全人源化抗中东呼吸综合征冠状病毒中和抗体的制作方法

本发明涉及生物医学领域中全人源化抗中东呼吸综合征冠状病毒中和抗体。

背景技术：

中东呼吸综合征冠状病毒(middleeastrespiratorysydromecoronavirus,mers-cov)是继重症急性呼吸综合征冠状病毒(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus,sars-cov)之后出现的又一个高致病性冠状病毒。自2012年9月首次报道以来，截止2015年6月29日，全球已向世卫组织通报了1379例mers-cov感染实验室确诊病例，其中531例死亡。迄今，mers-cov感染疫情已波及中东、欧洲、北非、亚洲、美国26个国家和地区，尤其是2015年韩国暴发流行的疫情，由一名中东旅行后感染患者导致了164例感染及23例死亡，更提示该病毒已获得有限的人-人传播能力。而目前尚无有效的疫苗及抗病毒药物，mers-cov感染是公共健康面临的严峻挑战之一。

通过病毒表面的刺突(spike,s)，mers-cov病毒结合靶细胞上特异性受体，从而侵入宿主细胞。s蛋白也是诱导机体产生中和抗体的重要抗原之一。被动免疫治疗是治疗及预防病毒感染的有效、经典策略，制备供人类使用的完全人抗体的方法包括：小鼠单克隆抗体人源化及噬菌体展示、酵母展示、ebv转化b细胞筛选获得结合抗原的人源抗体基因。现已发现和报道的中和抗体1e9，1f8，3c12，3b11，m336通过非免疫人群噬菌体展示文库筛选获得。因此，需要进一步开发出亲和性良好且副作用低的治疗性抗体，如人源化或全人源的抗体，以满足临床治疗的需求。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何诊断和/或治疗和/或预防中东呼吸综合征冠状病毒或该病毒感染。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了由重链和轻链组成的抗体，所述轻链由可变区vl和恒定区cl组成，所述重链由可变区vh和恒定区ch组成，所述vh和vl均由决定簇互补区和框架区组成，所述决定簇互补区由cdr1、cdr2和cdr3组成；所述vh的cdr3的氨基酸序列如序列1的第97-114位所示；所述vh的cdr1的氨基酸序列如序列1的第26-33位所示；所述vh的cdr2的氨基酸序列如序列1的第51-58位所示；

所述vl的cdr1的氨基酸序列为下述h1)或h2)：

h1)序列3的第26-34位；

h2)序列6的第26-34位；

所述vl的cdr2的氨基酸序列为下述i1)或i2)：

i1)序列3的第52-54位；

i2)序列6的第52-54位；

所述vl的cdr3的氨基酸序列为下述j1)-j4)中的任一种：

j1)序列3的第91-101位；

j2)序列4的第91-102位；

j3)序列5的第91-101位；

j4)序列6的第91-100位。

上述抗体中，所述vh和vl的框架区均可来源于人。

上述抗体中，所述vh的氨基酸序列如序列表中序列1的第1-125位或序列2的第1-125位所示，所述vl的氨基酸序列如序列表中序列3的第1-111位、序列4的第1-112位、序列5的第1-111位或序列6的第1-110位所示。

上述抗体中，所述cl和所述ch均可来源于人。

上述抗体中，所述重链的氨基酸序列如序列表中序列1或序列2所示，所述轻链的氨基酸序列如序列3、序列4、序列5或序列6所示。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述抗体的衍生抗体，所述衍生抗体是下述a)-d)中的任一种：

