软骨细胞的无血清培养方法、及无血清培养基与流程

本发明涉及在进行无血清培养之前用蛋白分解酶处理细胞的软骨细胞的培养方法及适用于该方法的无血清培养基。

背景技术：

日本特开2003-125787号公报中，公开了软骨细胞分化培养中所使用的无血清培养基及使用了该无血清培养基的软骨细胞的培养方法。

日本特许第3638614号公报中，公开了软骨细胞培养基和使用了该培养基的软骨细胞的培养方法。此外，该文献中公开了ITS。

日本特表2002-529071号公报中，公开了用于软骨细胞样细胞的无血清培养基。

日本特表2009-540826号公报中，公开了一种软骨细胞的培养方法，其为：从关节软骨活检中单独分离原代人软骨细胞，用蛋白酶(灰色链霉菌)进行1小时的酶消化，然后，用胶原酶进行酶消化。该文献中，为了从软骨剥离软骨细胞而使用胶原酶。若胶原酶过度作用，则对细胞造成损害。因此，如果在胶原酶附着于细胞的状态下进行无血清培养，则除了不能良好地培养软骨细胞以外，所得到的软骨细胞有时不能应用于移植等。

日本特表2015-522590公报的段落[0145]中，记载了卡托吉宁即Kartogenin是一种有助于治疗骨关节炎的小分子。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2003-125787号公报

专利文献2：日本特许第3638614号公报

专利文献3：日本特表2002-529071号公报

专利文献4：日本特表2009-540826号公报

专利文献5：日本特表2015-522590公报

技术实现要素：

发明要解决的问题

上述培养方法中，虽然培养了软骨，但当实际要对培养的软骨进行移植等时，有时不能得到良好的结果。

在此，本发明的目的在于提供一种能够有效地进行培养、此外还能够得到良好的移植结果的软骨细胞的无血清培养方法，能够用于该方法的无血清培养基。

解决问题的方案

本发明的第一方面涉及用于培养软骨细胞的无血清培养基。该培养基含有卡托吉宁或者SMO激动剂的SAG中的任一者或两者、以及ITS、FGF2和氢化可的松。

优选地，该培养基含有卡托吉宁和SAG这两者。

优选地，该培养基进一步含有IGF(胰岛素样生长因子)。

优选地，该培养基进一步含有作为培养对象的软骨细胞。

优选地，该培养基的优选利用方式为包括该培养基、以及抗坏血酸剂和脂肪酸剂的培养基试剂盒，抗坏血酸剂包括抗坏血酸、抗坏血酸的盐或抗坏血酸的溶剂化物，脂肪酸剂包括脂肪酸、脂肪酸的盐或脂肪酸的溶剂化物。

