Slit2D2-嵌合抗原受体及其应用的制作方法

本发明涉及肿瘤治疗药物领域，尤其涉及slit2d2-嵌合抗原受体在预防和/或治疗robo1高表达肿瘤的药物中的应用。

背景技术：

人体的t淋巴细胞是通过其表面的t细胞受体来识别靶细胞的，这一识别具有特异性，即某一个t淋巴细胞只识别具有特定抗原的靶细胞，而且这种特定的抗原是在细胞内加工后，在特殊分子的作用下呈递给t淋巴细胞的。这种起抗原呈递作用的分子或者存在于抗原呈递细胞表面或者存在于靶细胞表面。至少有两方面的因素导致体内的t淋巴细胞不能很好地识别癌细胞：(1)癌细胞下调抗原呈递分子的表达，(2)被呈递的抗原与t细胞受体亲和力很弱。虽然癌症患者体内存在癌细胞高度特异性的t淋巴细胞，但是数量太少起不到治疗癌症的作用。基于这种情况，科学家提出了构建嵌合t细胞受体(现在一般称为嵌合抗原受体)的概念。嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，car)主要由两部分构成，一端位于细胞外能够特异性识别癌细胞表面的某一抗原，另一端位于胞内含有信号激活元件(如t细胞受体的zeta链)，起传递信号激活t细胞的作用。这样表达car的t淋巴细胞(cart细胞)就能避免t细胞受体识别靶细胞的限制，从而起到靶向癌细胞的杀伤作用。

目前，cart治疗的临床试验正在迅速增长，其中大部分是对b细胞恶性肿瘤治疗的评估。大多数b细胞恶性肿瘤和正常b细胞表达cd19抗原，但是其他类型的细胞没有cd19，因此cd19是一个很好的治疗靶点。不同的临床试验所采用的cd19cart细胞在组成上有一定差别，临床设计上也不一样，不过都报道了显著的效果，复发性或难治性淋巴细胞白血病的治疗能达到60-90％的反应率，一部分患者达到持续的缓解，最长的达到2年。虽然目前还不知道cd19cart治疗能达到多长时间的持续缓解，但是可以肯定的是这种免疫治疗已经给一些患者带来了以前所达不到的效果。

除了血液系统肿瘤外，研究者们一直在努力将cart治疗扩展到实体瘤。临床试验显示，gd2特异性的cart对神经母细胞瘤有一定的疗效，而afr特异性的cart细胞对卵巢癌，caix特异性的cart细胞对肾细胞癌和psma特异性的cart细胞对前列腺癌没有显示出治疗效果。宾州大学的carlhjune等在2015年美国临床肿瘤学年会上报告了用间皮素特异性的cart细胞治疗难治的和转移的胰腺导管腺癌的结果，结果显示患者对cart细胞具有很好的耐受性，没有出现细胞因子综合征，周血中能短时期内检测到cart细胞，有2名患者病情得到稳定。因此，cart治疗实体瘤还处于早期阶段，还有许多问题需要解决。

robo1是实体肿瘤治疗潜在新靶点，robo是一次跨膜的受体蛋白，在哺乳动物中，已经克隆到4个robo基因。从物种进化的角度看，robo1，2，3的胞外部分非常的保守，从果蝇到人类都是由5个ig样功能区和3个fibronectiniii型重复序列组成。robos有很短的跨膜区域和一个较长的胞内区；按照序列的保守性，胞内区被划分为4个更小的区域，分别命名为：cc0，cc1，cc2，cc3。robo4的结构与其它三个家族成员有很大的不同，它的胞外只有2个ig样功能区和3个fibronectiniii型重复序列；胞内也只有cc0和cc2两个区域。robos胞外的iggdomains被认为是与配体slit结合所必需的，较长的胞内区域则和一些重要的信号分子相互作用，参与slit/robo下游的信号转导，从而完成刺激信号由细胞外部到内部骨架的传递。目前，已完成slit2与robo相互作用区域蛋白质的机构解析，发现slit2的第二个结构域d2与robo1的ig1结合，进而启动信号传导。slit2/rono1相互作用三级结构解析参见附图1。

