一种嵌合抗原受体T细胞及其制备方法与应用与流程

文档序号：12411484阅读：562来源：国知局

本发明涉及一种嵌合抗原受体T细胞及其制备方法与应用。

背景技术：

嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T cells，CART)是通过基因修饰的手段，使能特异性识别靶抗原的单克隆抗体的单链可变区

(scFv)表达在T细胞表面，同时scFv通过跨膜区与人工设计的T细胞胞内的活化增殖信号域相耦连。这样，单克隆抗体对靶抗原的特异性识别与T细胞的功能相结合，产生特异性的杀伤作用，而且CART能够以非MHC限制性的方式杀伤靶细胞。现CAR-T淋巴细胞技术已发展到了第三代。1989年，科学家Zelig Eshhar提出了CART的构想，在随后的CART技术发展中，主要经过了3代的演化，第一代CAR由识别肿瘤表面抗原的单链抗体(scFv)抗原结合部和免疫受体酪氨酸活化基序构成，胞外通过单链抗体(scFv)识别肿瘤标志分子，如CD19，胞内利用CD3分子ζ链传递信号，由于没有协同刺激信号，T细胞增殖时间短，细胞因子分泌低，在临床试验中，效果不理想。2011年，Carl June教授利用二代CART技术治疗3例慢性淋巴细胞性白血病取得了非常好的效果，2例完全缓解，1例部分缓解；二代CART技术根据选用的协同刺激分子不同分为两类，一种为协同刺激分子CD28+CD3ζ，一种为协同刺激分子4-1BB+CD3ζ，即引入了共刺激的信号序列，可提高T细胞的细胞独活性、增殖性与存活时间、促进细胞因子的释放，这两类CART在临床治疗急性淋巴细胞性白血病时都取得了成功。CD28协同刺激信号促使T细胞快速扩增，4-1BB信号促使T细胞扩增、存活、持续存活时间更长，结合CD28和4-1BB两个分子在一个CAR分子结构上的CART，称为三代CART，即同时在胞浆区串联排列了CD28、4-1BB协同刺激分子和CD3ζ分子，基本模拟了T细胞正常发挥作用时受到的刺激信号，和二代载体相比，引入了双共刺激的信号序列将具有更好的效果。

CART是近两年取得显著进展的治疗肿瘤的技术，该技术首先在治疗以CD19为靶点的急性淋巴细胞性白血病和淋巴瘤上取得了成功，据诺华公司报道的临床数据，利用CD19CART治疗儿童B细胞性急性淋巴细胞性白血病，可达到93％的完全缓解率。目前，在临床广泛应用中，用于治疗白血病和淋巴瘤的CART载体结构设计皆为二代载体的结构。尽管临床治疗中尤其是用于治疗白血病时取得了非常好的效果，但是这些患者的入组条件较为严苛，对于病情非常严重的患者仍不能入组治疗；另外，针对CD19的CART治疗淋巴瘤时的完全缓解率约为30％-47％，仍存在继续改进提高的空间。因此，亟待进一步增加CAR分子结构胞浆区内协同刺激分子的数量，以能更好模拟T细胞在生理和病理情况下自然活化的机制，促使细胞扩增，杀伤肿瘤细胞，延长体内持续存活时间，提高CD19CART治疗效果。

技术实现要素：

本发明的目的是通过以下技术方案实现的，一种嵌合抗原受体T细胞，表面表达嵌合抗原受体CD19CAR基因，其碱基序列如SEQ ID NO:3所示。

进一步，所述嵌合抗原受体CD19CAR基因是由合成ScFV基因和合成3代CAR结构基因通过重叠PCR进行拼接。

进一步，所述合成ScFV基因是通过PCR方法获得编码CD8信号肽、序列号CAA74659.1的重链氨基酸密码子优化为核苷酸、(G4S)₃铰链区和序列号为

CAA74660.1的轻链氨基酸密码子优化为核苷酸序列的CD19单链抗体的ScFV基因的核苷酸片段，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步，所述合成3代CAR结构基因是通过PCR方法获得编码CD8铰链区、CD28跨膜区、胞浆区、4-1BB胞浆区和CD3ζ胞浆区的核苷酸片段的CAR结构基因的核苷酸片段，其碱基序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明进一步的目的是通过以下技术方案实现的，一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括以下步骤：