a)由所述抗体的vh和vl连接得到的单链抗体；

b)含有a)所述单链抗体的融合抗体；

c)含有所述抗体的vh和vl的fab；

d)含有所述抗体的vh和vl的完整抗体。

为解决上述技术问题，本发明还提供了与所述抗体相关的生物材料，所述生物材料为b1)至b20)中的任一种：

b1)编码所述抗体的核酸分子；

b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；

b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体；

b4)含有b2)所述表达盒的重组载体；

b5)含有b1)所述核酸分子的重组微生物；

b6)含有b2)所述表达盒的重组微生物；

b7)含有b3)所述重组载体的重组微生物；

b8)含有b4)所述重组载体的重组微生物；

b9)含有b1)所述核酸分子的重组细胞系；

b10)含有b2)所述表达盒的重组细胞系；

b11)编码所述衍生抗体的核酸分子；

b12)含有b11)所述核酸分子的表达盒；

b13)含有b11)所述核酸分子的重组载体；

b14)含有b12)所述表达盒的重组载体；

b15)含有b11)所述核酸分子的重组微生物；

b16)含有b12)所述表达盒的重组微生物；

b17)含有b13)所述重组载体的重组微生物；

b18)含有b14)所述重组载体的重组微生物；

b19)含有b11)所述核酸分子的重组细胞系；

b20)含有b12)所述表达盒的重组细胞系。

其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

上述生物材料中，b2)所述的含有编码所述抗体的核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达所述抗体的dna，该dna不但可包括启动所述抗体基因转录的启动子，还可包括终止所述抗体基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。b12)所述的含有编码所述衍生抗体的核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达所述衍生抗体的dna，该dna不但可包括启动所述衍生抗体基因转录的启动子，还可包括终止所述衍生抗体基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

可用现有的表达载体构建含有所述抗体基因表达盒的重组载体。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述生物材料中，所述重组载体可为p-11f11-h1、p-24f2-h1、p-11f11-l1、p-24f2-l1、p-24f2-l2或p-24f2-l3。

p-11f11-h1为将igγ1表达载体的agei和sali识别序列间的dna片段替换为序列7所示的dna分子得到的重组载体。p-11f11-h1能表达序列1所示的重链11f11-h1。

p-24f2-h1为将igγ1表达载体的agei和sali识别序列间的dna片段替换为序列8所示的dna分子得到的重组载体。p-24f2-h1能表达序列2所示的重链24f2-h1。

p-11f11-l1为将igλ表达载体的agei和xhoi识别序列间的dna片段替换为序列9所示的dna分子得到的重组载体。p-11f11-l1能表达序列3所示的轻链11f11-l1。

p-24f2-l1为将igλ表达载体载体的agei和xhoi识别序列间的dna片段替换为序列10所示的dna分子得到的重组载体。p-24f2-l1能表达序列4所示的轻链24f2-l1。

p-24f2-l2为将igλ表达载体载体的agei和xhoi识别序列间的dna片段替换为序列11所示的dna分子得到的重组载体。p-24f2-l2能表达序列5所示的轻链24f2-l2。

p-24f2-l3为将igλ表达载体载体的agei和xhoi识别序列间的dna片段替换为序列12所示的dna分子得到的重组载体。p-24f2-l3能表达序列6所示的轻链24f2-l3。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。所述重组细胞可为

上述生物材料中，所述转基因细胞系非繁殖材料。b9)所述含有b1)所述核酸分子的细胞系或b10)所述含有b2)所述表达盒的重组细胞系可为如下八个重组细胞系中的任一种：将p-11f11-h1和p-11f11-l1导入293t细胞中得到的重组细胞系，将p-11f11-h1和p-24f2-l1导入293t细胞中得到的重组细胞系，将p-11f11-h1和p-24f2-l2导入293t细胞中得到的重组细胞系，将p-11f11-h1和p-24f2-l3导入293t细胞中得到的重组细胞系，将p-24f2-h1和p-11f11-l1导入293t细胞中得到的重组细胞系，将p-24f2-h1和p-24f2-l1导入293t细胞中得到的重组细胞系，将p-24f2-h1和p-24f2-l2导入293t细胞中得到的重组细胞系，将p-24f2-h1和p-24f2-l3导入293t细胞中得到的重组细胞系。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的b1)所述抗体或b11)所述衍生抗体的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的b1)所述抗体或b11)所述衍生抗体的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码b1)所述抗体或b11)所述衍生抗体且具有所述抗体或所述衍生抗体活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码seqidno.1和/或seqidno.2和/或seqidno.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为75％、80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，所述抗体中所述vh的cdr1的编码序列如序列表中序列7的第79-99位所示；