组织病理学检测显示robo1在多种癌症中过表达，如肝细胞癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤等。ito等人的研究显示robo1在肝癌中大量表达，而在正常组织中只有少量表达，且84.7％的肝癌组织样本为阳性表达，因此robo1可以作为一种新的肝细胞肿瘤相关抗原，是一种潜在的治疗和诊断靶标。等人的检测结果显示，80％的结肠癌患者的癌组织高度表达robo1mrna，45％的患者是正常组织4倍，15％的患者是正常组织的12倍，因此robo1可以为结肠癌的治疗提供了一个潜在靶点。通过比较胰腺导管癌和其周围良性组织，he等人发现robo1在癌组织中表达上调，而这种表达上调可能与胰腺癌细胞的淋巴转移相关。huang等人的研究也表明robo1与结肠癌的迁移有关。从http://xenobase.crownbio.com/xenobase/index.aspx数据库中分析显示(参见附图2)，大部分肿瘤细胞中高表达robo1蛋白分子。从http://www.genecards.org/cgi-bin/数据库中分析(参见图3)，在正常组织中低表达或不表达robo1分子，提示robo1是一个潜在的肿瘤治疗的新靶点。

本发明将开发一种针对robo1抗原分子的嵌合抗原受体，将其表达于细胞中，可以用于robo1高表达肿瘤的治疗。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种预防和/或治疗robo1高表达肿瘤的嵌合抗原受体。

本发明的另一个目的是提供一种预防和/或治疗robo1高表达肿瘤的嵌合抗原受体表达细胞。

本发明的还一目的是提供一种预防和/或治疗robo1高表达肿瘤的药物。

因此，本发明的第一方面提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和胞内免疫共刺激分子，其中所述胞外结构域包括slit2蛋白的d2结构域。

本发明所述的slit2蛋白d2结构域，简称slit2d2，具有：

1)如seqidno：1所示的氨基酸序列，或

2)将1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的氨基酸序列。

优选的，所述嵌合抗原受体依次由slit2蛋白的d2结构域、跨膜结构域和胞内免疫共刺激分子组成。

优选的，所述跨膜结构域包括cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd134、cd137、icos、cd154跨膜结构域中的一种或多种。

优选的，所述跨膜结构域为cd8跨膜结构域。

本发明所述的cd8跨膜结构域具有：

3)如seqidno：2所示的氨基酸序列，或

4)将3)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的氨基酸序列。

优选的，所述胞内免疫共刺激分子包括cd3ζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b、cd66d、cd2、cd4、cd5、cd28、cd134、cd137、icos、cd154、4-1bb和ox40胞内结构域中的一种或多种。

优选的，所述胞内免疫共刺激分子由4-1bb和cd3ζ胞内结构域组成。

本发明所述的4-1bb胞内结构域具有：

5)如seqidno：3所示的氨基酸序列，或

6)将5)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的氨基酸序列；

本发明所述的cd3ζ胞内结构域具有：

7)如seqidno：4所示的氨基酸序列，或

8)将7)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的氨基酸序列。

优选的，本发明所述的嵌合抗原受体由slit2蛋白的d2结构域、cd8跨膜结构域、4-1bb胞内结构域和cd3ζ胞内结构域组成，简称slit2d2-cd8^tm-4-1bb-cd3ζ，也称为slit2d2-car。

本发明所述的slit2d2-cd8^tm-4-1bb-cd3ζ具有：

9)如seqidno：5所示的氨基酸序列，或

10)将9)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的氨基酸序列。

优选的，所述的嵌合抗原受体中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

本发明所述的slit2蛋白d2结构域通过c末端与cd8跨膜结构域的n末端直接连接，或slit2蛋白d2结构域通过其n末端与的cd8跨膜结构域c末端直接连接，即slit2蛋白d2结构域与cd8跨膜结构域直接连接，中间没有任何连接肽。

本发明还提供一种编码本发明所述嵌合抗原受体的基因，所述嵌合抗原受体包括能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和胞内免疫共刺激分子，其中所述胞外结构域包括slit2蛋白的d2结构域。本发明所述的slit2蛋白d2结构域，简称slit2d2，其基因序列如seqidno：6所示。