本发明的第二方面涉及软骨细胞的无血清培养方法。该软骨细胞的无血清培养方法依次包括：

用胶原酶处理含人软骨细胞的组织的酶处理工序；以及

用无血清培养基培养组织的培养工序，

无血清培养基含有卡托吉宁或SAG中的任一者或两者、以及ITS、FGF2和氢化可的松，

其中，培养工序包括：

在从培养开始第3天至第28天的期间内向无血清培养基中添加抗坏血酸、抗坏血酸的盐或抗坏血酸的溶剂化物，并且

在从培养开始第3天至第28天的期间内向无血清培养基中添加脂肪酸、脂肪酸的盐或脂肪酸的溶剂化物。

该方法优选进一步包括在酶处理工序之后，用胶原酶抑制剂处理组织的抑制剂处理工序。

发明的效果

提供一种能够有效地进行培养、此外还能够得到良好的移植结果的软骨细胞的无血清培养方法，能够用于该方法的无血清培养基。

附图说明

图1为表示实施例1中从培养第0天到第16天为止的培养软骨细胞的代替附图的照片。

图2为表示实施例1中从培养第19天到第41天为止的培养软骨细胞的代替附图的照片。

图3为表示比较例1中从培养第1天到第5天为止的培养软骨细胞的代替附图的照片。

图4为表示实施例2(继代培养)中从培养第1天到第13天为止的培养软骨细胞的代替附图的照片。

图5为表示实施例2中从培养第18天到第28天为止的培养软骨细胞的代替附图的照片。

图6为表示实施例2中从培养第29天到第52天为止的培养软骨细胞的代替附图的照片。

图7为表示比较例2中从培养第1天到第13天为止的培养软骨细胞的代替附图的照片。该例子中，除了使用不含SAG的DMEM培养基以外，与实施例2同样地操作，培养软骨。

图8为表示将用无血清培养基培养的人耳廓软骨移植到裸鼠的背部，6个月后形成了软骨的样子的代替附图的照片。

图9为表示将形成于裸鼠背部的软骨摘出而得到的标本的代替附图的照片。

图10为表示将用无血清培养基(SAG+ITS)培养的人耳廓软骨移植到裸鼠背部、并将形成的软骨的切片用甲苯胺蓝、阿尔新蓝或弹性范吉松氏染色法EVG(Elastica Vangeson)染色而得到的结果的代替附图的照片。

图11为表示将用无血清培养基(卡托吉宁Kartogenin+ITS)培养的人耳廓软骨移植到裸鼠背部、并将形成的软骨的切片用甲苯胺蓝、阿尔新蓝或EVG染色而得到的结果的代替附图的照片。

图12为表示SAG浓度与培养软骨细胞的增殖之间的关系的曲线图。

图13为表示在培养基中添加ITS和SAG的情况中，SAG浓度与培养软骨细胞的增殖之间的关系的曲线图。

图14为表示在培养基中添加ITS和SAG的情况中，SAG浓度与培养软骨细胞的增殖之间的关系的另一曲线图。

具体实施方式

以下，使用附图对用于实施本发明的方式进行说明。本发明不限于以下说明的方式，还包括本领域技术人员基于以下的方式在显而易见的范围内适当修正而得到的方式。

本发明涉及软骨细胞的无血清培养方法。该方法包括酶处理工序以及培养工序。该方法还可以包括抑制剂处理工序。

酶处理工序是用蛋白分解酶处理含人软骨细胞的组织的工序。具体而言，是使含人软骨细胞的组织与蛋白分解酶接触，利用蛋白分解酶使含人软骨细胞的组织中所含的蛋白质分解的工序。由于用蛋白分解酶进行处理本身是已知的，因此基于已知的方法进行该工序即可。

人软骨细胞的例子为从耳廓软骨、鼻中隔软骨、肋软骨、关节软骨、脊间软骨、气管软骨、喉头盖采集的软骨细胞、从人基因培养的人软骨细胞。采集人软骨细胞的方法是公知的。即，可以从外科患者采集人软骨细胞。另外，本发明可以适当使用能够分化为软骨细胞的细胞从而得到人软骨细胞。可以使用人、温血动物的来源于骨髓的细胞、来源于关节软骨的细胞、来源于皮肤的细胞、胚细胞、来源于胎儿的细胞，能够分化为软骨细胞的细胞的例子为人间充质干细胞、去分化而成的软骨细胞(例如去分化而成的人正常软骨细胞)。

并且，本发明为了使人软骨组织和集合软骨细胞成为单细胞(single cell)而用蛋白分解酶进行处理。该工序是将人软骨组织、集合细胞中所含的蛋白质的一部分用蛋白分解酶分解的消化工序。蛋白分解酶的例子为胰蛋白酶或胶原酶。胶原酶例如像日本特许第4764006号公报、日本特许第5322637号和日本特表2009-540826号公报中公开的那样，是公知的化合物。胶原酶优选为不含有来源于动物的成分的胶原酶。这样的胶原酶市面有售，因此购买不含有来源于动物的成分的胶原酶即可。该溶液中可以适当含有例如青霉素、链霉素那样的公知的抗生素。关于酶处理工序，例如准备含有蛋白分解酶的溶液，在该溶液中浸渍人软骨细胞即可。这样一来，能够将人软骨细胞中所含的蛋白质的一部分用蛋白分解酶分解。尤其优选地，胶原酶等蛋白分解酶与人软骨细胞作用至没有将人软骨细胞完全分解的程度。因此，溶液中优选含有0.01重量％以上1重量％以下(或0.1重量％以上0.5重量％以下)的蛋白分解酶。并且，浸渍时间优选调整为例如3小时以上24小时以下。

