一种诱导胚胎干细胞分化为角膜内皮细胞的方法及诱导培养基与流程

本发明属于组织工程及眼科领域，具体涉及一种诱导胚胎干细胞分化为角膜内皮细胞的方法及诱导培养基。

背景技术：

角膜内皮是位于角膜最内侧的单层细胞，通过其主动液泵功能维持角膜透明。人角膜内皮细胞增殖能力极为有限，受损后主要由损伤区周边细胞的扩展移行进行修复。各种原因如Fuch角膜内皮营养不良、外伤和手术等均会引起角膜内皮细胞损伤，当细胞密度低于500-1500个/mm²时即发生角膜内皮功能失代偿，导致角膜水肿浑浊，呈现大疱型角膜病变，角膜及其成分移植是这类患者重建光明的希望，但角膜供体来源匮乏严重制约了临床角膜移植手术的开展。因此，如何体外获大量且具有正常功能的人角膜内皮细胞具有重要的临床意义。

近年来，胚胎干细胞(Embryonic Stem cell,ESC)和诱导多能干细胞(induced Pluripotent Stem Cell,iPSC)领域的研究突飞猛进。作为全能/多能干细胞，它们具有无限自我更新和三胚层分化能力，理论上能够分化成为各种细胞。以往诱导方法多使用共培养或条件培养体系对胚胎干细胞或iPS细胞进行诱导分化，例如，公开号为CN 102952777的专利采用原代培养小鼠胚胎成纤维细胞3～4代作为饲养层，采用人胚胎干细胞培养基常规培养。然而饲养层共培养方法繁琐、时间艮长，而体外过程要求尽量简单快捷才能够更好的满足未来临床应用。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于一种诱导胚胎干细胞分化为角膜内皮细胞的方法及诱导培养基，使所述方法在不添加饲养层细胞的前提下能够完成诱导胚胎干细胞分化为角膜内皮细胞。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种诱导产生角膜内皮细胞的诱导培养基，以DMEM/F12培养基为基础培养基，含有以下组分：摩尔浓度为0.05～0.15mmol/L的β-巯基乙醇、摩尔浓度为0.05～0.15mmol/L谷氨酰胺、质量浓度为4～8ng/ml的bFGF、摩尔浓度为0.05～0.15mmol/L的NEAA、体积分数为18～25％的KSR和摩尔浓度为0.5～2μmol/L RA。

优选的，所述β-巯基乙醇在DMEM/F12培养基中的摩尔浓度为0.1mmol/L。

优选的，所述谷氨酰胺在DMEM/F12培养基中的摩尔浓度为0.1mmol/L。

优选的，所述bFGF在DMEM/F12培养基中的质量浓度4ng/mL。

优选的，所述NEAA在DMEM/F12培养基中的摩尔浓度为0.1mmol/L。

优选的，所述KSR在DMEM/F12培养基中的体积分数为20％。

优选的，所述RA在DMEM/F12培养基中的摩尔浓度为1μmol/L。

本发明提供一种诱导胚胎干细胞分化为角膜内皮细胞的方法，包括以下步骤：

1)将洗涤后的人胚胎干细胞用含ROCK抑制剂的mTeSR1培养基悬浮，将悬浮的人胚胎干细胞接种至预铺基质胶的培养基上进行基础培养；

2)将所述步骤1)进行基础培养的人胚胎干细胞用权利要求1或2所述的诱导培养基连续诱导培养5～6d；

3)将所述步骤2)诱导培养得到的细胞进行消化后重悬，将所述重悬后的人胚胎干细胞接种至明胶或层粘连蛋白上，将接种有人胚胎干细胞的明胶或层黏连蛋白置于无菌环境中进行分化培养，得到人角膜内皮细胞。

