一种提取山核桃蒲壳甾醇的方法与流程

本发明涉及甾醇提取技术领域，具体涉及一种提取山核桃蒲壳甾醇的方法。

背景技术：

植物甾醇是一种以环戊烷多氢菲为骨架的三萜类化合物。植物中甾醇以游离态和结合态形式存在。天然植物甾醇种类繁多，主要包括β-谷甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇和菜油甾醇四种无甲基甾醇。植物中的甾醇类物质不仅可以直接用于消炎、降血脂、抗溃疡和防治癌症,也可以用于生产甾醇类药物。一般认为，植物油及其加工产品是植物甾醇最丰富的天然来源，其次是谷物副产品和坚果。

山核桃(carya)又名“小胡桃”、核桃楸，属胡桃科、胡桃属植物。山核桃主要分布于浙、皖两省交界的天目山区周围，包括浙江临安、富阳、淳安、安吉、建德和安徽宁国、绩溪、旌德、歙县等县市。目前仅浙江省山核桃种植面积就超过70万亩，产量达到8000余吨。

每年因山核桃生产而产生的蒲壳达3万余吨，目前尚未找到科学合理的处理方法，或随意堆放或倒入河流中，对土壤和河流周围的生态环境造成污染，已成为当地经济可持续发展过程中不容忽视的问题。如能利用山核桃蒲壳资源，开发出应用潜力和药用价值较高的天然产物，变废为宝，既能缓解对当地生态环境造成的压力，又能提高山核桃产业的经济效益。

吴德玲等从核桃外蒲壳中分离出β-谷甾醇，并具体公开提取方法：取山核桃外蒲壳10kg粉碎，70％乙醇加热回流提取2次，合并提取液，浓缩液挥去乙醇后，加水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。浓缩得石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取浸膏。石油醚、乙酸乙酯部位经反复硅胶柱色谱结合sephadexlh-20方法得到5种化合物，其中β-谷甾醇为38mg(山核桃外蒲壳化学成分及抗肿瘤活性研究.中药材.2011(7).)。

传统的甾醇提取工艺应用最多的乙醇溶液作为提取剂，但是提取时间长、效率低。因此，为了合理高效地提取山核桃蒲壳中的甾醇物质，亟需提供一种操作简单、成本较低、提取率高、安全绿色的提取方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种操作简单、成本低廉、安全绿色，同时又能合理高效地从山核桃蒲壳中提取甾醇的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种提取山核桃蒲壳甾醇的方法，包括：以山核桃蒲壳粉末为原料，按照15-20ml/g液料比加入ph为1.6-2.5的柠檬酸乙醇溶液或盐酸乙醇溶液，在50-60℃水浴下浸提0.5-2.5h，分离收集上清液，加入石油醚进行萃取，取石油醚相真空旋干制得山核桃蒲壳甾醇粉末。

本发明针对山核桃蒲壳进行开发，变废为宝，具有较好的经济效应和社会效应。所述的山核桃蒲壳粉末由新鲜山核桃蒲壳在40-50℃下烘干至恒重后，粉碎至80-100目制得。

自然界中存在的植物甾醇有游离型和结合态两种，结合态又分为：甾醇酯、甾醇糖苷和酰化甾醇糖苷三种形式。酸性乙醇提取剂可将甾醇糖苷和酰化甾醇糖苷的糖苷键水解从而解离出游离态甾醇，提高游离态甾醇的提取量。本发明研究发现，提取剂中添加柠檬酸或盐酸有助于提取山核桃蒲壳中的甾醇。柠檬酸是一种天然、无毒且廉价的成分，且安全无毒，以此提取的产物可直接用于食品生产。

所述的柠檬酸乙醇溶液和盐酸乙醇溶液的溶剂为无水乙醇。更为优选，提取剂的ph值为2.0。

本发明研究发现，浸提温度是影响山核桃蒲壳甾醇提取效率的关键因素，作为优选，浸提的温度为55-56℃。

作为优选，所述的分离为真空抽滤。

所述的萃取为往上清液中加入等体积的石油醚和蒸馏水，超声振荡5-10min，静置分层，收集石油醚相，萃取的次数为2次，合并两次的石油醚相。

对石油醚相进行纯化有利于提高提取产物的纯度，具体地，将萃取得到的石油醚相水洗至中性，再往石油醚相中加入无水硫酸钠进行干燥，静置后过滤，得到纯化的石油醚相。

作为优选，所述真空旋干的温度为37℃。

本发明利用响应面法对影响山核桃蒲壳甾醇提取的因素进行优化，在单因素试验中发现，液料比、提取剂的ph值、提取温度是3个主要影响因素，box-behnken法优化出最佳提取工艺。