抑制剂处理工序是在酶处理工序之后用蛋白分解酶的抑制剂处理组织的工序。该工序是将用蛋白分解酶处理的组织与蛋白分解酶的抑制剂接触，进行抑制蛋白分解酶功能的处理的工序。抑制剂的例子为胰蛋白酶抑制剂或胶原酶抑制剂。胰蛋白酶抑制剂和胶原酶抑制剂的例子为来源于大豆的蛋白分解酶抑制剂。胶原酶抑制剂的其它例子为日本特许第5044071号公报中公开的视黄酸、日本特开平5-97674号公报中公开的8-羟基喹啉衍生物。视黄酸可以以盐、溶剂化物的形式准备。关于盐、溶剂化物，如后所述。该抑制剂处理工序可以与先前的酶处理工序同样操作而进行。关于抑制剂处理工序，例如准备含有蛋白分解酶的抑制剂的溶液，在该溶液中浸渍人软骨细胞即可。这样一来，能够抑制人软骨细胞中所含的蛋白分解酶的功能。通过含有这样的抑制剂处理工序，本发明能够有效地培养良好的软骨细胞。

也就是说，如果培养软骨细胞，则产生胶原蛋白。因此，在通常的情况下，不会想到要对采集的软骨细胞用胶原酶进行处理。软骨细胞在软骨组织中被胶原蛋白等细胞外基质(matrix)包围。因而为了将软骨细胞从基质(matrix)中取出，本发明还是要对采集的软骨细胞用胶原酶、胰蛋白酶进行处理，将软骨细胞的培养、移植后不适合的成分分解。另一方面，如果胰蛋白酶继续发挥功能，则软骨细胞受到伤害，软骨细胞的培养不能进行。因此，本发明在抑制剂处理工序中抑制胰蛋白酶等蛋白分解酶的功能。由于血清中存在蛋白分解酶抑制剂样的成分，所以使用了血清的培养基中不需要添加蛋白分解酶抑制剂。另一方面，由于无血清培养基没有酶抑制剂样的成分，因此为了抑制蛋白分解酶的功能而添加酶抑制剂样的成分。予以说明的是，在使用胶原酶的情况中可以使用胶原酶抑制剂，但由于胶原酶的作用不强，因此也可以不使用胶原酶抑制剂。

培养工序是在抑制剂处理工序之后用无血清培养基培养组织的工序。关于软骨细胞的无血清培养，如上所述，是已知的。因此，本发明中也适当采用公知的培养方法即可。另一方面，本发明优选在无血清培养基中含有SMO激动剂。关于SMO或SMO受体，例如像日本特许第5270362号公报、日本特许第5424923号公报中介绍的那样，其是活化刺猬因子(Shh，Sonic hedgehog)的蛋白质。并且，SMO(smoothened)激动剂优选为SAG或SAG1.1。SAG是以CAS号364590-63-6被知晓，是化学物质名为N-甲基-N’-(3-吡啶基苄基)-N’-(3-氯苯并[b]噻吩-2-羰基)-1,4-环己二胺(N-Methyl-N’-(3-pyridinylbenzyl)-N’-(3-chloro benzo[b]thiophene-2-carbonyl)-1,4-diaminocyclohexane)的化合物。SAG如国际公开WO2014-084085号小册子中公开的那样，是活化Shh(Sonic hedgehog)的蛋白质。SAG1.1的化学物质名为N-甲基-N’-(3-(4-苯甲腈)-4-甲氧基苄基)-N-(3-氯苯并[b]噻吩-2-羰基)-1,4-环己二胺(N-Methyl-N-(3-(4-benzonitrile)-4-methoxybenzyl)-N’-(3-chlorobenzo[b]thiophene-2-carbonyl)-1,4-d iaminocyclohexane))。关于SAG，详见文献Sinha S,Chen JK.Nat Chem Biol.2006Jan；2(1):29-30.和Chen JK,Taipale J,Young KE,Maiti T,Beachy PA.Proc Natl Acad Sci U S A.2002Oct 29；99(22):14071-6.。同样地，关于SAG1.1，详见文献Chen,W.,Ren,X.R.,Nelson,C.D.,Barak,L.S.,Chen,J.K.,Beachy,P.A.,de Sauvage,F.&Lefkowitz,R.J.(2004)Science 306,(5705)2257-2260。

培养软骨细胞的方法可以基于通常的经验及见解适当进行。作为无血清培养基，可以使用在基本培养基中适当添加试剂而成的培养基。关于试剂的量，可以对公知的量适当修正而使用。