优选的，所述步骤1)中人胚胎干细胞在接种前进行预处理得到单细胞或小于2mm的小团块状；所述预处理的方法包括分散酶消化法或机械分割法。

优选的，所述步骤1)中洗涤用洗涤液为DMEM/F12培养基。

优选的，所述步骤1)中所述接种的密度为1.2～3.0×10³个细胞团或细胞/cm2。

优选的，所述步骤1)中所述ROCK抑制剂的摩尔浓度为8～12μmol/L；所述ROCK抑制剂的添加量为10μmol/L。

优选的，所述步骤1)中所述预铺基质胶的培养皿的制备方法具体包括以下步骤：

用DMEM/F12培养基对基质胶稀释后进行铺板；

将铺板后的培养皿置于温度为37℃、CO₂体积浓度为5％的无菌环境中放置1～2h进行凝胶；

将凝胶后的DMEM/F12培养基更换为mTeSR1培养基，得到预铺基质胶的培养基。

优选的，所述步骤1)中基础培养的时间为3-4天。

优选的，所述步骤2)中诱导培养的温度为35～38℃；

所述诱导培养的CO₂体积浓度为4～6％。

优选的，所述步骤3)中重悬用溶剂为含有ROCK抑制剂的胎牛血清体积分数为4～6％的DKSFM培养基。

优选的，所述步骤3)中预铺明胶的质量浓度为0.08～0.2％；

所述步骤3)中预铺层粘连蛋白的质量浓度为1～5μg/ml。

优选的，所述步骤3)中无菌环境的温度为35～38℃；所述无菌环境的CO2的体积浓度为4～6％。

优选的，所述步骤3)中分化培养的时间为6～8d。

本发明提供的一种诱导产生角膜内皮细胞的诱导培养基，以DMEM/F12培养基为基础培养基，含有以下组分：摩尔浓度为0.05～0.15mmol/L的β-巯基乙醇、摩尔浓度为0.05～0.15mmol/L谷氨酰胺、质量浓度为4～8ng/ml的bFGF、摩尔浓度为0.05～0.15mmol/L的NEAA、体积分数为18～25％的KSR和摩尔浓度为0.5～2μmol/L RA。所述诱导培养基在DMEM/F12培养基的基础上还含有一定浓度的β-巯基乙醇、谷氨酰胺、bFGF、NEAA、KSR和RA，通过DMEM/F12培养基和上述添加物协同作用，具体地，β-巯基乙醇、谷氨酰胺、NEAA、KSR为细胞提供营养支持作用；RA为主要的神经嵴方向诱导试剂，bFGF协同RA促使细胞向神经嵴方向分化，对人胚胎干细胞进行定向诱导，进一步分化得到的人角膜内皮细胞具有形态结构与正常人角膜内皮细胞相似的人角膜内皮细胞，表达人角膜内皮细胞重要功能蛋白，且能够长期体外培养的特点。

本发明提供的一种诱导胚胎干细胞分化为角膜内皮细胞的方法，所述方法是一套高效、简便、可行的诱导方法，诱导得到的角膜内皮细胞形态规则，特征明显。且本方法不涉及饲养层，因此可避免其它动物源性污染，生物安全性高，作为组织工程角膜内皮种子细胞，能够为临床角膜内皮移植提供合格的材料来源。

附图说明

图1为实施例1中未分化的人胚胎干细胞克隆图片；

图2为实施例1中诱导5天的人胚胎干细胞克隆图片；

图3为实施例1中人胚胎干细胞诱导分化为人角膜内皮细胞的形态图片；

图4为实施例1中分化培养3周时人角膜内皮细胞的图片；

图5为实施例4中分化细胞表达人角膜内皮重要标志Na⁺-K⁺-ATPase的免疫荧光图片；

图6为实施例4中正常的角膜内皮细胞表达Na⁺-K⁺-ATPase的免疫荧光图片；

图7为实施例4中分化细胞表达人角膜内皮重要标志ZO-1的免疫图片；

图8为实施例4中正常的角膜内皮细胞表达ZO-1的免疫荧光图片。

具体实施方式

本发明提供了一种诱导产生角膜内皮细胞的诱导培养基，以DMEM/F12培养基为基础培养基，含有以下组分：摩尔浓度为0.05～0.15mmol/L的β-巯基乙醇、摩尔浓度为0.05～0.15mmol/L谷氨酰胺、质量浓度为4～8ng/ml的bFGF、摩尔浓度为0.05～0.15mmol/L的NEAA、体积分数为18～25％的KSR和摩尔浓度为0.5～2μmol/L RA。

本发明中，所述诱导培养基是以DMEM/F12培养基为基础培养基。本发明中，所述DMEM/F12培养基优选为knockout DMEM/F12。所述knockout DMEM/F12培养基的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的来源即可。本发明实施例中knockout DMEM/F12购于Gibco公司。

