半滑舌鳎MCH2蛋白及其体外表达制备方法和应用与流程

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种半滑舌鳎mch2蛋白及其体外表达制备方法和应用。

背景技术：

鲆鲽鱼类是指身体侧扁、双眼同位于身体一侧、体两侧不对称着色(有眼侧着色、无眼侧白色)、营底栖生活的硬骨鱼类，一般统指鲽形目鱼类。我国是世界鲆鲽鱼类养殖大国，2012年鲆鲽类养殖产量达到14.04万吨，占我国海水鱼类养殖总产量的10.73％(中国渔业统计年鉴，2016)。目前，我国养殖鲆鲽鱼类的主要品种包括大菱鲆、牙鲆、半滑舌鳎等，养殖过程中养殖鱼特别是半滑舌鳎、牙鲆等普遍存在无眼侧体色变黑的现象，主要表现为无眼侧皮肤表面部分(20％-50％)覆盖斑状黑色素(主要出现在腹面的近尾端和体中部)或腹面全部被黑色素覆盖，而且这种无眼侧体色变黑的发生率高达60％-90％。这种无眼侧体色变黑的养殖半滑舌鳎商品鱼的市场价格比无眼侧体色为白色的正常鱼低15％-20％，成为制约半滑舌鳎等鲆鲽鱼类养殖产业提质增效的瓶颈之一。另外，无眼侧体色变黑的苗种也不适用于增殖放流。

黑色素富集素(mch)是下丘脑神经元分泌的一种小分子肽，最早在鱼类中发现，是mch基因编码的产物，其合成后分泌到垂体神经叶，最终进入血液循环系统扮演神经递质或神经调质的角色，促进黑色素细胞内黑色素颗粒凝集而使得鱼体色变浅。研究已经证明，mch同另一种与其生理拮抗的小分子神经肽--黑素细胞刺激素(msh)一起通过内分泌或旁分泌途径参与鱼类体色的调控。研究已经证实，mch在抑制鲆鲽鱼类无眼侧体色变黑方面具有重要的生理调控作用，如利用外源的mch肽可显著抑制条斑星鲽体色黑化(takahashietal,gen.comp.endocrinol.,2004,135:159–165)，表明在养殖生产过程中可利用mch产物来调控鲆鲽鱼类无眼侧体色黑化，如能规模化生产并应用在养殖过程中，其带来的养殖效益提升前景广阔。mch有两种分子形式mch1和mch2(mizusawaetal,gen.comp.endocrinol.,2015,214:140–148)，他们的产物蛋白具有类似的体色黑化抑制调控功能。鱼类mch还具有明显的促生长调控作用，是饲料添加剂的优良来源。然而，目前无论是mch1还是mch2蛋白的获得尚依赖于人工合成，产量低、成本高，且仅用于试验用途，尚无法进行批量化生产应用于养殖生产。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供一种半滑舌鳎mch2蛋白及其体外表达制备和应用方法，利用获得的半滑舌鳎mch2基因的成熟肽序列，重组进原核表达载体建立mch2重组表达载体，并通过生产条件优化在原核生物中进行大量表达，从而获得大批量具有生物活性的体外制备的重组半滑舌鳎mch2蛋白，可在半滑舌鳎养殖生产中应用，有效控制无眼侧体色黑化的发生，显著提升养殖效益。

本发明通过以下技术方案实现：

一种半滑舌鳎mch2蛋白，所述半滑舌鳎mch2蛋白的核苷酸序列为seqidno:1；

一种半滑舌鳎mch2蛋白，所述半滑舌鳎mch2蛋白的氨基酸序列为seqidno:2；

本发明还提供一种半滑舌鳎mch2蛋白的体外表达制备方法，它包括重组表达载体构建、重组表达载体诱导表达和重组蛋白纯化。

所述的重组表达载体构建，其特征在于将原核表达载体pet32a与目的核苷酸片段进行重组，构成可表达氨基酸序列为seqidno:2的半滑舌鳎黑色素富集素2(mch2)多肽的重组表达载体。