本发明还提供一种无血清培养基。该无血清培养基优选含有SMO激动剂(例如SAG)。并且，该培养基可优选地用于软骨细胞的培养。因此，该无血清培养基是在培养时含有软骨细胞的无血清培养基。

本发明的培养基优选含有卡托吉宁(Kartogenin)。卡托吉宁的物质名为2-[(联苯-4-基)氨基甲酰基]苯甲酸(2-[(Biphenyl-4-yl)carbamoyl]benzoic acid)，市面有售。本发明的培养基优选含有卡托吉宁或SAG中的任一者或两者，可以仅含有卡托吉宁，也可以仅含有SAG，还可以含有卡托吉宁和SAG这两者。

本发明的无血清培养基可以在基本培养基中适当添加必要的要素。基本培养基的例子为Eagle基础培养基和DMEM。关于试剂，可以适当添加在培养基中使用的公知试剂。试剂的例子为上述的SAG(或SAG1.1)、FGF2(微球)、IGF(胰岛素样生长因子)、胰岛素、HC(氢化可的松)等类固醇、血小板衍生生长因子(PDGF，platelet derived growth factor)、ACTH(促肾上腺皮质激素)、LIF(白血病抑制因子)、TGFβ、BMP、类固醇、脂肪酸、大豆胰蛋白酶抑制剂、抗坏血酸、透明质酸、脯氨酸、地塞米松、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸。在将抗坏血酸等添加至培养基中的情况中，可以添加2-磷酸盐等盐形式的物质。

例如日本特许5228187号中，公开了以含有葡糖醛酸为特征的用于培养软骨细胞的培养基组合物。本发明中也可以适当使用例如该公报中记载的培养基的添加物。

胰岛素优选为作为ITS而添加的物质。ITS是包含胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠的试剂，其组成例为胰岛素5μg/ml、转铁蛋白5μg/ml、以及亚硒酸钠5ng/ml。ITS市面有售，因此可适当使用市售的物质。ITS优选为不含有来源于动物的成分的无动物物质。予以说明的是，本发明中优选使用基本上不含有来源于动物的成分的原料。

关于SAG、卡托吉宁、FGF2、IGF(胰岛素样生长因子)、胰岛素、氢化可的松等类固醇、PDGF、ACTH(促肾上腺皮质激素)、LIF(白血病抑制因子)、TGFβ、BMP、类固醇和ITS，例如可以分别在培养基中添加至0.1ng/mL以上20μg/mL以下(或0.2ng/mL以上10μg/mL以下)。它们可以根据精制的程度、必要量进行适当调整而添加。经过试错，结果可知，无血清培养基优选为以在基本培养基中添加了SAG(例如0.05以上5μM以下，优选0.1μM以上2μM以下，优选0.2μM以上1μM以下)、FGF2(例如1ng/mL以上1μg/mL以下)、IGF(例如1ng/mL以上50μg/mL以下)和HC(例如1ng/ML以上μg/mL以下)的培养基作为基础的培养基。

在通常的培养条件(例如37℃，5％CO₂)下培养、增殖上述细胞。细胞量可以是从10％前后直到100％汇合的状态，另外，也可以在超过100％汇合的高密度、多层状态下培养。可以在移植后马上、或静止片刻后运送至低氧状态中。低氧培养可以使用例如混合市售的氮气等并降低氧分压类型的低氧培养箱，也可以在适当的空间内吹入氮气、使氧分压下降等从而进行培养。

实施例中进行的培养工序如下所述。即，将上述SAG添加至培养基中。在培养基中适当添加抗坏血酸、脂肪酸。反复进行实验，结果，在从培养开始就含有抗坏血酸、脂肪酸的情况中，软骨细胞没有良好地增殖。另一方面，如果在培养开始后经过规定期间以后添加抗坏血酸、脂肪酸，则软骨细胞显著增加。因而，优选在培养开始后的第3天至第28天的期间内向无血清培养基中添加抗坏血酸、抗坏血酸的盐或抗坏血酸的溶剂化物。抗坏血酸的添加时段可以是从培养开始第5天至第25天为止的期间，也可以是从第10天至第22天的期间，也可以是从第14天至第21天的期间。另外，也可以是将这些期间适当缩短或延长的期间。另外，优选在从培养开始第3天至第28天的期间内向无血清培养基中添加脂肪酸、脂肪酸的盐或脂肪酸的溶剂化物。脂肪酸等的添加时段可以是从培养开始的第5天～第2个月为止的期间开始，也可以是从第10天至第40天为止的期间开始，也可以是从第19天至第25天。通过进行这样的培养，能够与对照相比以压倒性优势有效地培养软骨细胞。