所述抗体中所述vh的cdr2的编码序列如序列表中序列7的第154-174位所示；

所述抗体中所述vh的cdr3的编码序列如序列表中序列7的第292-342位所示；

所述抗体中所述vl的cdr1的编码序列为下述h1)或h2)：

h1)序列9的第79-102位；

h4)序列12的第79-102位；

所述抗体中所述vl的cdr2的编码序列为下述i1)或i2)：

i1)序列9的第157-162位；

i4)序列12的第157-162位；

所述抗体中所述vl的cdr3的编码序列为下述j1)-j4)中的任一种：

j1)序列9的第274-303位；

j2)序列10的第274-306位；

j3)序列11的第274-303位；

j4)序列12的第274-300位。

上述生物材料中，所述抗体中所述vh的编码序列如序列表中序列7或序列8所示；

所述抗体中所述vl的编码序列如序列表中序列9、序列10、序列11或序列12所示。

为解决上述技术问题，本发明还提供了诊断和/或治疗和/或预防中东呼吸综合征冠状病毒所致疾病的产品，所述产品的活性成分为所述抗体、所述衍生抗体或所述生物材料。

上述诊断和/或治疗和/或预防中东呼吸综合征冠状病毒所致疾病的产品可为药物，其可仅以所述抗体、所述衍生抗体或所述生物材料为活性成分，还可以所述抗体、所述衍生抗体或所述生物材料与其他具有诊断和/或治疗和/或预防中东呼吸综合征冠状病毒所致疾病活性的物质的组合在一起作为活性成分。

为解决上述技术问题，本发明还提供了诊断和/或治疗和/或预防中东呼吸综合征冠状病毒的产品，所述产品的活性成分为所述抗体、所述衍生抗体或所述生物材料。

上述诊断和/或治疗和/或预防中东呼吸综合征冠状病毒的产品可为药物，其可仅以所述抗体、所述衍生抗体或所述生物材料为活性成分，还可以所述抗体、所述衍生抗体或所述生物材料与其他具有诊断和/或治疗和/或预防中东呼吸综合征冠状病毒活性的物质的组合在一起作为活性成分。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述抗体、所述衍生抗体、所述生物材料或所述产品的下述任一应用：

x1、在制备诊断中东呼吸综合征冠状病毒感染的试剂、治疗中东呼吸综合征冠状病毒感染的药物或预防中东呼吸综合征冠状病毒感染的疫苗中的应用；

x2、在制备诊断中东呼吸综合征冠状病毒所致疾病的试剂、治疗中东呼吸综合征冠状病毒所致疾病的药物或预防中东呼吸综合征冠状病毒所致疾病的疫苗中的应用；

x3、在制备诊断中东呼吸综合征冠状病毒的试剂、治疗中东呼吸综合征冠状病毒的药物或预防中东呼吸综合征冠状病毒的疫苗中的应用；

x4、在诊断和/或治疗和/或预防中东呼吸综合征冠状病毒感染中的应用；

x5、在诊断和/或治疗和/或预防中东呼吸综合征冠状病毒所致疾病中的应用；

x6、在诊断和/或治疗和/或预防中东呼吸综合征冠状病毒中的应用；

x7、在制备中和中东呼吸综合征冠状病毒药物或制剂中的应用。

本发明的全人源化抗mers-cov中和抗体11f11-1、11f11-2、11f11-3、11f11-4、24f2-1、24f2-2、24f2-3和24f2-4,能识别并结合mers-covs蛋白，能够mers-cov阻止mers-cov侵染易感细胞。其中11f1-1、24f2-2结合s蛋白的半数有效浓度(ec50)分别为1240ng/ml和4.888ng/ml；对100tcid50的mers-cov假病毒半数抑制浓度(ic50)分别为20μg/ml和12.26ng/ml。本发明的全人源化抗mers-cov中和抗体，在诊断和/或治疗和/或预防中东呼吸综合征冠状病毒中具有应用价值。