作为优选，利用响应面法优化后的工艺条件，包括：将新鲜山核桃蒲壳洗净，在40℃温度下烘24h至恒重后，粉碎至100目，按照17.12ml/g液料比加入ph为2.0的柠檬酸乙醇溶液，在55.81℃水浴下浸提1h，真空抽滤收集提取液，加入石油醚进行萃取，取石油醚相真空旋干制得山核桃蒲壳甾醇粉末。

本发明具备的有益效果：

(1)本发明在乙醇提取剂中添加柠檬酸或盐酸提供酸性条件，显著提高对山核桃蒲壳甾醇物质的提取率，缩短提取时间；相较于其他酸性物质，柠檬酸和盐酸更有利于甾醇的溶出。

(2)与正交法相比，本发明采用box-behnkendesigns(bbd)中心组合设计模型的响应面分析法，用3个变化因子、3个水平及少量的实验组(仅17组实验)就可以得出优化结果，获得最佳产率，在提高了提取效率的同时，降低了能耗和污染物的排放，具有工业化生产的实际意义。

(3)本发明针对山核桃蒲壳进行开发，提取方法简单，节约成本，提高了生产效率，提取的产物可直接用于食品生产，提取试剂均符合食品生产要求，因此，本发明方法具有较好的经济效应和社会效应。

附图说明

图1为本发明提取料液比变化对甾醇提取率影响图。

图2为本发明提取温度变化对甾醇提取率影响图。

图3为本发明ph变化对甾醇提取率影响图。

图4为本发明时间变化对甾醇提取率影响图。

图5为本发明提取料液比与提取温度对甾醇提取率影响的响应面三维图。

图6为本发明提取料液比与提取温度对甾醇提取率影响的响应面二维图。

图7为本发明提取料液比与ph对甾醇提取率影响的响应面三维图。

图8为本发明提取料液比与ph对甾醇提取率影响的响应面二维图。

图9为本发明提取温度与ph对甾醇提取率影响的响应面三维图。

图10为本发明提取温度与ph对甾醇提取率影响的响应面二维图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；上述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一种利用响应面法优化山核桃蒲壳甾醇的柠檬酸提取方法，包括以下步骤：

(1)样品制备：

将新鲜山核桃蒲壳洗净，在40℃温度下烘24h至恒重后，粉碎至100目，按4-20ml/g液料比加入ph为1.6-7的柠檬酸-乙醇溶液，在30-70℃水浴下提取0.5-2.5h后，真空抽滤收集提取液；

往提取液中加入等体积的石油醚和蒸馏水，封住瓶口后超声处理5min，转移至分液漏斗中，静置分层后收集上层石油醚层。下层水层用石油醚萃取两次，合并石油醚相。水洗石油醚层，水洗至中性后，收集石油醚层，加入无水硫酸钠干燥，静置1h后过滤。37℃真空旋干，加入乙醇溶液溶解，得到对应于不同提取条件的柠檬酸提取液。

(2)硫磷铁法测定提取液中总甾醇含量

①溶液制备：

a.标准品溶液：精密称取β-谷甾醇标准品2.5mg，溶于无水乙醇，并定容至25ml，即得。

b.铁贮存液：称取三氯化铁(fecl3·6h2o)2.5g，溶于87％浓磷酸，并定容至100ml，摇匀，此液可长期保存。

c.硫磷铁显色剂：取铁贮存液8.0ml，加浓硫酸至100ml，即得硫磷铁显色剂。

d.显色溶液：精密移取5.0ml待测溶液于试管，再沿壁缓慢向试管内加入5.0ml硫磷铁显色剂，摇匀，室温下冷却30min，即得显色溶液。

②标准曲线制作：

精密移取0、1、2、3、4、5mlβ-谷甾醇标准液，用无水乙醇定容至10ml，制备显色溶液，于530nm波长下测定吸光度。以吸光度(y)对β-谷甾醇浓度(x)进行线性回归。

③样品中总甾醇含量的测定：

取样品2ml，加入显色剂蒸馏水，其余操作均与所述步骤②制作标准曲线相同，在530nm波长下比色，所得数值在标准曲线上查出相应的总甾醇含量。

(3)实验设计与统计分析：

①单因素试验：

依次改变液料比、提取时间、提取温度、柠檬酸浓度进行单因素试验，用硫磷铁法测定所得山核桃蒲壳甾醇提取物中总甾醇含量，并按下式计算总甾醇得率，每次处理重复三次：

甾醇得率(％)＝(样液中总甾醇含量×样液体积)/山核桃蒲壳粉末质量×100％。

如图1-4所示，提取液料比、提取温度、ph这3个因素对山核桃蒲壳中甾醇的提取效果影响较显著。

②响应面法优化设计：

根据单因素试验结果，提取时间1h，选取甾醇提取效果影响较显著的提取液料比、提取温度、ph这3个因素，利用designexpert8.0软件根据box-behnken设计原则进行实验设计，如表1、表2所示。