优选的，所述的嵌合抗原受体由slit2蛋白的d2结构域、cd8跨膜结构域、4-1bb胞内结构域和cd3ζ胞内结构域组成，简称slit2d2-cd8^tm-4-1bb-cd3ζ，其中，所述的slit2蛋白d2结构域的基因序列如seqidno：6所示，所述的cd8跨膜结构域的基因序列如seqidno：7所示，所述的4-1bb胞内结构域的基因序列如seqidno：8所示，所述的cd3ζ胞内结构域的基因序列如seqidno：9所示。

本发明所述的slit2d2-cd8^tm-4-1bb-cd3ζ的基因序列如seqidno：10所示；

或者，在严格条件下与seqidno：10所示的序列杂交且编码具有预防和/或治疗肿瘤的相关蛋白的dna分子；

或者，与seqidno：10所示的序列具有至少90％以上，优选为95％以上，更优选为98％以上同源性且编码具有预防和/或治疗肿瘤的相关蛋白的dna分子。

本发明还提供了一种与嵌合抗原受体相关的生物材料，包括含有本发明所述编码嵌合抗原受体的基因的重组载体、表达盒、重组细胞、重组菌、重组病毒。优选的，本发明所述的重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。

本发明所述的嵌合抗原受体(car)可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。本发明合成编码基因可通过常规方法，从指定car的氨基酸序列，容易地制备编码car的碱基序列，由氨基酸序列的ncbirefseqid或genbenk检索号得到编码氨基酸序列的碱基序列，并且可使用标准分子生物学和/或化学程序制备本发明的核酸。例如，可根据碱基序列合成核酸，将得自cdna数据库的dna片段通过聚合酶链式反应(pcr)制备本发明的核酸。

本发明的第二方面是提供一种嵌合抗原受体表达细胞，所述嵌合抗原受体表达细胞为在细胞中引入了本发明所述的编码嵌合抗原受体的基因。

本发明中，细胞可来自哺乳动物的细胞(例如人细胞、小鼠、大鼠、猴)的细胞，可使用采集、分离、纯化或诱导自体液、组织或器官例如血(外周血、脐带血等)或骨髓的细胞。优选的，细胞是t细胞或含有t细胞的细胞群(例如pbmc)，更优选的，t细胞来源于人外周血的t细胞。

优选的，所述嵌合抗原受体为slit2d2-cd8^tm-4-1bb-cd3ζ，记为slit2d2-car，其中，所述的slit2d2-cd8^tm-4-1bb-cd3ζ的基因序列如seqidno：10所示；

或者，在严格条件下与seqidno：10所示的序列杂交且编码具有预防和/或治疗肿瘤的相关蛋白的dna分子；

或者，与seqidno：10所示的序列具有至少90％以上，优选为95％以上，更优选为98％以上同源性且编码具有预防和/或治疗肿瘤的相关蛋白的dna分子。

优选的，所述嵌合抗原受体表达细胞为在t细胞中引入编码slit2d2-cd8^tm-4-1bb-cd3ζ的基因，记为slit2d2-cart。

本发明还提供了一种制备嵌合抗原受体表达细胞的方法，包括将本发明所述的编码嵌合抗原受体的基因引入细胞中的步骤。

本发明中，将编码嵌合抗原受体的基因引入细胞中具体包括如下步骤：

合成和扩增嵌合抗原受体基因，将所述基因克隆至表达载体上；

利用包装质粒和表达载体转染细胞；

使细胞表达嵌合抗原受体，其中，在细胞表面表达slit2d2分子。

本发明中，细胞可来自哺乳动物的细胞(例如人细胞、小鼠、大鼠、猴)的细胞，可使用采集、分离、纯化或诱导自体液、组织或器官例如血(外周血、脐带血等)或骨髓的细胞。优选的，细胞是t细胞或含有t细胞的细胞群(例如pbmc)，更优选的，t细胞来源于人外周血的t细胞。