附图说明

图1为11f11-1、11f11-2、11f11-3、11f11-4、24f2-1、24f2-2、24f2-3和24f2-4结合mers-covs蛋白。

图2为11f11-1、11f11-2、11f11-3、11f11-4、24f2-1、24f2-2、24f2-3和24f2-4对mers-cov假病毒的具有中和作用。

图3为11f11-1和24f2-2结合s蛋白的半数有效浓度(ec50)。

图4为11f11-1和24f2-2对100tcid50的mers-cov假病毒半数抑制浓度(ic50)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、抗体的制备

本实施例提供了8个全人源化抗中东呼吸综合征冠状病毒(middleeastrespiratorysydromecoronavirus,mers-cov)中和抗体，其名称分别为11f11-1、11f11-2、11f11-3、11f11-4、24f2-1、24f2-2、24f2-3和24f2-4，这8个抗体均由重链和轻链组成，轻链由可变区vl和恒定区cl组成，重链由可变区vh和恒定区ch组成，vh和vl均由决定簇互补区和框架区组成，决定簇互补区由cdr1、cdr2和cdr3组成。

11f11-1、11f11-2、11f11-3和11f11-4的重链相同，其名称为11f11-h1。11f11-h1的氨基酸序列如序列表中序列1所示，序列1由434个氨基酸残基组成，第1-125位为11f11-h1的vh(将其命名为11f11-vh1)的氨基酸序列，第26-33位为11f11-vh1的cdr1的氨基酸序列，第51-58位为11f11-vh1的cdr2的氨基酸序列，第97-114位为11f11-vh1的cdr3的氨基酸序列。11f11-vh1可由序列7所示的dna分子编码。

11f11-1、11f11-2、11f11-3和11f11-4的轻链不同，分别为11f11-l1、24f2-l1、24f2-l2和24f2-l3。11f11-l1的氨基酸序列如序列表中序列3所示，序列3由192个氨基酸残基组成，第1-111位为11f11-l1的vhvl(将其命名为11f11-vl1)的氨基酸序列，第26-34位为11f11-vl1的cdr1的氨基酸序列，第52-54位为11f11-vl1的cdr2的氨基酸序列，第91-101位为11f11-vl1的cdr3的氨基酸序列。11f11-vl1可由序列9所示的dna分子编码。24f2-l1的氨基酸序列如序列表中序列4所示，序列4由193个氨基酸残基组成，第1-112位为24f2-l1的vl(将其命名为24f2-vl1)的氨基酸序列，第26-34位为24f2-vl1的cdr1的氨基酸序列，第52-54位为24f2-vl1的cdr2的氨基酸序列，第91-102位为24f2-vl1的cdr3的氨基酸序列。24f2-vl1可由序列10所示的dna分子编码。24f2-l2的氨基酸序列如序列表中序列5所示，序列5由192个氨基酸残基组成，第1-111位为24f2-l2的vl(将其命名为24f2-vl2)的氨基酸序列，第26-34位为24f2-vl2的cdr1的氨基酸序列，第52-54位为24f2-vl2的cdr2的氨基酸序列，第91-101位为24f2-vl2的cdr3的氨基酸序列。24f2-vl2可由序列11所示的dna分子编码。24f2-l3的氨基酸序列如序列表中序列6所示，序列6由191个氨基酸残基组成，第1-110位为24f2-l3的vl(将其命名为24f2-vl3)的氨基酸序列，第26-34位为24f2-vl3的cdr1的氨基酸序列，第52-54位为24f2-vl3的cdr2的氨基酸序列，第91-100位为24f2-vl2的cdr3的氨基酸序列。24f2-vl3可由序列12所示的dna分子编码。11f11-vl1、24f2-vl1与24f2-vl2的cdr1的氨基酸均相同，11f11-vl1、24f2-vl1与24f2-vl2的cdr2的氨基酸也均相同。