(1)构建3代慢病毒CAR载体：首先将合成ScFV基因或合成3代CAR结构基因分别扩增PCR，得到合成ScFV基因片段的PCR产物和合成3代CAR结构基因片段的PCR产物；然后进行重叠PCR将这两个基因片段的PCR产物连接在一起，得到3代CAR结构的CD19CAR基因；最后通过Pre-Lenti-EF1-MCS载体对CD19CAR基因酶切，连接，转化，挑克隆，提质粒，测序，得到序列正确的表达CD19CAR的慢病毒载体Pre-Lenti-EF1-CD19CAR；

(2)包装CD19CAR慢病毒，感染T细胞，制备得到CART。

进一步，步骤(1)中，用于所述扩增PCR的引物为EcoRI-up序列如SEQ ID NO:4所示和BamHI-down序列如SEQ ID NO:5所示。

进一步，步骤(1)中，用于所述重叠PCR的引物为Middle-R如SEQ ID NO:6所示和Middle-F如SEQ ID NO:7所示。

进一步，步骤(1)中，测序引物为Pre-up-Seq，如SEQ ID NO:8所示和Pre-down-Seq，如SEQ ID NO:9所示。

进一步，步骤(1)中，步骤(1)中，所述双酶选自EcoRI-HF限制性内切酶和BamHI-HF限制性内切酶。

本发明进一步的目的是通过以下技术方案实现的，一种嵌合抗原受体T细胞在制备抗白血病和淋巴瘤药物中的应用。

本发明在3代CD19CAR载体的结构中加入了两种协同刺激信号，构建了慢病毒载体，并在细胞和动物实验中观察了三代CD19CART的效果，证实了三代CD19CART能够有效杀死肿瘤细胞。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：

图1为CART载体设计的演化。

图2为CD19CAR慢病毒载体构建流程图

图3为ScFV基因和3代CAR结构基因PCR产物电泳图。其中，左边为ScFV基因，中间为Marker(1000，2000，3000，4000，5000，6000，8000，10000bp)，右边为3代CAR结构基因。

图4为重叠PCR产物电泳图。其中，左边为Marker(1000，2000，3000，4000，5000，6000，8000，10000bp)，右边为CD19CAR基因(1728bp)。

图5为CD19-CART的杀伤效果。

图6为注射Raji淋巴瘤细胞后分别注射Control或CD19CART两周后的小鼠肝脏表现。

图7为小鼠生存曲线。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

实施例1：Pre-Lenti-EF1-CD19CAR载体构建

1、合成ScFV基因：通过PCR方法获得编码CD8信号肽、序列号CAA74659.1的重链氨基酸密码子优化为核苷酸、(G4S)₃铰链区和序列号为CAA74660.1的轻链氨基酸密码子优化为核苷酸序列的CD19单链抗体的ScFV基因的核苷酸片段，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。

2、合成3代CAR结构基因，通过PCR方法获得编码CD8铰链区、CD28跨膜区、胞浆区、4-1BB胞浆区和CD3ζ胞浆区的核苷酸片段的CAR结构基因的核苷酸片段，其碱基序列如SEQ ID NO:2所示。

3、将合成ScFV基因和3代CAR结构基因通过重叠PCR进行拼接，得到CD19CAR基因，如SEQ ID NO:3所示。具体过程如下：

(1)引物设计：使用序列分析软件pDRAW32分析CD19CAR基因序列，单酶切位点EcoRI、BamHI适合用于基因克隆，能够和Pre-Lenti-EF1-MCS载体的MCS(多克隆位点)匹配，设计两端引物如下：