表1实验因素与水平设定

表2box-behnken实验设计与结果

以a-提取温度(℃)，b-ph，c-固液比(ml/g)为自变量，以甾醇得率为响应值y，建立多元二次回归方程：

甾醇提取量＝1631.32+38.82×a-2229.85×b+147.86×c+1.96×a×b-0.08×a×c-18.41×b×c-0.37a²+396.93×b²-3.12×c²。

各因子与响应值之间线性关系显著性，由f值检验来判定，p值越小，则说明变量的显著性越高。由方差分析表(表3)可知，其因变量和全体自变量之间的线性关系显著(r²＝0.9842)，模型显著水平小于0.05，所以该回归方程模型是显著的。

表3实验数据的方差分析结果

(4)实验结果分析与优化：

利用designexpert8.0软件根据多元二次回归方程进行绘图分析，得到回归方程的响应面及其等高线图(如图5-10)。

由designexpert8.0软件得到柠檬酸提取山核桃蒲壳甾醇的最佳提取条件为：温度55.81℃、液料比17.12(ml/g)、ph2.00，在此条件下，甾醇的理论提取量为902.874μg/gdw。

实施例2

一种利用响应面法优化山核桃蒲壳甾醇的柠檬酸提取方法，包括以下步骤：

将新鲜山核桃蒲壳洗净，在40℃温度下烘24h至恒重后，粉碎至100目，按17.12ml/g液料比加入ph为2的柠檬酸-乙醇溶液，在55.81℃水浴下提取1h后，真空抽滤收集提取液；

以石油醚进行萃取，37℃真空旋干，制得山核桃蒲壳甾醇粉状产品。利用硫磷铁法测定总甾醇含量为912.452μg/gdw±17.452μg/gdw。

实施例3

将新鲜山核桃蒲壳洗净，在40℃温度下烘24h至恒重后，粉碎至100目，按15ml/g液料比加入ph为1.6的柠檬酸-乙醇溶液，在50℃水浴下提取1h后，真空抽滤收集提取液；

以石油醚进行萃取，37℃真空旋干，制得山核桃蒲壳甾醇粉状产品。利用硫磷铁法测定总甾醇含量为874.081μg/gdw±53.44μg/gdw。

实施例4

将新鲜山核桃蒲壳洗净，在40℃温度下烘24h至恒重后，粉碎至100目，按17.12ml/g液料比加入ph为2的盐酸-乙醇溶液，在55.81℃水浴下提取1h后，真空抽滤收集提取液；

以石油醚进行萃取，37℃真空旋干，制得山核桃蒲壳甾醇粉状产品。利用硫磷铁法测定总甾醇含量为779.052μg/gdw±9.195μg/gdw。

对比例1

将新鲜山核桃蒲壳洗净，在40℃温度下烘24h至恒重后，粉碎至100目，按20ml/g液料比加入ph为2.5的柠檬酸-乙醇溶液，在70℃水浴下提取1h后，真空抽滤收集提取液；

以石油醚进行萃取，37℃真空旋干，制得山核桃蒲壳甾醇粉状产品。利用硫磷铁法测定总甾醇含量为370.168μg/gdw±53.44μg/gdw。

对比例2

将新鲜山核桃蒲壳洗净，在40℃温度下烘24h至恒重后，粉碎至100目，按20ml/g液料比加入ph为2的硫酸-乙醇溶液，在60℃水浴下提取1h后，真空抽滤收集提取液；

以石油醚进行萃取，37℃真空旋干，制得山核桃蒲壳甾醇粉状产品。利用硫磷铁法测定总甾醇含量为645.80μg/gdw±43.95μg/gdw。

对比例3

将新鲜山核桃蒲壳洗净，在40℃温度下烘24h至恒重后，粉碎至100目，按20ml/g液料比加入ph为2的磷酸-乙醇溶液，在60℃水浴下提取1h后，真空抽滤收集提取液；

以石油醚进行萃取，37℃真空旋干，制得山核桃蒲壳甾醇粉状产品。利用硫磷铁法测定总甾醇含量为653.49μg/gdw±11.57μg/gdw。

对比例4

将新鲜山核桃蒲壳洗净，在40℃温度下烘24h至恒重后，粉碎至100目，按20ml/g液料比加入无水乙醇，在60℃水浴下提取1h后，真空抽滤收集提取液；

以石油醚进行萃取，37℃真空旋干，制得山核桃蒲壳甾醇粉状产品。利用硫磷铁法测定总甾醇含量为476.04μg/gdw±36.19μg/gdw。