本发明的方法所制造的软骨细胞或软骨能够用于软骨移植，该软骨移植是作为为了在例如关节疾病(例如整形外科领域中骨折、二次骨折、骨变形-变形脊椎病、骨肉瘤、骨髓瘤、骨形成不全、侧弯症等非代谢性骨病；骨缺损、骨质疏松症、软骨症、佝偻病、纤维性骨炎、肾性骨营养不良症、骨白塞氏病、强直性脊柱炎等代谢性骨病、骨关节炎、慢性关节风湿症等软骨疾病)等中进行软骨修复的外科手法而进行的软骨移植。软骨移植方法可以使用常规方法进行。因此，本发明的方法所制造的软骨细胞或软骨可以用作针对上述关节疾病的安全且低毒性的预防、治疗剂。另外，使用本培养体系，还可能进行与软骨分化相关的基因探索、医药品的探索。

培养细胞的回收

如上述那样培养的软骨细胞中，形成了细胞重叠而成的集合体。因此，例如在培养后，从横向方向向培养基中插入棒，将该棒向上方提起，则能够有效地回收软骨组织的培养物。通常情况下，为了回收培养细胞，需要从容器分离软骨组织。因此，在通常的方法中，使胶原酶、胰蛋白酶那样的蛋白分解酶作用，从而从容器剥离软骨细胞。由此，培养得到的软骨组织只能是分散的状态。本发明的培养方法中，软骨细胞重叠而成的集合体成为容易从容器剥离的状态，因此仅使用上述回收方法，就能容易地回收例如片状、块状的软骨组织。

实施例1

组织的消化-培养准备-

从关节软骨活检单独分离原代人软骨细胞，对该试样进行细分。然后，浸渍于0.1％至0.3％的胶原酶溶液，在37℃进行4至5小时的酶消化。将所得细胞进行5分钟、1,200rpm的离心分离，从而回收。

向DMEM培养基中添加FGF 100ng/mL、SAG 0.5μM、HC 400ng/mL、IGF5ng/mL和胰岛素5μg/mL，用作培养基。将先前所得的培养细胞以1000个细胞/cm²的密度播种。在37℃、5％CO₂的环境中进行培养。

图1为表示实施例1中从培养第0天到第16天为止的培养软骨细胞的代替附图的照片。可知，软骨组织缓慢增加。

图2为表示实施例1中从培养第19天到第41天为止的培养软骨细胞的代替附图的照片。培养第18天时，向培养基中添加50μg/mL的抗坏血酸。经过试错，结果可知，在这种程度的期间内添加抗坏血酸对于在无血清培养基中培养软骨细胞非常有效。培养第3周时，以1：1000至1：500添加脂肪酸。虽然加入了脂肪酸，但细胞数增加，培养基的粘度提高。

在培养中添加的脂肪酸和胆固醇如下所述。

在培养中添加的脂肪酸和胆固醇

上述添加量在±200％、优选±100％的范围内增减则无妨。予以说明的是，脂肪酸的范围可以为1：50至1：2000的范围。

继代培养时，代替胶原酶而使用胰蛋白酶，将回收的细胞浸渍于作为胰蛋白酶抑制剂的来源于大豆的蛋白分解酶抑制剂。

[比较例1]

图3为表示比较例1中从培养第1天到第5天为止的培养软骨细胞的代替附图的照片。该例子中，除了使用不含SAG的DMEM培养基以外，与实施例1同样地操作，培养软骨。如图3所示，表现出在不含SAG的状态下，无法有效地培养软骨细胞。

抗坏血酸和脂肪酸的添加时段的调整

分别在培养开始时、培养开始1小时后、3小时后、12小时后、1天后、2天后、3天后、5天后、1周后、10天后、2周后、20天后、3周后、25天后、4周后、30天后、5周后、40天后、6周后、45天后、7周后、50天后、8周后、60天后、9周后、70天后开始添加抗坏血酸。定期添加抗坏血酸(例如每12小时，每1日，每2日)。

