本发明属于体外细胞培养
技术领域：
，涉及一种无血清的淋巴细胞培养基。
背景技术：
：淋巴细胞是用于细胞免疫治疗的重要载体。淋巴细胞的体外培养、扩增和活化离不开优良的培养基。培养基为淋巴细胞的生长提供了基本的环境，包括为淋巴细胞存活提供适宜的渗透压，pH值，为淋巴细胞的生长提供了一切所需的营养因子，包括无机盐、氨基酸、功能性的蛋白、维生素等，也是淋巴细胞各种代谢产物的排放场所。传统的培养基为了提供这些营养因子，大多采用动物或人的血清及其组分作为添加物，比较常见的有新生牛血清、胎牛血清、人AB血清、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、人转铁蛋白等。使用动物血清的优点是有足够的量供应，价格便宜，但是使用动物血清的缺点是有潜在传播传染病的风险，以及由于异种蛋白导致过敏症的发生，而且动物血清并不能很好的支持人淋巴细胞的生长。而使用人AB血清的好处是可以很好的支持人淋巴细胞的生长，但是人AB血清来源困难，供应量有限，而且也存在传播传染病的风险。现有商品化无血清淋巴细胞培养基大都添加有人血白蛋白、人转铁蛋白等人源性组分。由于这些组分来源于人的血清，虽然有各种病原体的检测技术和消毒技术，但仍然避免不了传播疾病的风险；由于来源于不同的供者，造成批次间差异，不利于质量的控制。中国专利CN102352343B公布了一种淋巴细胞培养基及其使用方法，该淋巴细胞培养基包括基础培养基以及血清替代物，所述血清替代物包括重组人血白蛋白、重组人转铁蛋白以及重组人胰岛素，用以解决现有淋巴细胞培养基大多采用动物或人的血清及其组分作为添加物，增加了传播疾病的风险，同时不同批次，质量无法统一的问题。但是在使用培养基时依旧需要加入2％的淋巴细胞自体血清才能有更好的效果，未能从根本上解决上述问题。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题在于现有淋巴细胞培养基大多采用动物或人的血清及其组分作为添加物，增加了传播疾病的风险和不同批次质量无法统一的问题，并针对该问题提供了一种更为有效的无添加血清的淋巴细胞培养基。本发明通过以下技术方案解决上述技术问题：一种无血清添加的淋巴细胞培养基，包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：人转铁蛋白1～10μg/mL，胰岛素样生长因子10～100ng/mL，表皮生长因子10～50ng/mL，亚硒酸钠0.1-1mg/L，硫酸铜1-5mg/L，硫酸锌0.1-5mg/L，生物素1-50ng/mL和庆大霉素1IU/ml-15IU/ml。优选地，所述无血清淋巴细胞培养基，由DMEM基础培养基及以下组分及其浓度组成：人转铁蛋白8μg/mL，胰岛素样生长因子30ng/mL，表皮生长因子15g/mL，亚硒酸钠0.5mg/L，硫酸铜3.5mg/L，硫酸锌2mg/L，生物素25ng/mL和庆大霉素7IU/ml。优选地，所述DMEM培养基为高糖型。优选地，所述胰岛素样生长因子胰岛素样生长因子-I。人转铁蛋白的主要作用是向细胞内转运铁(Fe3+)，几乎所有的细胞生长都离不开对铁的需求。胰岛素样生长因子是一类多功能细胞增殖调控因子，在细胞的分化、增殖、个体的生长发育中具有重要的促进作用。表皮生长因子是最早发现的生长因子，对调节细胞生长、增殖和分化起着重要作用。锌、硒、铜等是细胞内许多酶的活性中心，也需要以合适的形式补充到培养基中，本发明向基础培养基中添加化合物亚硒酸钠、硫酸铜以及硫酸锌，以向细胞提供锌、硒以及铜。生物素又名维生素H、辅酶R等，是脂肪和蛋白质正常代谢不可或缺的物质。一种无血清淋巴细胞培养基的制备方法，包括如下步骤：向DMEM基础培养基中，按所述浓度加入人转铁蛋白，胰岛素样生长因子，表皮生长因子，亚硒酸钠，硫酸铜，硫酸锌，生物素，混匀，利用2mol/LNa2CO3或HEPES调整培养基pH为7.2，过膜除菌即得。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)本发明提供的无血清的淋巴细胞培养基，有效解决了现有淋巴细胞培养基大多采用动物或人的血清及其组分作为添加物，具有传播疾病的风险，不同批次质量无法统一的问题；(2)实验证明，本发明培养基与对比例培养基相比，淋巴细胞的扩增能力和杀瘤活性更强，分别提高了94％，17.6％，证明使用本发明所述淋巴细胞培养基用于培养人淋巴细胞的效果优于现有的血清替代物的淋巴细胞培养基。