本发明涉及一种细胞分离方法，具体为一种肠γδT细胞的分离方法
背景技术：
γδT细胞，又被称为I型T细胞，是一类表型和功能独特的T细胞亚型，它与αβT细胞共同组成CD3+T细胞。γδT细胞具有抗感染、抗肿瘤的重要作用，它还参与了微生物感染的免疫防御，此外，γδT细胞对维持黏膜免疫稳态具有重要作用。但是，长期以来，由于γδT细胞在外周血中分布极少，仅占T细胞总数的0.5％-5％，分离比较困难；而γδT细胞在肠黏膜分布广泛。
目前已有的文献报道采用处死动物后，快速取出小肠(包括空肠和回肠)组织，机械振荡及化学作用离散肠组织，铜网过滤，用40％-70％不连续Percoll梯度单次离心及先用30％Percoll离心再用40％-70％Percoll二步法离心，吸取和移出白色细胞层，分离总淋巴细胞。然后加入免疫荧光标记TCRγδ抗体标记，磁式细胞仪分选γδT细胞，流式细胞检测γδT细胞纯度。但该方法步骤较多，机械振荡及化学作用对细胞损伤大，分离总细胞数量少，γδT细胞活性低和纯度低，应用受到限制。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服现有的肠γδT细胞的分离方法需要经过机械振荡及化学作用对细胞损伤大，分离总细胞数量少的缺陷，提供一种肠γδT细胞的分离方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
一种肠γδT细胞的分离方法，包括以下步骤：
1)、收集动物的肠淋巴细胞，离心，去掉上清液，生理盐水悬浮肠淋巴细胞；
2)、用荧光标记的抗γδTCR抗体标记收集到的肠淋巴细胞，然后加入抗荧光微珠标记的抗FITC单克隆抗体，然后上磁式细胞分选仪优化分选，收集阳性选择的细胞，即得到γδT细胞。
进一步的，所述步骤1)中采用肠系膜淋巴管插管法收集动物的肠淋巴细胞。
进一步的，所述步骤2)中采用异硫氰酸荧光素交联的抗γδTCR单克隆抗体标记收集到的肠淋巴细胞，每1×108个肠淋巴细胞加100μl异硫氰酸荧光素交联的抗γδTCR单克隆抗体，4℃孵育30分钟，用缓冲液洗2次。
进一步的，所述步骤2)中每1×108个肠淋巴细胞加100μl抗荧光微珠标记的抗FITC单克隆抗体，4℃孵育15分钟，用缓冲液洗1次。
肠γδT细胞分离的关键是要获得大量高纯度的活性肠淋巴细胞。肠系膜淋巴管汇集整个肠道活性淋巴细胞，纯度为100％，不包括其它任何类型的细胞。因此，通过肠系膜淋巴管插管法收集肠淋巴细胞能够保证短时间内获得大量高纯度活性淋巴细胞，仅需一个步骤即可分离，从而避免了反复机械振荡及化学作用使组织匀浆、过滤、离心分离等多个步骤导致的细胞死亡，活性细胞数量下降。此外，相比分离整个肠组织或分离肠组织中的淋巴结都不可避免地混杂其它类型的细胞，从而使淋巴细胞纯度下降，最终收获的细胞总数量较低。本方法可以获得高纯度的总数较多的活性淋巴细胞，而且费时短。
本发明通过肠系膜淋巴管插管法直接、高效的收获肠淋巴细胞，然后通过磁式细胞仪进一步分离肠γδT细胞操作简便，费时短，整个分离方法简单、高效，收获细胞数量多，活性高、纯度高，有利于发挥其生物学功能。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种肠γδT细胞的分离方法，包括以下步骤：
1)、收集动物的肠淋巴细胞，离心，去掉上清液，生理盐水悬浮肠淋巴细胞；
选择重约300克的雄性Wistar大鼠作为取材对象。用异戊巴比妥(2.5％，100mg/kg)腹腔注射，麻醉大鼠。术前通过微电脑输液泵(德国B.Braun公司)给予大鼠注入0.9％生理盐水(0.3ml/h)。将麻醉大鼠置于手术台上，沿腹中线剖开大鼠腹腔，将胃、小肠推向腹腔左侧，肝脏推向右上方，暴露肝十二指肠韧带。将0.5％的台盼兰注入小肠壁，1分钟内，可见肝十二指肠韧带中染成蓝色肠系膜淋巴管，外径约0.1cm，长约0.3～0.5cm，正常情况下，肠系膜淋巴管为无色透明，籍此可以判断肠系膜淋巴管的位置，即位于下腔静脉左侧，右肾静脉对侧，与肠系膜上动脉伴行，呈左右横行走向。于右肾静脉上方游离下腔静脉，并在右侧腹壁穿孔。将一外径0.1cm，长约6～8cm的塑料管充满肝素，一端剪成斜面，并穿过右侧腹壁孔、肝脏下方和下腔静脉下方，以其斜面端插入肠系膜淋巴管，尽可能到达深处，另一端用1.5ml的离心管盛接肠淋巴。收集的肠淋巴用0.2％台盼兰染色进行活细胞计数，在倒置显微镜下计数各管内的淋巴细胞数。将收集的肠淋巴经500g×5min离心，去掉上清液，0.9％生理盐水悬浮淋巴细胞。
2)、采用异硫氰酸荧光素交联的抗γδTCR单克隆抗体标记收集到的肠淋巴细胞，每1×108个肠淋巴细胞加100μl异硫氰酸荧光素交联的抗γδTCR单克隆抗体，4℃孵育30分钟，用缓冲液洗2次；然后然后加入抗荧光微珠标记的抗FITC单克隆抗体，每1×108个肠淋巴细胞加100μl抗荧光微珠标记的抗FITC单克隆抗体，4℃孵育15分钟，用缓冲液洗1次。然后上磁式细胞分选仪优化分选，收集阳性选择的细胞，即得到γδT细胞。
每2×105个细胞用PE标记的抗γδTCR抗体进行染色，上流式细胞仪，用CellQuest软件分析数据，计算肠γδT细胞纯度。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。