关于脂肪酸的添加，也与抗坏血酸的添加同样地进行调整。

其结果可知，与从培养开始立即添加抗坏血酸相比，从经过3天左右以后开始添加抗坏血酸是优选的。

脂肪酸的添加与抗坏血酸的添加是同样的，但是在添加抗坏血酸以后添加脂肪酸的情况是优选的。

实施例2

向DMEM培养基中添加FGF2 100ng/mL、SAG 0.5μM、HC 400ng/mL、IGF 5ng/mL和胰岛素5μg/mL，用作继代培养用的培养基。将实施例1中的培养细胞以10000细胞/cm²的密度播种。在37℃、5％CO₂的环境中进行培养。

图4为表示实施例2(继代培养)中从培养第1天至第13天为止的培养软骨细胞的代替附图的照片。从培养开始10天左右时观察到，培养基中可看出粘性，若用吸引器除去培养基，则拉出细丝。从第13天开始，培养基的粘度提高。

图5为表示实施例2中从培养第18天至第28天为止的培养软骨细胞的代替附图的照片。培养第18天时，向培养基中添加50μg/mL的抗坏血酸。经过试错，结果可知，在这种程度的期间内添加抗坏血酸对于在无血清培养基中培养软骨细胞非常有效。培养第3周时，以1：1000至1：500添加脂肪酸。加入了脂肪酸，显现细胞数增加，培养基的粘度提高。

图6为表示实施例2中从培养第29天至第52天为止的培养软骨细胞的代替附图的照片。若用吸引器除去培养基，则拉出粗丝。如图所示，表现出通过使用无血清培养基培养软骨细胞，能够有效地培养软骨细胞。

在培养中添加的脂肪酸和胆固醇如下所述。

在培养中添加的脂肪酸和胆固醇

上述添加量在±200％、优选±100％的范围内增减则无妨。予以说明的是，脂肪酸的范围可以为1：50至1：2000的范围。

[比较例2]

图7为表示比较例2中从培养第1天至第13天为止的培养软骨细胞的代替附图的照片。该例子中，除了使用不含SAG的DMEM培养基以外，与实施例2同样地操作，培养软骨。如图7所示，表现出在不含SAG的状态下，无法有效地培养软骨细胞。

实施例3

为了确认使用本发明的无血清培养基培养的软骨细胞是适合移植的细胞，因而移植至裸鼠，调查是否在活体内形成软骨。

首先，按照实施例1描述的程序准备来源于人耳廓软骨的软骨细胞，用本发明的无血清培养基培养。将培养后的软骨细胞浸渍于胶原蛋白的棉织物中，接着，与该棉织物一起移植于裸鼠背部的2个位置。移植手术和裸鼠的管理按照公知的方法进行。移植6个月后，将裸鼠的背部切开，确认细胞是否固定于移植部位并且形成有软骨。

图8为表示移植6个月后将裸鼠的背部切开的样子的照片。在移植了培养的软骨细胞的部位(左右的背部)，能够确认到大的白色软骨(A-2，B-2)。由此，认为培养细胞固定于移植部位并增殖，形成了软骨。

图9为表示将形成于裸鼠背部的软骨摘出的样子。A1表示在移植了按照下述培养条件(A)(SAG+ITS)培养的软骨细胞的裸鼠中形成的软骨。ITS使用无动物物质。

培养条件(A)

DME(H)：F-12＝1：1

SAG 0.1uM

FGF 50ng/mL

HC 400ng/mL

ITS×1

从培养第8天开始添加抗坏血酸50ug/mL，脂肪酸1：500

另一方面，C1表示在移植了软骨细胞的裸鼠中形成的软骨，该软骨细胞是按照下述培养条件(C)(卡托吉宁+ITG)培养而培养基容易分离并且粘度最低的软骨细胞。

培养条件(C)

DME(H)：F-12＝1：1

卡托吉宁1uM

FGF 50ng/mL

HC 400ng/mL

ITS×1

从培养第8天开始添加抗坏血酸50ug/mL，脂肪酸1：500

与按照培养条件(C)培养的软骨细胞相比，按照培养条件(A)培养的软骨细胞形成了大的软骨。另外，在仅移植了胶原蛋白的棉织物的裸鼠(阴性对照)中，没有形成软骨(D2和D3)。