本发明中，所述诱导培养基包括β-巯基乙醇。所述β-巯基乙醇在DMEM/F12培养基中的摩尔浓度优选为0.1mmol/L。所述β-巯基乙醇的来源没有特殊限制采用本领域技术人员所熟知的β-巯基乙醇即可。

本发明中，所述诱导培养基中包括谷氨酰胺。所述谷氨酰胺在DMEM/F12培养基中的摩尔浓度为0.1mmol/L。所述谷氨酰胺的来源没有特殊限制采用本领域技术人员所熟知的谷氨酰胺即可。

本发明中，所述诱导培养基中包括bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)。所述bFGF在DMEM/F12培养基中的质量浓度4ng/mL。所述bFGF的来源没有特殊限制采用本领域技术人员所熟知的bFGF即可。

本发明中，所述诱导培养基中包括NEAA(非必需氨基酸)。所述NEAA在DMEM/F12培养基中的摩尔浓度为0.1mmol/L。所述NEAA的来源没有特殊限制采用本领域技术人员所熟知的NEAA即可。

本发明中，所述诱导培养基中包括KSR(血清替代物)。所述KSR在DMEM/F12培养基中的体积分数为20％。所述KSR的来源没有特殊限制采用本领域技术人员所熟知的KSR即可。本发明实施例中KSR购于Gibco公司。

本发明中，所述诱导培养基中包括RA(维生素甲类化合物家族维甲酸)。所述RA在DMEM/F12培养基中的摩尔浓度为1μmol/L。所述RA的来源没有特殊限制采用本领域技术人员所熟知的RA即可。本发明实施例中RA购于Sigma公司。

本发明提供一种诱导胚胎干细胞分化为角膜内皮细胞的方法，包括以下步骤：

1)将洗涤后的人胚胎干细胞用含有ROCK抑制剂的mTeSR1培养基悬浮，将悬浮的人胚胎干细胞接种至预铺基质胶的培养基上进行基础培养；

2)将步骤1)基础培养得到的人胚胎干细胞用所述的诱导培养基连续诱导培养5～6d，每日更换一次诱导培养基；

3)将所述步骤2)诱导培养得到的细胞进行消化后重悬，将重悬后的人胚胎干细胞接种至预铺明胶或层粘连蛋白上，将接种有人胚胎干细胞的明胶或层黏连蛋白置于无菌环境中进行分化培养，得到人角膜内皮细胞。

本发明将洗涤后的人胚胎干细胞用含有ROCK抑制剂的mTeSR1培养基悬浮，将悬浮的人胚胎干细胞接种至预铺基质胶的培养基上进行基础培养。

本发明中，所述人胚胎干细胞在接种前优选进行预处理得到单细胞或小于2mm的小团块状；所述预处理的方法优选包括分散酶消化法或机械分割法。所述分散酶消化法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的细胞消化法即可；所述分散酶的种类优选为消化液Accutase。所述消化液Accutase的来源优选购于Sigma公司，货号A6964。所述机械分割法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的机械分割法即可。

本发明将预处理后的人胚胎干细胞优选进行洗涤。本发明中，所述洗涤用洗涤液为DMEM/F12培养基。所述洗涤的次数优选为1～3次，更优选为2次。

本发明中，所述预铺的基质胶的制备方法优选包括具体以下步骤：

用DMEM/F12培养基对基质胶稀释后进行铺板；

将铺板后的培养皿置于温度为37℃、CO2体积浓度为5％的无菌环境中放置1～2h进行凝胶；

将凝胶后的DMEM/F12培养基更换为mTeSR1培养基，得到预铺基质胶的培养基。所述mTeSR1培养基的来源优选购于Stem Cell公司。

本发明中，所述基础培养的时间为3～4天。经基础培养后人胚胎干细胞在倒置相差显微镜下达到约20～100个细胞/克隆，且克隆大小均匀。所述基础培养的目的为使干细胞克隆生长至达到诱导条件的大小。

得到基础培养的人胚胎干细胞，本发明将人胚胎干细胞接种至诱导培养基上，连续诱导培养5～6d。

本发明中，所述接种的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的接种方法即可。所述接种的密度优选为1.2～3.0×10³个细胞团或细胞/cm²；更优选为1.5～2.5×10³个细胞团或细胞/cm²；最优选为2.0×10³个细胞团或细胞/cm²。