进一步，所述的mch2成熟肽的目的核苷酸片段的序列为seqidno:1。

所述的重组表达载体诱导表达，将重组表达载体导入表达宿主菌bl21(de3)plyss，并利用诱导剂诱导重组表达载体在宿主菌中大量表达。

进一步，所述的诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷(iptg)。

进一步，诱导条件为：温度为27℃，iptg浓度为0.2mmol/l，诱导时间为6h。

所述的重组蛋白纯化，其特征在于将表达了目的蛋白的bl21(de3)plyss菌株收集离心、破碎后以ni²⁺-nta亲和层析柱分离并纯化。

本发明还提供一种所述体外制备的mch2蛋白在饲料中的应用。

本发明提供一种包含有所述体外制备的mch2蛋白饲料添加剂。

本发明与现有技术的对比的有益效果：

本发明筛选了一种适宜半滑舌鳎mch2体外表达的原核载体，获得了可用于量化生产的重组表达载体，实现了半滑舌鳎mch2多肽在原核生物体内的规模化、低成本生产，通过纯化可获得用于注射用或者饲料添加的生物功能制品。本发明获得的半滑舌鳎mch2蛋白可以水剂或者专用饲料添加剂的形式，广泛应用于半滑舌鳎养殖体色调控及摄食生长调控研究，为养殖半滑舌鳎等鲆鲽鱼类无眼侧体色黑化问题提供了解决方案，以科技推动养殖技术进步和提质增收。

附图说明

图1半滑舌鳎mch2重组蛋白的表达与纯化

m：蛋白marker；1：pet32a空载2：27℃条件下0.2mmol/liptg诱导6h的重组mch2蛋白表达菌；3-4：ni²⁺-nta纯化柱纯化后蛋白液(箭头示32.1kd重组蛋白)

图2半滑舌鳎mch2重组蛋白对离体孵育的垂体基因表达的影响

注：mch1(a1),mch2(a2),pomc-a(b1),pomc-b(b2),mchr1(c1),mch1(c2),pacap(d1),mitf(d2)mrna表达水平变化，不同字母代表显著性差异(p<0.05)

具体实施方式

下面通过实施例结合附图来对本发明的技术方案做进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

1、半滑舌鳎mch2成熟肽扩增

取样半滑舌鳎成鱼垂体组织，提取总rna，反转录为cdna保存。根据半滑舌鳎mch2成熟肽的cnda序列(seqidno:1)，设计一对特异性引物克隆成熟肽序列，在引物的两端分别引入限制性内切酶位点bamhi和hindiii，在mch2-r引物中加入强终止密码子taa，用于扩增半滑舌鳎mch2成熟肽序列，引物序列如下：

mch2-f:5-′ataggatccagccacctagtggtcg-3′

mch2-r:5′-ataaagcttttatcagttggaggttcccc-3′；

pcr体系为20μl，扩增条件为：94℃5min变性，(94℃30s、58℃30s、72℃50s)34个循环，最后72℃延伸10min。将得到的成熟肽片段连接到peasy-t1simple载体上，转化dh5α感受态细胞，平板培养后挑选阳性克隆测序验证序列是否正确。

2、重组表达载体构建

提取mch2/peasy-t1质粒，以限制性内切酶bamhi和hindiii将mch2/peasy-t1质粒和表达载体pet-32a双酶切，使用t4连接酶将目的片段连接到pet-32a上，得到用于表达序列为seqidno:2的半滑舌鳎mch2的重组表达载体，再次转化至大肠杆菌dh5α中，菌液pcr验证后并测序。

3、重组表达载体诱诱导表达与鉴定

将验证正确的重组表达载体转化到表达菌株bl21(de3)plyss中，挑取阳性单克隆接种于含氨苄青霉素(100μg/ml)的lb培养基中，37℃振荡培养过夜，并按1：100扩大培养至od600值为0.6-0.7后，加入iptg(1mmol/l)继续诱导培养。分别设置不同的诱导培养时间、培养温度和iptg浓度，诱导mch2在表达菌株中的表达，获得最佳的表达条件为温度为27℃，iptg浓度为0.2mmol/l，诱导时间为6h，此时mch2蛋白的表达率可达55％。利用western-blotting方法验证获得目的蛋白条带的特异性，如图1所示。

4、重组蛋白纯化

重组mch2菌种接种到500mllb培养基中(含有100μg/ml氨苄霉素)，27℃条件下iptg(0.2mmol/l)诱导重组菌6h后，4℃、12000r/min离心10min收集菌体，每克菌体加入结合缓冲液(20mmol/lna3po4，0.5mol/lnacl，20mmol/l咪唑)15ml重悬菌体。在–80℃条件下反复冻融菌液3次，冰浴进行超声破碎(800w)，5s超声，5s间隔，破碎30min左右。破碎后用4℃、12000r/min离心10min收集上清液，先后用0.8μm和0.45μm微孔滤膜过滤，然后经ni²⁺-nta亲和层析柱分离、纯化目的蛋白，得到的纯化mch1重组蛋白相对分子质量约为32.1kd，符合预期计算值，获得的重组mch2蛋白浓度为900μg/ml。