本发明中，表达载体可使用缺乏复制能力、无法在转染细胞中自我复制的病毒载体例如逆转录病毒载体(包括致癌逆转录病毒载体、慢病毒载体和假型载体)、腺病毒载体、痘苗病毒载体或hsv载体等。本发明中可根据逆转录病毒选择广泛市售的多种类的可用于包装逆转录病毒载体的包装质粒，也可使用具有高转染效率的293细胞或293t细胞制备逆转录病毒颗粒。

优选的，所述嵌合抗原受体为slit2d2-cd8^tm-4-1bb-cd3ζ，记为slit2d2-car，其中，所述的slit2d2-cd8^tm-4-1bb-cd3ζ的基因序列如seqidno：10所示；

或者，在严格条件下与seqidno：10所示的序列杂交且编码具有预防和/或治疗肿瘤的相关蛋白的dna分子；

或者，与seqidno：10所示的序列具有至少90％以上，优选为95％以上，更优选为98％以上同源性且编码具有预防和/或治疗肿瘤的相关蛋白的dna分子。

优选的，制备嵌合抗原受体表达细胞的方法包括将编码slit2d2-cd8^tm-4-1bb-cd3ζ的基因引入t细胞中的步骤。

在本发明一个具体的实施方式中，制备嵌合抗原受体表达细胞的方法具体包括如下步骤：

合成和扩增slit2d2-cd8^tm-4-1bb-cd3ζ基因，所述基因序列如seqidno：10所示，将所述基因克隆至慢病毒表达载体上；

利用慢病毒包装质粒和慢表达载体转染293t细胞，包装和制备慢病毒；

分离人外周血t细胞，培养扩增，利用慢病毒转染t细胞，使t细胞表达slit2d2-cd8^tm-4-1bb-cd3ζ，其中，在t细胞表面表达slit2d2分子，胞内由4-1bb-cd3ζ分子传递t细胞活化信号。

本发明的第三方面提供了一种药物组合物，包括本发明所述的嵌合抗原受体或本发明所述的嵌合抗原受体表达细胞以及药学上可接受的辅料。

本发明所述的药物组合物可以为片剂(包括糖衣片剂，膜包衣片剂，舌下片剂，口腔崩解片，口腔片剂等等)，丸剂，粉剂，颗粒剂，胶囊剂(包括软胶囊，微胶囊)，锭剂，糖浆剂，液体，乳剂，混悬剂，控制释放制剂(例如，瞬时释放制剂，缓释制剂，缓释微囊)，气雾剂，膜剂(例如，口服崩解膜剂，口腔粘膜-粘附膜剂)，注射剂(例如，皮下注射，静脉注射，肌内注射，腹膜内注射)，静脉滴注剂，透皮吸收制剂，软膏剂，洗剂，粘附制剂，栓剂(例如，直肠栓剂，阴道栓剂)，小药丸，鼻制剂，肺制剂(吸入剂)，眼睛滴剂等等，口服或胃肠外制剂(例如，静脉内，肌内，皮下，器官内，鼻内，皮内，滴注，脑内，直肠内等给药形式，给药至肿瘤的附近和直接给药至病变处)。优选的，所述的药物组合物为注射剂。

本发明所述的药学上可接受的辅料优选为药学上可接受的注射剂辅料，例如等渗的无菌盐溶液(磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁等，或上述盐的混合物)，或干燥的例如是冷冻干燥的组合物，其适当地通过加入无菌水或生理盐水形成可注射溶质。

本发明第四方面提供一种本发明所述嵌合抗原受体或嵌合抗原受体表达细胞在预防和/或治疗robo1高表达肿瘤中的应用。

本发明第五方面提供一种本发明所述嵌合抗原受体或嵌合抗原受体表达细胞在预防和/或治疗robo1高表达肿瘤的药物中的应用。

本发明所述robo1高表达肿瘤包括乳腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、直肠癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、神经胶质瘤等。

本发明采用slit2d2构建嵌合抗原受体(slit2d2-car)，并用于修饰和改造细胞，尤其是将slit2d2-car用于修饰和改造t细胞从而构建slit2d2-cart细胞，以robo1分子为靶抗原，利用slit2d2-cart细胞杀伤肿瘤细胞，并作为细胞药物用于肿瘤类疾病的治疗。采用本发明嵌合抗原受体，使改造后的细胞尤其是t细胞能够特异性识别和杀伤肿瘤，且具备更高效的肿瘤杀伤活性。