接着，从组织学角度研究在培养细胞的移植部位形成的软骨是否为软骨。具体而言，制作摘出的软骨(A1，C1)的切片，使用对软骨进行特异性染色的甲苯胺蓝、阿尔新蓝进行染色。另外，使用对弹性软骨进行特异性染色的弹性范吉松氏染色法EVG(Elastica Vangeson)进行染色。将结果示于图10和图11。

图10表示A1的软骨的染色结果。图10(A)为甲苯胺蓝染色的结果，软骨被染色为紫色。图10(B)为阿尔新蓝染色的结果，软骨被染色为蓝色。因此确认到，A1的软骨在两次染色中为阳性，具有作为软骨的特性。

另外，图10(C)表示EVG染色的结果，软骨被染色为褐色。由此证明是弹性软骨，并且鉴定为耳廓软骨。

图11表示C1的软骨的染色结果。图11(A)为甲苯胺蓝染色的结果，软骨被染色为紫色。图11(B)为阿尔新蓝染色的结果，软骨被染色为蓝色。因此确认到，C1的软骨在两次染色中为阳性，具有作为软骨的特性。

另外，图11(C)表示EVG染色的结果，软骨被染色为褐色。由此证明是弹性软骨，并且鉴定为耳廓软骨。

由此，证明了用本发明的无血清培养基培养的软骨细胞是适用于移植的细胞，在移植到裸鼠时，能够在移植部位形成软骨。

实施例4

为了研究添加至培养基中的SAG的最佳浓度，将无血清培养基中的SAG浓度改变为0.05uM、0.01uM或0.5uM，研究其对培养软骨细胞的增殖的影响。具体而言，将按照与实施例1同样的程序准备的软骨细胞以10000个/孔的密度播种，测定播种后第4、7、14、21天的细胞数。将结果示于图12。

在任一个SAG浓度中，到培养第14天为止，细胞的增殖基本观察不出差别，在培养第21天，也没有观察到预想程度的显著差别。

由于SAG是非常昂贵的试剂，因此优选能够以尽量低的浓度使用。发明人获得了如下的见解：通过在添加SAG的同时还添加胰岛素-转铁蛋白-硒ITS(Insulin-Transferrin-Selenium)，从而即使利用低浓度的SAG也能充分地促进软骨细胞的增殖。因而进行了确认。具体而言，将添加了ITS的无血清培养基中的SAG浓度改变为0.01uM、0.05uM、0.1uM或0.5uM，对培养软骨细胞进行培养，测定播种后第4、7、14、21天的细胞数。结果示于图13。

在不添加ITS也不添加SAG的情况中，观察不到对于软骨细胞增殖的显著效果。另一方面，在同时添加ITS和SAG的情况中，在0.01uM～0.5uM的任一种SAG浓度中，观察到几乎同等程度的软骨细胞的增加。因此，明确了在与ITS一起添加的情况中，即使利用0.01uM的SAG也能获得充分的效果。

另外，在不添加SAG而是添加卡托吉宁(Kartogenin)的情况中，显然对于软骨细胞的增殖是有效的。

为了进一步研究ITS和SAG对于软骨细胞增加的效果，在添加了ITS和SAG这两者的处理区(ITS+SAG 0.01uM，ITS+SAG 0.1uM)、单独添加了ITS的处理区(ITS+SAG-)以及没有添加ITS也没有添加SAG的处理区(ITS-SAG-)中，研究软骨细胞的增加。结果示于图14。

关于对软骨细胞增殖的效果，没有添加ITS也没有添加SAG的处理区(ITS-SAG-)中最低。单独添加了ITS的处理区(ITS+SAG-)中，观察到轻微的增殖效果。然而，该效果比添加了ITS和SAG这两者的处理区小。由此，可以说，ITS对于软骨细胞的增殖的效果不是非常强，而通过与SAG组合，能够获得显著的效果。

另外可知，在组合了ITS和卡托吉宁的处理区(ITS+卡托吉宁1uM)中，可观察到软骨细胞的增殖效果。但是，该效果比ITG和SAG的组合的情况小。

由这些结果能够确认到，将ITS与SAG一起添加对于软骨细胞的增殖有效。另外能够确认到，将ITS与卡托吉宁一起添加也有效。

产业上的利用可能性

本发明的无血清培养基、软骨细胞的培养方法能够为了制造培养软骨而使用。因此，本发明可以用于医药产业领域。