本发明中，所述ROCK抑制剂的摩尔浓度优选为8～12μmol/L，更优选为10μmol/L。本发明对所述ROCK抑制剂的来源没有特殊限制采用本领域技术人员所熟知的ROCK抑制剂即可。本发明实施例中，所述ROCK抑制剂的来源购自Sigma公司。

本发明中，所述诱导培养的时间优选为5d。所述诱导培养的温度优选为35～38℃，更优选为37℃；所述诱导培养的CO₂体积浓度优选为4～6％，更优选为5％。

本发明中，所述诱导培养期间优选每日更换一次诱导培养基。所述更换培养基的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的更换培养基的方法即可。

待诱导培养的人胚胎干细胞在显微镜下可见人胚胎干细胞扩大并相接，本发明将所述细胞进行消化后重悬，将重悬后的人胚胎干细胞接种至预铺的明胶或层粘连蛋白上，将所述培养板置于无菌环境中进行分化培养，得到人角膜内皮细胞。

本发明中，所述消化的时机优选为诱导培养的细胞呈体积变大、细胞形态由圆形或卵圆形变为多边形，排列紧密，克隆周边细胞呈梭形纤维状时进行。

本发明中，消化的方法优选除去诱导培养基，加入2ml无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS缓冲液洗涤2遍，加入含0.25％胰酶质量浓度为0.02％的EDTA 1.5ml，去除纤维状细胞及胰酶后，剩余细胞克隆放置培养箱继续消化。

本发明中，所述重悬用溶剂为含ROCK抑制剂，胎牛血清质量浓度为4～6％的DKSFM培养基，所述DKSFM培养基的胎牛血清质量浓度更优选为5％。所述含ROCK抑制剂的胎牛血清体积分数为5％DKSFM的培养基是在DKSFM基础培养基中添加FBS和ROCK抑制剂制成的。所述FBS占总液体体积百分数为4～6％，更优选为5％；所述ROCK抑制剂的摩尔浓度优选为5～20μmol/L，更优选为10μmol/L。

本发明中，所述预铺明胶的质量浓度优选为0.08～0.2％，更优选为0.1％；所述预铺层粘连蛋白(LN)的质量浓度优选为1～5μg/ml，更优选为3μg/ml。

本发明中，所述无菌环境的温度优选为35～38℃，更优选为37℃；所述无菌环境的CO₂的体积浓度为4～6％，更优选为5％。

本发明中，所述分化培养的时间优选为6～8d，更优选为7d。

得到的角膜内皮细胞为多边形细胞，细胞间边界清晰、单层排列，结合体外光学显微镜观察、实时定量聚合酶链式反应、免疫荧光等证实分化细胞具有与正常人角膜内皮细胞相似的形态和表型，表现为细胞呈近似六边形规则排列、细胞间边界清晰，表达Na⁺-K⁺-ATPase、ZO-1等细胞标记，且培养至3周细胞无明显老化凋亡。

下面结合实施例对本发明提供的一种诱导胚胎干细胞分化为角膜内皮细胞的方法及诱导培养基进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

人胚胎干细胞的培养：取一支分装的Matrigel基质胶(购于BD公司，货号354277)，4℃冰上融化。预冷枪头、培养皿和离心管。使用冷的DMEM/F12培养基(购于Invitrogen公司，货号11330)25ml将Matrigel基质胶稀释为浓度1-2％后，以每直径60mm培养皿中加入1-2ml进行包被，待基质胶完全覆盖培养面后将培养皿移入37℃、5％CO2培养箱，1小时后更换为新鲜人胚胎干细胞培养基mTeSR1(购于Stem Cell公司，货号05850)备用。人胚胎干细胞培养至形态状态良好时(如图1所示)使用温的DMEM/F12培养基3ml洗涤2遍，每60mm培养皿中加入消化液Accutase(购于Sigma公司，货号A6964)约1-1.5ml，置于37℃、5％CO₂培养箱中消化4～7分钟，倒置相差显微镜下观察克隆边缘翘起，终止消化，小心吹打胚胎干细胞克隆并收集至锥形离心管，采用瞬时离心，去掉上清后使用新鲜mTeSR1培养基重悬人胚胎干细胞，小心轻柔吹打至细胞团块无明显沉降，计数后以1.2-3×10³个细胞团/cm²密度接种预包被的培养皿，补液至每皿总液体量3ml，传代接种当天添加10μM ROCK抑制剂，接种第二天换液时去除，每日观察换液。