EcoRI-up序列：CGGAATTC GCCACCATGGCCTTACCAGTGACCGC，如SEQ ID NO:4所示；

BamHI-down序列：CGGGATCC TTAGCGAGGGGGCAGGGCCTG，如SEQ ID NO:5所示。用于重叠PCR的引物为：

Middle-R，GTCGTGGTGGGCTTCGCTGGTGAGGAGACGGTGACTGAGG，如SEQ ID NO:6所示。

Middle-F，CCTCAGTCACCGTCTCCTCACCAGCGAAGCCCACCACGAC，如SEQ ID NO:7所示。

(2)PCR重叠延伸：收到合成的基因和引物后，进行PCR重叠延伸。

PCR体系如下(使用Toyobo的KOD Fx酶)：

PCR反应程序为：

PCR产物电泳：见图3，对PCR产物进行凝胶电泳，胶回收(Biomiga，货号：DC-3511-01)，定量PCR片段浓度后，进行重叠PCR。

PCR体系见下：

PCR程序为：

PCR产物电泳：见图4，PCR产物凝胶电泳，胶回收，进行后续克隆实验。

(3)酶切：

酶切反应体系如下：

(4)回收酶切后产物：Biomiga胶回收试剂盒(货号：DC-3511-01)。

(5)连接反应：

根据载体nmole数：片段nmole数＝1：3，即

配制连接体系：

上述内容各组分加至1.5mL离心管中，充分混匀；22℃水浴30min；

(5)转化，涂氨苄平板：冰上将上述连接产物加入50μL感受态中，轻弹，静置20min；42℃水浴热激90秒；冰上5min；加500μL LB，37℃复苏1h；4000rpm离心5min，留适量上清液，加样枪重悬，涂氨苄抗性平板；37℃温箱过夜。10、挑克隆，摇菌：连接反应时设置一不加连接片段的阴性对照，第二日观察可见加入CD19CAR片段的平板内克隆数约50个左右，明显比未加片段的克隆数(10个)多，因此判断连接成功。随机挑取6个克隆，摇菌扩增。

(6)质粒提取：Biomiga无内毒素质粒提取试剂盒(货号：PD1220-02)。

(7)测序：选取浓度较高质粒测序，引物为：

Pre-up-Seq：GGAGCCTACCTAGACTCAGC，如SEQ ID NO:8所示，

Pre-down-Seq：CAACCAGGATTTATACAAGG，如SEQ ID NO:9所示，

测序结果经比对，完全正确，得到了表达CD19CAR基因的慢病毒载体Pre-Lenti-EF1-CD19CAR，结构见图2。

实施例2：细胞杀伤实验

1、慢病毒包装

(1)293T细胞培养于37℃，5％CO₂孵箱内，培养基为DMEM/10％FBS。

(2)包装病毒前一天，胰酶消化293T细胞，1×10⁷细胞/孔种植10cm培养皿。

(3)转染细胞时，除了Pre-Lenti-EF1-MCS-CD19CAR质粒外，每种质粒还要和包装质粒psPAX2、pMD2.0G共转染。其中Pre-Lenti-EF1-MCS-CD19CAR使用5μg，psPAX2使用3.75μg，pMD2.0G使用1.25μg。转染时，将以上三种质粒的混合物加入500μl opti-MEM培养基内，在另一个微型离心管内将25μl Lipofectamine 2000试剂加入500μl opti-MEM培养基内，然后将稀释的转染试剂逐滴加入稀释的质粒上方，混匀，离心，室温静置20min，最后将质粒和转染试剂的混合物加入10cm培养皿内，轻晃、混匀，放入孵箱。

(4)细胞转染3天后，可以收获病毒，将10ml含病毒培养基转入50ml离心管内，4℃，1250rpm，5min，去除漂浮死亡的293T细胞，然后将含病毒培养基过滤，浓缩，分装，-80℃冻存，和留存部分病毒测定滴度。

2、淋巴细胞分离

(1)抽血：在无菌的条件下抽取人体的静脉血10ml。

(2)稀释：将获得的血液用相同体积的1640培养基10ml稀释。

(3)在离心管中加入10ml人淋巴细胞分离液(达科为生物工程有限公司)。

(4)用电动移液枪将血液贴壁缓慢加入离心管中。

(5)将离心管放入离心机中，以700g，22℃离心25min。

(6)离心结束后，淋巴细胞在上层血浆层和分离液之间的白膜层中。

(7)用84滴管尽量将白膜层吸到另一支离心管中(加入30ml 1640培养基)，注意不要吸到分离液。

(8)250g，22℃，10分钟。

(9)弃掉上层液体，用含IL2、灭活血清的1640培养基重悬，计数。

3、T细胞纯化

(1)淋巴细胞计数，取1x10⁷个淋巴细胞于微型离心管中。

(2)250g，22℃，10分钟。

(3)弃掉上层液体，80μL磁珠分离缓冲液重悬细胞沉淀，加入20μl的CD3MicroBeads(美天旎)。

(4)4℃冰箱中放置1小时，保证充分结合。

(5)1小时后，在微型离心管中加入1mL的磁珠分离缓冲液，250g，5℃离心10分钟。期间准备过滤柱子，将过滤柱安放在磁铁上，用500μl的缓冲液润洗(缓冲液随着重力留下)。