24f2-1、24f2-2、24f2-3和24f2-4的重链相同，其名称为24f2-h1。24f2-h1的氨基酸序列如序列表中序列2所示，序列2由434个氨基酸残基组成，第1-125位为24f2-h1的vh(将其命名为24f2-vh1)的氨基酸序列，第26-33位为24f2-vh1的cdr1的氨基酸序列，第51-58位为24f2-vh1的cdr2的氨基酸序列，第97-114位为24f2-vh1的cdr3的氨基酸序列。24f2-vh1可由序列8所示的dna分子编码。24f2-vh1与11f11-vh1的cdr1、cdr2和cdr3均相同。

各抗体的组成及决定簇互补区如表1与表2所示。

表1、8种抗体重/轻链组成

表2、抗体可变区序列及特点

1、重组载体的制备

将igγ1表达载体(efficientgenerationofmonoclonalantibodiesfromsinglehumanbcellsbysinglecellrt-pcrandexpressionvectorcloning.thomastetal.,.jimmunolmethods.2008；329(1-2):112–124.)的agei和sali识别序列间的dna片段替换为序列7所示的dna分子，其他序列均不变，得到重组载体，将其命名为p-11f11-h1。p-11f11-h1能表达序列1所示的11f11-h1。

将igγ1表达载体的agei和sali识别序列间的dna片段替换为序列8所示的dna分子，其他序列均不变，得到重组载体，将其命名为p-24f2-h1。p-24f2-h1能表达序列2所示的24f2-h1。

将igλ表达载体(efficientgenerationofmonoclonalantibodiesfromsinglehumanbcellsbysinglecellrt-pcrandexpressionvectorcloning.thomastetal.,.jimmunolmethods.2008；329(1-2):112–124)的agei和xhoi识别序列间的dna片段替换为序列9所示的dna分子，其他序列均不变，得到重组载体，将其命名为p-11f11-l1。p-11f11-l1能表达序列3所示的11f11-l1。

将igλ表达载体载体的agei和xhoi识别序列间的dna片段替换为序列10所示的dna分子，其他序列均不变，得到重组载体，将其命名为p-24f2-l1。p-24f2-l1能表达序列4所示的24f2-l1。

将igλ表达载体载体的agei和xhoi识别序列间的dna片段替换为序列11所示的dna分子，其他序列均不变，得到重组载体，将其命名为p-24f2-l2。p-24f2-l2能表达序列5所示的24f2-l2。

将igλ表达载体载体的agei和xhoi识别序列间的dna片段替换为序列12所示的dna分子，其他序列均不变，得到重组载体，将其命名为p-24f2-l3。p-24f2-l3能表达序列6所示的24f2-l3。

2、抗体悬液及纯化抗体igg制备

2.1细胞的准备

从培养箱中取出培养于10％fbsdmem培养基内的对数增长期的293t单层细胞(atcc,crl-11268)，倒去细胞培养上清，用磷酸盐缓冲液(pbs)洗一遍，加入0.25％的胰酶1ml，轻轻晃动使其铺匀至细胞培养碟，倒掉胰酶，然后放入孵箱内1min左右，得到预处理的293t细胞，用含10％fbs的dmem培养基终止胰酶作用，并计数。向t75细胞培养瓶内加入预处理的293t细胞6×10⁶个，将培养瓶置于37℃，5％co2条件下培养过夜，得到混合细胞悬液。

2.2瞬时转染制备抗体液

将9μg的步骤1的p-11f11-h1和9μg的步骤1的p-11f11-l1加入到500μl无抗生素无血清的dmem培养基中，室温放置5min，加入转染试剂fugenehd(roche,04709705001)72μl，室温放置20min，得到载体混合液。然后将载体混合液加入到步骤2.1的混合细胞悬液中(将载体混合液与上述混合细胞悬液混合时记为转染第0时，将当天记为转染第0天)，置于37℃,5％co2条件下培养，在转染第48～72h时中补加含10％fbs的dmem培养液至50ml，继续培养，在转染第7天收集细胞上清液。