附图说明

图1slit2/robo1相互作用三级结构解析示意图；

图2robo1基因在肿瘤细胞中的表达分析；

图3robo1基因在组织中的表达分析；

图4为本发明prrslin-slit2d2慢病毒表达载体示意图；

图5为本发明高表达robo1的工程细胞株mcf7/robo1流式检测结果图；

图6为本发明slit2d2car-t体外杀伤实验结果；

图7为本发明不同效靶比条件下slit2d2car-t细胞对mcf-7/robo1的体外杀伤效果图；

图8为本发明不同效靶比条件下slit2d2car-t细胞对smcc-7721肿瘤细胞的体外杀伤效果图。

具体实施方式

本发明中术语“嵌合抗原受体(car)”是指包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和胞内免疫共刺激分子的融合蛋白，“嵌合抗原受体(car)”也称为“嵌合受体”、“t-body”或“嵌合免疫受体(cir)”，“能够结合抗原的胞外结构域”是指可结合特定抗原的任何寡肽或多肽。“跨膜结构域”是指衍生自自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白的多肽或者主要包含疏水性残基例如亮氨酸和缬氨酸的人工合成的多肽。“胞内免疫共刺激分子”是指已知在细胞中作为传输信号以引起生物过程的活化或抑制的结构域起作用的任何寡肽或多肽。

本发明中术语“结构域”是指是生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域，例如slit2蛋白d2结构域是指slit2蛋白中4个富含亮氨酸的重复序列中的第二结构域。

本发明中术语“slit2蛋白”是指神经迁移蛋白，是一种在进化上高度保守的分泌型细胞外基质糖蛋白，分子量约为200kd，对轴突生长和神经元迁移起导向作用，其结构由n端的胞外分泌信号肽，4个富含亮氨酸的重复序列(leucine-richrepeat，lrrs)，也被命名为d1-d4结构域，多个表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，egf)样的重复序列(在果蝇中是7个，在脊椎动物中是9个)，一个lamining样结构域和一个富含半胱氨酸的c端结构域组成。

本发明中术语“robo1”是一种单通道的跨膜受体蛋白，为slit蛋白的受体，其胞外区包括5个免疫球蛋白保守区和3个纤连蛋白iii型重复序列，胞内区包括cc0，cc1，cc2和cc3四个保守的区域。

本发明中术语“预防”或“治疗”包括治疗性或预防性处理或措施，目标是预防或减慢靶向的病理性状况或病症。如果根据本发明的方法接收治疗量的本发明所述融合蛋白后，对象表现出可观察和/或可测量的特定疾病一个或多个体征和症状的减少或消失，则该对象被成功“预防”或“治疗”。

以下所提供的实施例，可以更详细地解释本发明内容。但是，本发明的内容并不限于以下实施例所阐述的内容。

实施例1慢病毒表达载体制备

1.根据已知的slit2序列[genbank:eaw92793.1]分析设计构建slit2的第二个结构域slit2d2(hohenester2008)，从genbank数据库中搜寻已知的人cd8^tm跨膜区基因序列、人4-1bb胞内区基因序列和cd3ζ胞内区基因序列，各基因序列表参见序列表seqidno:6-9。

2.将上述基因序列依次按人slit2d2基因、cd8^tm膜区基因、人4-1bb胞内区基因和cd3ζ胞内区基因进行连接，在各序列连接处引入不同的酶切位点，形成完整的slit2d2-cd8^tm-4-1bb-cd3ζ(简称slit2d2-car)基因序列信息，其序列参见序列表seqidno:10。

3.将slit2d2-cd8^tm-4-1bb-cd3ζ的基因序列通过酶切转化连接到prrslin载体中，基因上游为ep-1α启动子。将载体转化到stbl3大肠杆菌菌株后，转种到含有氨苄青霉素的固体培养基中进行繁殖，筛选，获得阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定克隆，通过测序确认载体构建成功，获得prrslin-slit2d2慢病毒表达载体，慢病毒表达载体构建示意图参见附图3。