所述Matrigel基质胶为预先按270-350μl分装的分支，－80℃保存备用。

所述瞬时离心是指离心达到设定转速即停止离心。

所述形态状态良好的人胚胎干细胞是指：克隆呈圆形或类圆形、边缘光滑、细胞排列紧密均质、无分化的人胚胎干细胞。

2.人胚胎干细胞的诱导分化：传代后常规培养的人胚胎干细胞培养至适宜大小即开始诱导(所述适宜大小的人胚胎干细胞克隆是指；倒置相差显微镜下约60-100个细胞/克隆，克隆大小均匀，密度适中)，使用含有RA(购于Sigma公司，货号R2625)的诱导培养基连续诱导5天，所述含有RA的诱导培养基是在knockout DMEM/F12基础培养基上添加以下物质制成：β-巯基乙醇、谷氨酰胺、bFGF、NEAA、KSR、RA。添加后，β-巯基乙醇浓度为0.1mM、谷氨酰胺浓度为0.1mM、bFGF浓度为4ng/ml、NEAA为0.1mM、KSR浓度为总液体量的20％(体积分数)、RA浓度为1μM。镜下可见人胚胎干细胞克隆扩大、相邻克隆发生融合，克隆内细胞体积变大、细胞形态由圆形或卵圆形变为多边形，排列紧密，克隆周边细胞呈梭形纤维状(如图2所示)。终止诱导，去诱导培养基，加入2ml无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS缓冲液洗涤2遍，加入0.25％胰酶-0.02％EDTA 1.5ml，去除纤维状细胞及胰酶后，剩余细胞克隆放置培养箱继续消化，待大多细胞脱落时使用含ROCK抑制剂的5％DKSFM培养基(购于Invitrogen公司，货号10744019)终止、重悬，吹打至单细胞后计数，按1.5-2.5×10⁴个细胞/cm²密度接种于提前1小时预铺0.1％明胶(所述0.1％明胶是指每100ml水中加入0.1g明胶，溶解后高压灭菌备用。)的培养皿，分化细胞置于37℃、5％CO₂培养箱培养，隔天更换含ROCK抑制剂的5％DKSFM培养基(所述含ROCK抑制剂的5％DKSFM培养基是在DKSFM基础培养基中添加FBS和ROCK抑制剂制成的。其浓度分别为总液体量的5％(体积分数)和10μM)。约1周左右细胞基本长满，倒置显微镜下可见分化细胞由多角形逐渐变为多边形，细胞间边界清晰(如图3所示)，且培养至3周细胞无明显老化凋亡(如图4所示)。

实施例4

免疫荧光检测：

1.4％多聚甲醛固定细胞15分钟；2.PBS洗涤3次；3.0.1％TritonX-100透化15分钟(膜抗原可省略此步)；4.加入5％BSA室温封闭1小时；5.加入相应一抗室温孵育2h或4℃孵育过夜；6.加入与一抗来源相对应的荧光二抗，室温孵育1h；7.DAPI染色，在荧光显微镜下拍照。细胞标志物的荧光免疫图片如图5和图6所示。图5为分化细胞表达角膜内皮细胞液泵功能标志Na⁺-K⁺-ATPase标志物的免疫荧光图片；图6为阳性对照图片，是正常的人角膜内皮细胞表达角膜内皮细胞液泵功能标志Na⁺-K⁺-ATPase标志物的免疫荧光图片；图7为分化细胞表达角膜内皮细胞结构标志紧密蛋白ZO-1标志物免疫荧光图片；图8为阳性对照图片，是正常人角膜内皮细胞角膜内皮细胞结构标志紧密蛋白ZO-1标志物免疫荧光图片。从Na⁺-K⁺-ATPase标志物和紧密蛋白ZO-1标志物的免疫荧光图片中可以看出，分化得到的细胞为人角膜内皮细胞。

由以上实施例可知，本发明提供的诱导培养基及诱导方法建立了一套高效、简便、可行的人胚胎干细胞或iPS细胞定向分化为人角膜内皮细胞的诱导方法，能够获得形态结构与正常人角膜内皮细胞相似的人角膜内皮细胞，表达人角膜内皮细胞重要功能蛋白，且能够长期体外培养，为进一步的临床应用奠定了实验基础。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。