5、半滑舌鳎mch2蛋白生物活性测定

取半滑舌鳎成鱼的垂体组织，以l15培养基清洗后置于含10％小牛血清的l15培养液中培养6小时，之后用含有不同浓度mch2重组蛋白(0nmol/l、1nmol/l、10nmol/l、100nmol/l和1000nmol/l)的无小牛血清的l15培养液中孵育，在co2细胞培养箱中25℃培养24h，培养结束后收集组织孵育液和垂体组织。

获得的半滑舌鳎mch2重组蛋白在100nmol/l时可显著提升离体孵育的垂体组织孵育液中mch肽含量，并在1000nmol/l达到峰值，此时孵育液中mch肽含量显著增加并达到峰值。同时，获得的半滑舌鳎mch2重组蛋白可促进离体孵育的垂体组织中mch1mrna表达水平在10nmol/l显著升高并达到峰值，但在100nmol/l之后显著降低；mch2mrna表达水平在1000nmol/l时显著升高达到峰值；pomc-amrna表达水平在100nmol/l显著升高，pomc-bmrna表达水平在100nmol/l开始显著下降。表明获得的半滑舌鳎mch2重组蛋白具有较理想的生物活性，如图2所示。

6、半滑舌鳎mch2重组蛋白的应用

本发明提供的半滑舌鳎mch2蛋白体外表达制备方法可成功实现半滑舌鳎mch2成熟肽在大肠杆菌中的高效表达。将成功表达mch2成熟肽的菌株经分离纯化等步骤后，可获得mch2重组蛋白，以去离子水保存成水剂，可用于科学实验研究。例如，按照5μg/kg的mch2重组蛋白剂量，对无眼侧皮肤发生严重黑化(90％)的半滑舌鳎进行背部肌肉皮下注射，在一周内可有效减弱无眼侧黑化症状。如对获得的重组蛋白进行微滤、超滤、喷雾干燥、冻干等处理后可获得粉剂产品，可用于饲料添加剂使用。例如，按照0.1％的添加比例将mch2重组蛋白添加进半滑舌鳎饲料重，可显著促进半滑舌鳎摄食，同时还可有效控制无眼侧体色黑化的发生和发育进程。

sequencelisting

<110>中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120>半滑舌鳎mch2蛋白及其的体外表达制备方法和应用

<130>无

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>387

<212>dna

<213>cynoglossussemilaevisgunther

<400>1

agccacctagtggtcgtagccatgcccgagaccaagggagaagatgccatgatggagcag60

gacagcctgggttcgttactgggggaggagagcctgacggaccgagccatgcttccatca120

gcgtatgctaacggcctgatgttgaacaactacagagcagacgacggaaaccctaacgtt180

ctaattttctcggacatgcggcaaaaaggacagggcattcgtgggctgagtccaggtttt240

acccgaagccttcctcaaatcacagaccgaaagatgaaccagtccccgggcgaatatagt300

ctgaaaatggatcgacgaaacactgaacttgacatgctgcgctgcatgataggcagagtt360

taccgaccctgctggggaacctccaac387

<210>2

<211>129

<212>prt

<213>cynoglossussemilaevisgunther

<400>2

serhisleuvalvalvalalametprogluthrlysglygluaspala

151015

metmetgluglnaspserleuglyserleuleuglyglugluserleu

202530

thraspargalametleuproseralatyralaasnglyleumetleu

354045

asnasntyrargalaaspaspglyasnproasnvalleuilepheser

505560

aspmetargglnlysglyglnglyileargglyleuserproglyphe

65707580

thrargserleuproglnilethrasparglysmetasnglnserpro

859095

glyglutyrserleulysmetaspargargasnthrgluleuaspmet

100105110

leuargcysmetileglyargvaltyrargprocystrpglythrser

115120125

asn

<210>3

<211>24

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>mch2-f

<400>3

ataggatccagccacctagtggtc24

<210>4

<211>28

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>mch2-r

<400>4

ataaagcttttatcagttggaggttccc28