实施例2慢病毒制备

1.转染前24小时，以每皿约8×10⁶将293t细胞接种至15cm培养皿中。确保转染时细胞在80％左右的汇合度且均匀分布于培养皿中。

2.准备溶液a和溶液b

溶液a：6.25ml2×hepesbuffer缓冲液(采用5个大皿一起包装的量，效果最好)。

溶液b：分别加入以下质粒的混合物：112.5μgprrlsin-ef-pd1(targetplasmid)；39.5μgpmd2.g(vsv-genvelop)；73μgpcmvr8.74(gag，pol，tat，rev)；625μl2m钙离子溶液。溶液a总体积：6.25ml。

3.充分混匀溶液b，轻轻涡旋溶液a的同时，逐滴加入溶液a，静置5-15分钟。轻轻涡旋上述a和b的混合溶液，逐滴加入含293t细胞的培养皿中，轻轻前后晃动培养皿使dna与钙离子的混合物均匀分布。(不要旋转培养皿)放置于培养箱中培养16-18小时。

更换新鲜培养基，继续培养，分别在48小时和72小时后收集含病毒的上清液。采用荧光显微镜观察，95％以上的细胞显示绿色荧光。

在转速500g，温度25℃下离心10min，使用pes膜(0.45μm)过滤；以70％乙醇消毒离心管(贝克曼库尔特ultra-clearsw28centrifugetubes)，并置于紫外灯下消毒30min；将已过滤的含慢病毒的上清液转移至离心管中，在离心管底部小心铺上一层20％蔗糖(每8ml上清液加1ml蔗糖)，以pbs平衡离心管，在转速25,000rpm(82,700g)，温度4℃下离心2h；小心取出离心管，倒掉上清液，倒置离心管去掉残余液体；加入100μlpbs，密封离心管，在4℃放置2h，每20min轻轻涡旋一次，500g离心1min(25℃)，收集病毒上清；冰上冷却后，置于-80℃保存。

实施例3slit2d2-cart细胞制备

1.取0.5ml血进行快速的病原微生物检测，排除hbv、hcv、hdv和hev、hiv-1/2、梅毒螺旋体及寄生虫等微生物感染；无菌条件下，用肝素瓶采血50ml(肝素抗凝)，立即(4℃，24小时内)送至细胞制备实验室，保证此过程无病原微生物污染。得到患者血液后，在gmp制备室，用酒精棉球擦拭肝素瓶表面进行消毒后放入生物安全柜。

2.预先打开2个50ml离心管，将血液转入两个50ml离心管中，旋紧；将上述装好血液的两个50ml离心管放入离心机离心，400g(2000rpm)离心10min，室温离心后收集上层血浆，留下沉淀层；收集的自体血浆经56℃，30min灭活，4℃放置15min后，900g，离心30min(4℃)，取上清备用。

3.将上述富集的血细胞用生理盐水稀释至30ml/管，打开2个新的50ml离心管，每个离心管分别加入15ml人淋巴细胞分离液，用移液管把稀释后的血细胞液缓缓加入到盛有人淋巴分离液的离心管中，旋紧。注意血液要加到淋巴分离液的上层，勿打破人淋巴分离液的界面。将加好的血细胞液放入离心机，调至最小的升降速率，400g(2000rpm)离心20min(常温)。收集两管的中层白细胞层于一支15ml无菌离心管中，加入5ml生理盐水，洗两次(400g，离心10min)，得外周血单核细胞(pbmc)。

4.配置完全生长培养基，v-vivo15添加自体ab(fbs)浓度为5％，白细胞介素-2(il-2)浓度为40ng/ml，将分离得到的pbmc用培养基稀释成2×10⁶/ml，取50μl流式检测pbmc中t细胞的纯度。

5.day0，配置缓冲液(在pbs缓冲液中添加1％的胎牛血清(fbs))，选用微珠作为细胞培养载体，将微珠振荡30s或手动上下摇匀5min，按照微珠与t细胞的用量比为3：1取cd3/cd28微珠置于1.5mlep管中，添加1ml缓冲液清洗微珠，之后使用磁铁从ep管向外吸微珠1min，弃洗液，重复两次，再使用培养基将微珠重悬到原体积，将细胞和微珠混合后按2×10⁶pbmc/ml加到合适的培养瓶中。