(6)离心后细胞弃上清，500μl的缓冲液重悬，加入柱子，缓冲液随着重力向下，细胞悬液流出后，柱子用500μl的缓冲液洗四次。

(7)将柱子从磁铁上卸掉，用1mL缓冲液将T细胞冲出，至1ml离心管。

(8)250g，5℃离心10分钟。

(9)含IL2、含灭活血清的1640培养基重悬，计数。

4、T细胞慢病毒感染

(1)纯化T计数，2×10⁶个T细胞/孔(6孔板)种植，培养过夜后，加入MOI为2的对照病毒液(空载体包装，Control)和Pre-Lenti-EF1-MCS-CD19CAR病毒液，感染过夜。

(2)感染第二天，补加1ml新鲜培养基。

(3)感染第三天，T细胞已充分活化，增殖旺盛，此时将T细胞转入25cm 2培养瓶。

(4)感染5天后，进行杀伤实验。

5、杀伤实验

计数表达CD19分子的K562细胞(K562-CD19，通过慢病毒感染的方法建立的稳定细胞系)，1×10⁴个K562-CD19细胞/孔(96孔板)；计数病毒感染的T细胞(Control病毒液感染的Control T细胞和Pre-Lenti-EF1-MCS-CD19CAR病毒液感染的CD19CAR-T细胞)，按照效靶比10:1,5:1,2.5:1的比例加入K562-CD19细胞上层，实验设计见表1。

表1.杀伤实验设计表(靶细胞：K562.CD19)

6、杀伤测量：通过测量死亡细胞释放入细胞培养上清的LDH，来确定CAR-T细胞杀死K562-CD19靶细胞的效果。

(1)操作按照Promega试剂盒说明书(CytoTox 96非放射性细胞毒性检测，货号：G1780)。

(2)步骤5中杀伤实验孵育过夜，约18h后，最大释放孔加入10×细胞裂解液。

(3)2小时后，每孔取50μl上清，再加入50μl LDH酶底物，室温静置20分钟后，酶标仪测量492nm处吸光度OD492。

(4)杀伤率计算，计算公式为

实验孔为不同效靶比得到的OD492，效应细胞自发为Control T细胞或CD19CAR-T细胞的OD492，靶细胞自发为K562-CD19最小释放，靶细胞最大为K562-CD19最大释放。计算得到的杀伤率见图5，靶细胞为K562表达CD19的细胞，效应细胞为对照(Control)T细胞和CD19-CART细胞，从图5可知，CD19-CART细胞可以特异性杀伤表达CD19的K562细胞，表明Pre-Lenti-EF1-MCS-CD19CAR-T构建成功。

实施例3：动物实验

1、小鼠品系：为NSG免疫缺陷小鼠品系(缺乏T细胞、B细胞和NK细胞功能)。2、肿瘤接种：采用Raji淋巴瘤细胞系，1x10⁶细胞/200ul PBS尾静脉注射(6只小鼠)。

3、CART注射：Raji肿瘤细胞接种2天后，尾静脉注射Control或CD19CART细胞(1x10⁷细胞/200ul PBS，一组3只小鼠)，见图6。由图6可知，对照CART不能有效抑制淋巴瘤细胞在肝脏的生长(白色斑块为淋巴瘤细胞形成的肿瘤)，CD19CART能有效抑制淋巴瘤。

4、每隔2天观察，测量小鼠体重，直至CART细胞注射2周后，对照组(Control)小鼠开始出现后肢瘫痪，陆续死亡，解剖观察，记录死亡时间，整理生存曲线，见图7。由图7可知，CD19CART明显延长了小鼠生存时间。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京普瑞金科技有限公司

<120> 一种嵌合抗原受体T细胞及其制备方法与应用

<130> 2016

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 789

<212> DNA

<213> ScFV基因

<400> 1

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120

accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180

ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240

tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300

caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360

ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420

ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480

ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540

cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600

tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660

gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720

cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gccaaggaac ctcagtcacc 780

gtctcctca 789

<210> 2

<211> 939

<212> DNA

<213> CAR结构基因

<400> 2

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acgagggggc tggacttcgc cccacgcaaa attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta 180

gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt 240

cccctatttc ccggaccttc taagcccttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 300

gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 360

agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 420

aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc caaacggggc 480

agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa 540

gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga 600

gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 660

aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 720

gaccctgaga tggggggaaa gccgcagaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 780

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 840

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 900

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 939

<210> 3

<211> 1728

<212> DNA

<213> CD19 CAR基因

<400> 3