具体实施方式以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此。实施例1一种无血清淋巴细胞培养基一种无血清淋巴细胞培养基，包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：人转铁蛋白1μg/mL，胰岛素样生长因子10ng/mL，表皮生长因子10ng/mL，亚硒酸钠0.1mg/L，硫酸铜1mg/L，硫酸锌0.1mg/L，生物素1ng/mL和庆大霉素1IU/ml。制备方法，包括如下步骤：向DMEM基础培养基中，按所述浓度加入人转铁蛋白，胰岛素样生长因子，表皮生长因子，亚硒酸钠，硫酸铜，硫酸锌，生物素，混匀，利用2mol/LNa2CO3或HEPES调整培养基pH为7.2，过膜除菌即得。实施例2一种无血清淋巴细胞培养基一种无血清淋巴细胞培养基，包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：人转铁蛋白10μg/mL，胰岛素样生长因子100ng/mL，表皮生长因子50ng/mL，亚硒酸钠1mg/L，硫酸铜5mg/L，硫酸锌5mg/L，生物素50ng/mL和庆大霉素15IU/ml。制备方法与实施例1类似实施例3一种无血清淋巴细胞培养基一种无血清淋巴细胞培养基，包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：人转铁蛋白8μg/mL，胰岛素样生长因子30ng/mL，表皮生长因子15ng/mL，亚硒酸钠0.5mg/L，硫酸铜3.5mg/L，硫酸锌2mg/L，生物素25ng/mL和庆大霉素7IU/ml。制备方法与实施例1类似对比例1一种无血清淋巴细胞培养基无血清淋巴细胞培养基，包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：人转铁蛋白8μg/mL，胰岛素样生长因子30ng/mL，表皮生长因子15ng/mL，亚硒酸钠0.5mg/L，硫酸铜3.5mg/L，硫酸锌2mg/L，维生素D25ng/mL和庆大霉素7IU/ml。与实施例3区别在于，将生物素替换为维生素D。制备方法与实施例1类似。试验一、淋巴细胞增殖实验和存活率1.试验对象：实施例1-3制备得到的无血清添加的淋巴培养基与对比例1制备得到的淋巴细胞培养基。2.试验方法：使用淋巴细胞分离液密度梯度离心分离外周血单个核细胞，或者复苏冻存的单个核细胞。加入含5％热灭活胎牛血清(FBS)生理盐水300g离心10分钟，去除上清液。计数细胞，用相应的培养基配成1*106/ml细胞悬液，培养基使用前加入谷氨酰胺300mg。分为6组，各组所用培养基如表1所示。按每孔加入2ml培养基接入6孔板，每组3个复孔。第1天加入1000IU/mlIFN-r，培养24小时后加入50ng/mlCD3单抗(OKT3)300IU/mlIL-2，100IU/mlIL-1a。以后每3天计数，补加含300IU/mLIL-2培养液至1*106/ml。培养15天，台酚蓝染色计算细胞增殖倍数和存活率。3.试验结果：结果如表1所示：表1淋巴细胞增殖倍数和存活率由表1可知，实施例1-3培养基效果明显好于对比例1培养基，其中实施例3培养基效果最好，与对比例1培养基相比，淋巴细胞的扩增能力提高了94％。试验二、淋巴细胞毒性实验1.试验对象：实施例1-3配制得到的无血清添加的淋巴培养基与对比例1配制得到的淋巴细胞培养基。2.试验方法：取培养15天的CIK细胞为效应细胞，以K562细胞为靶细胞，按效靶比10∶1接种到96孔板内，每个孔板内加有不同的培养基，37℃，5％CO2培养24小时。用MTT法测吸光度值，计算杀瘤率。杀瘤率％＝1-(试验孔-效应细胞孔)/靶细胞孔3.试验结果：淋巴细胞毒性实验结果如下表2所示：表2淋巴细胞毒性实验结果培养基杀瘤率(％)实施例172实施例276实施例380对比例160由表2可知，实施例1-3培养基淋巴细胞毒性试验效果明显好于对比例1培养基，其中实施例3培养基效果最好，与对比例1培养基相比，淋巴细胞的杀瘤率提高了17.6％。上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属
技术领域：
中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。当前第1页1 2 3