2.3抗体纯化

将步骤2.2的细胞上清液于1500r/min下离心4min去沉淀，然后用0.45μm滤器过滤，收集滤液并以1～2滴/秒的速度流过蛋白a纯化柱(hitrapproteinahp,ge,170403-03)，使滤液中的igg结合至蛋白a上。用pbs以5000g离心1min洗涤纯化柱2～3次，弃液，向纯化柱中加入400μligg洗脱液(igg洗脱液为向水中加入甘氨酸并用hcl调节ph得到的甘氨酸浓度为0.1m、ph为2.7的溶液)轻轻混合后，将柱子放进已加入40μlph9.01mtris-盐酸中和液(该中和液为向水中加入tris并用hcl调节ph得到的tris浓度为1m、ph为9.0的溶液)的1.5ml离心管中5000g离心1min，所得液体即为纯化的单克隆抗体11f11-1溶液(简称为11f11-1溶液)，11f11-1溶液中抗体的浓度为1.2mg/ml。

按照上述步骤2.2和2.3的方法，将p-11f11-l1替换为p-24f2-l1，其他步骤均不变，得到纯化后的单克隆抗体11f11-2的溶液(简称为11f11-2溶液)，11f11-2溶液中抗体的浓度为1mg/ml。

按照上述步骤2.2和2.3的方法，将p-11f11-l1替换为p-24f2-l2，其他步骤均不变，得到纯化后的单克隆抗体11f11-3的溶液(简称为11f11-3溶液)，11f11-3溶液中抗体的浓度为1.008mg/ml。

按照上述步骤2.2和2.3的方法，将p-11f11-l1替换为p-24f2-l3，其他步骤均不变，得到纯化后的单克隆抗体11f11-4的溶液(简称为11f11-4溶液)，11f11-4溶液中抗体的浓度为1.3mg/ml。

按照上述步骤2.2和2.3的方法，将p-11f11-h1替换为p-24f2-h1，其他步骤均不变，得到纯化后的单克隆抗体24f2-1的溶液(简称为24f2-1溶液)，24f2-1溶液中抗体的浓度为1.67mg/ml。

按照上述步骤2.2和2.3的方法，将p-11f11-h1替换为p-24f2-h1，并将p-11f11-l1替换为p-24f2-l1，其他步骤均不变，得到纯化后的单克隆抗体24f2-2的溶液(简称为24f2-2溶液)，24f2-2溶液中抗体的浓度为5.2mg/ml。

按照上述步骤2.2和2.3的方法，将p-11f11-h1替换为p-24f2-h1，并将p-11f11-l1替换为p-24f2-l2，其他步骤均不变，得到纯化后的单克隆抗体24f2-3的溶液(简称为24f2-3溶液)，24f2-3溶液中抗体的浓度为1.41mg/ml。

按照上述步骤2.2和2.3的方法，将p-11f11-h1替换为p-24f2-h1，并将p-11f11-l1替换为p-24f2-l3，其他步骤均不变，得到纯化后的单克隆抗体24f2-4的溶液(简称为24f2-4溶液)，24f2-4溶液中抗体的浓度为1.426mg/ml。

2.4对照液体的制备

向u型底96孔板中加入无抗生素无血清的dmem培养基50μl/孔，分别加入携带重链基因的质粒和或携带轻链基因的质粒各(步骤1的p-11f11-h1、p-24f2-h1、p-11f11-l1、p-24f2-l1、p-24f2-l2或p-24f2-l3)0.05μg，同时设只含携带重链基因的质粒和只含携带轻链基因的质粒以及不含dna的空白孔作为对照，然后加入转染试剂fugenehd0.4μl/孔，室温放置20min,再加入293t细胞6×10⁴/孔，将96孔板置于37℃,5％co2条件下培养48h，收集细胞上清，即得到只含有11f11-h1、24f2-h1、11f11-l1、24f2-l1、24f2-l2或24f2-l3的溶液。同时设不含dna的空白孔作为空白对照。

实施例2、实施例1的8个抗体可以与mers-covs蛋白结合

1、实施例1的8个抗体可以与mers-covs蛋白结合

分别测定实施例1得到的8个抗体(即11f11-1、11f11-2、11f11-3、11f11-4、24f2-1、24f2-2、24f2-3和24f2-4)与mers-covs蛋白的结合情况，用具有中和活性抗流感病毒h7亚型特异性抗体h7(北京义翘神州生物技术有限公司)以及实施例1的只含有11f11-h1、24f2-h1、11f11-l1、24f2-l1、24f2-l2和24f2-l3的溶液作为阴性对照，用实施例1的空白对照作为空白对照对照，用mers-cov感染恢复期血清1:300稀释后作为阳性对照，实验重复三次。具体步骤如下：

