冲洗25min，再用蒸馏水泡8min，将带有侧芽的茎段切成1.8cm，在超净工作台上进行灭菌处理。用72％乙醇洗涤50s，用无菌水冲洗1次，再用0.15％升汞浸泡7min，无菌水冲洗5次，再用无菌滤纸吸干表面水分，优选7min。
灭菌后的茎段切去两端创面，接种至附加NAA0.1mg/L，6BA0.5mg/L，添加蔗糖20g/L、琼脂5.6g/L的MS培养基上进行无菌培养25天。培养条件为：温度25℃，光照强度为2000Lx，光照时间为12h/d。
当侧芽长到1.8cm时，切取接种至附加1.5mg/LKT、0.2mg/LNAA和1.0mg/L 6-BA，添加蔗糖20g/L、琼脂5.6g/L的MS培养基上进行扩繁培养30天。
当组培苗长至2.5cm时，切取2.0cm的组培苗接种到1/2MS培养基添加1.0mg/LIBA、蔗糖20g/L、琼脂5.6g/L的培养基上进行生根培养。
将生根组培苗瓶拿到温室揭盖适应性锻炼3.5天，再从组培瓶中用钝头镊子将苗小心夹出取出，洗净培养基移栽到用0.3％高锰酸钾消毒后的蛭石与草炭的体积比为2:1的基质中炼苗，温度25℃，湿度85％，即获得波拉纳种苗。采用该方法得到的波拉纳种苗的成活率97％。
对比例
取树莓波拉纳当年生带侧芽枝条，在流水中冲洗20min，再用蒸馏水泡5min,将带有侧芽的茎段切成1.5-2cm，在超净工作台上进行灭菌处理。用70％乙醇洗涤60s，用无菌水冲洗1次，再用0.1％升汞浸泡5min，无菌水冲洗5次，再用无菌滤纸吸干表面水分。
灭菌后的茎段切去两端创面，接种至附加NAA0.1mg/L，6BA0.5mg/L，添加蔗糖20g/L、琼脂5.6g/L的MS培养基上进行无菌培养20天。培养条件为：温度25℃，光照强度为2000Lx，光照时间为12h/d。
当侧芽长到1.5cm时，切取接种至附加秋福培养基上，秋福培养基包括包含有0.1mg/L IBA、1.0mg/L 6BA和0.5mg/LGA3的MS培养基上，波拉纳在此培养基上生长逐渐衰弱，越来越小，20天左右叶片发黄，40天左右死亡。
由以上实施例可知，一种培养树莓波拉纳的扩繁培养基及其培养方法，采用上述扩增培养基和培养方法培养的拉波纳的成活率达到96％以上，采用秋福培养基培养拉波纳结果40天左右死亡，说明本发明树莓拉波纳品种进行组培对培养基的植物调节剂和营养物质有选择性，其他品种的树莓品种组培扩增培养基对拉波纳培养不适用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。