6.day2将细胞密度调整至3-5×10⁶/ml，按病毒载体与细胞的比例为1:5添加实施例1制备得到的prrslin-slit2d2慢病毒表达载体，同时添加聚凝胺(polybrene)4μg/ml和40ng/mlil-2。4h之后，补加新鲜的完全培养基将细胞密度调整至1×10⁶/ml继续培养。将所有的细胞离心，加入新鲜的培养基，继续培养。

7.每隔2-3天进行半量换液，维持细胞密度在0.5-1×10⁶/ml。

8.day10-12，细胞数量达到10⁹级别，在400g下离心5min得到免疫细胞，再用预冷的pbs洗涤两遍(400g，5min)。

9.用血球计数板计数，流式细胞仪检测细胞类群，cart细胞比例。每天观察培养基的颜色变化、细胞密度、细胞形态并作相应记录。逐步扩大培养过程中，加入总体积所需的白细胞介素-2。

实施例4：工程细胞株的构建及检测

1.用于构建高表达robo1工程细胞株的慢病毒的制备(具体制备方法见实施例2中的方法)。

2.人乳腺癌(mcf7)细胞的侵染：侵染前一天，接种5×10⁵个mcf7细胞于6孔板中，待第二天细胞长到80％时，加入包装好的500μl的pd-l1病毒于6孔板中，同时设置对照细胞(不添加病毒)，12-16小时后换液，侵染3天后，流式分选robo1的阳性细胞。

3.工程细胞株的检测：取分选的robo1的阳性细胞2×10⁵个，在转速400g下离心5min，再用预冷的pbs洗涤两遍，加入2.5μl的robo1的抗体(biolegend)避光孵育20min，离心，再用预冷的pbs洗涤1遍，100μlpbs重悬细胞，流式检测robo1的表达，检测结果参见附图5，实验结果证明工程细胞株构建成功，可作为靶细胞用于后续杀伤实验。

实施例5slit2d2-cart细胞体外活性检测

采用ldh释放法检测slit2d2-cart细胞对工程细胞株mcf-1/robo1和高表达robo1的肝癌细胞系smcc7721细胞的杀伤效应，通过elisa方法检测ldh释放。

1.用含5％小牛血清的rpmi-1640培养液将靶细胞调整到5×10⁴/ml。

2.在96孔细胞培养板中加入靶细胞，每孔加100μl。取3个孔作为效应细胞(slit2d2-cart细胞)自然释放对照孔，不加靶细胞，仅加100μl培养液。

3.向各孔加100μl效应细胞，效应细胞与靶细胞的比例50:1；25:1；10:1；5:1；1:1。自然释放孔不加效应细胞只加100μl培养液，效应细胞与靶细胞共孵育6小时，每个实验置三个复孔。

4.最大释放孔中(阳性对照)加10μllysissolution(10×)，孵育45min-60min，每个实验置三个复孔。

5.取上述3和4中待测样品和对照样品各50μl，加入新鲜的96孔酶标板中，再加入反应液和底物，避光30min。

6.加入50μl终止液。

7.在酶联检测仪上测定各孔的光密度(od值)，检测波长490nm或492nm，在1小时内测完。

8.特异性杀伤效率计算

杀伤率＝实验组ldh(od)/最大ldh释放组(od)。

计算公式：杀伤效率＝(实验组-效应自然释放-靶自然释放)/(靶最大释放-靶自然释放)×100％

slit2d2car-t体外杀伤实验结果参见附图6，不同效靶比条件下slit2d2car-t细胞对mcf-7/robo1和smcc-7721肿瘤细胞的体外杀伤效果图参见附图7。由实验结果显示，制备的slit2d2car-t细胞能够显著杀伤高表达robo1的靶细胞株mcf-7/robo1和smcc7721，不同比例的效应细胞slit2d2car-t与靶细胞共孵育4小时后，elisa实验结果显示，随着效应细胞:靶细胞比例的增加，细胞杀伤效率也逐渐增加(参见附图7-8)，显微成像显示肿瘤细胞发生明显死亡(参见附图6)。