包被mers-covs蛋白(北京义翘神州生物技术有限公司)于elisa板，1μg/ml，每个样品2复孔，每孔100μl，4℃过夜；pbst洗板，3次；1％bsa封闭，每孔200μl，37℃，2h；pbst洗板，3次，每孔加入一种抗体悬液(11f11-1、11f11-2、11f11-3、11f11-4、24f2-1、24f2-2、24f2-3或24f2-4溶液)或一种对照液体100μl，37℃，1h；pbst洗板，3次；加入hrp标记羊抗人igg(fcspecific，1mg/ml)，1:10000稀释，每孔100μl，37℃，1h，pbst洗板，3次，加入tmb显色液100μl，避光反应，加入2mh2so4水溶液，每孔50μl；检测450nm下的od值(od450)，结果如图1与表3所示。

表3、8个抗体与mers-covs蛋白的结合作用

结果显示，单独轻链对照均不能结合s蛋白也无中和活性，而单独重链11f11-vh1对照虽不能结合s蛋白，同轻链(11f1-vl1、24f2-vl1、24f2-vl2、24f2-vl3)组合时，同s蛋白结合增强；单独重链24f2-vh2即能结合s蛋白，同轻链(11f1-vl1、24f2-vl1、24f2-vl2、24f2-vl3)组合时，同s蛋白结合强度增强。而对照抗流感病毒h7单抗同s蛋白不结合。本发明的全人源化抗mers-cov中和抗体11f11-1、11f11-2、11f11-3、11f11-4、24f2-1、24f2-2、24f2-3和24f2-4,能识别并结合mers-covs蛋白。

2、11f11-1和24f2-2结合s蛋白的半数有效浓度(ec50)

实验重复三次：

将实施例1的11f11-1溶液用pbs稀释得到11f11-1浓度分别为10000、1000、500、100、80、50、30、10、5、3、1和0ng/ml的11f11-1溶液；将实施例1的24f2-2溶液用pbs稀释得到24f2-2浓度分别为10000、1000、500、100、80、50、30、10、5、3、1和0ng/ml的24f2-2溶液；将具有中和活性抗流感病毒h7亚型特异性抗体h7(北京义翘神州生物技术有限公司)用pbs稀释得到h7浓度分别为10000、1000、500、100、80、50、30、10、5、3、1和0ng/ml的h7溶液，作为对照。

按照步骤1的方法，将“每孔加入一种抗体悬液(11f11-1、11f11-2、11f11-3、11f11-4、24f2-1、24f2-2、24f2-3或24f2-4溶液)或一种对照液体100μl”替换为“每孔加入上述的一种浓度的抗体溶液(11f11-1溶液、24f2-2溶液或h7溶液，每孔一种抗体)100μl”，其他步骤均不变，检测od450(图3与表4)，以graphpadprism5.0软件分析计算ec50。

表4、11f11-1和24f2-2结合s蛋白的od450值((平均值±标准差)

结果显示，11f1-1与24f2-2结合s蛋白的半数有效浓度(ec50)分别为1240ng/ml和4.888ng/ml。

实施例3、抗体中和活性检测

分别测定实施例1得到的8个抗体(11f11-1、11f11-2、11f11-3、11f11-4、24f2-1、24f2-2、24f2-3和24f2-4)对mers-cov假病毒的中和活性，用具有中和活性抗流感病毒h7亚型特异性抗体h7(北京义翘神州生物技术有限公司)作为对照，实验重复两次。具体步骤如下：

3.1mers-cov假病毒(mers-covpps)制备及感染滴度测定

将包装质粒pnl4-3.luc.r-e(nihaidsresearch&referencereagent,3418)与表达mers-covs蛋白的质粒pvrc-sy质粒(hcovnl63n蛋白不同片段的表达纯化及血清学检测应用分析.病毒学报，2011；27(3)244-249.)以4:1混合，加入转染试剂(polyfect,qiagen,p2010-1)，充分混合，室温放置15分钟，使之形成dna-转染试剂复合物，然后对293ft细胞(atcc,cbp60438)进行转染，转染后的细胞于37℃5％二氧化碳孵箱培养10个小时，换10％fbsdmem继续培养，48小时后收取上清，2500rpm离心5分钟，去掉细胞残渣，上清即为含有mers-covpps的液体，分装后于-70℃冻存。

取冻存的mers-covpps用无血清dmem按1：10稀释，然后以5倍比连续稀释5个滴度。将前一天接种huh7.5细胞(atcc,cbp60202)的96孔培养板以无血清dmem洗两次，以每孔100μl加入到细胞表面，每个滴度做8个复孔，设阴性对照8个复孔。37℃孵育18小时后换液，48小时后每孔加入70μlbrightglo荧光素酶检测试剂(promega)，用glomax96微孔板发光检测计读数，读值以大于阴性孔读值的2.5倍为阳性，根reed-much公式计算tcid50。

3.2mers-covpps中和实验

3.2.1

取实施例1的11f11-1溶液50μl与50μl含100个tcid50的mers-covpps混合，37℃孵育1小时后，加入到huh7.5细胞(atcc,cbp60202)表面，37℃孵育18小时后换液，48小时后每孔加入70μlbrightglo荧光素酶检测试剂，用glomax96微孔板发光检测，检测荧光素酶活性(relativeluminescenceunits，rlu)。用h7以及实施例1的只含有11f11-h1、24f2-h1、11f11-l1、24f2-l1、24f2-l2和24f2-l3的溶液作为对照。

按照上述方法，将11f11-1溶液分别替换为11f11-2溶液、11f11-3溶液、11f11-4溶液、24f2-1溶液、24f2-2溶液、24f2-3溶液和24f2-4溶液，其他步骤均不变，检测各抗体对mers-covpps的中和作用。

结果如图2和表5所示。

表5、8个抗体对mers-covpps的中和作用

结果显示，实施例1得到的8个抗体(11f11-1、11f11-2、11f11-3、11f11-4、24f2-1、24f2-2、24f2-3和24f2-4)对mers-cov假病毒均具有中和活性。

3.2.2

将实施例1的11f11-1溶液用pbs稀释得到11f11-1浓度分别为10000、2500、625、156.25、39.063、9.766、2.441和0ng/ml的11f11-1溶液；将实施例1的24f2-2溶液用pbs稀释得到24f2-2浓度分别为10000、2500、625、156.25、39.063、9.766、2.441和0ng/ml的24f2-2溶液；将h7用pbs稀释得到h7浓度分别为10000、2500、625、156.25、39.063、9.766、2.441和0ng/ml的h7溶液，作为阴性对照。

按照步骤3.2.1中的方法，将11f11-1溶液分别替换为上述不同浓度的11f11-1溶液和不同浓度的24f2-2溶液，其他步骤均不变，检测11f11-1与24f2-2对mers-covpps的中和效率。用不同浓度的h7溶液作为对照。用pbs作为空白对照。

中和活性用以下公式进行计算：中和效率(neutralisationrate)nr＝(rlu1-rlu2)/rlu1×100％

其中，pps空白对照孔的荧光素酶平均读值为rlu1，待测抗体与pps孵育所得的荧光素酶读值为rlu2。以graphpadprism5.0软件分析计算ic50。

中和实验表现类似s结合实验，即单独轻链对照均不能抑制假病毒侵入易感细胞huh7.5，单独重链24f2-vh2能部分中和假病毒感染，同轻链(11f1-vl1、24f2-vl1、24f2-vl2、24f2-vl3)组合时，中和活性明显增加。11f1-1和24f2-2对100tcid50的mers-cov假病毒半数抑制浓度(ic50)分别为20μg/ml和12.26ng/ml(图4)，h7对mers-cov假病毒无中和作用。