技术领域
本发明涉及兽用制剂技术领域，具体涉及一种绵羊肺炎支原体低血清培养基及其制备方法。
背景技术：
绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae，Mo）是羊支原体肺炎的主要病原体，是导致绵羊和山羊慢性非典型肺炎的主要病原之一。绵羊肺炎支原体可感染绵羊和山羊，临床隐性感染率高，常常继发其他病原，使病情加重。该病在我国养羊区和养羊场广泛流行，严重威胁我国养羊业的健康发展。
目前，预防控制绵羊肺炎支原体感染的一个重要手段是疫苗免疫，主要为灭活疫苗。疫苗中抗原含量和疫苗制备中培养基血清含量是影响疫苗有效性和安全性的重要因素。目前绵羊肺炎支原体的培养基主要有改良KM2培养基、改良Thiaucourt's培养基、TSB-1培养基等。上述培养基培养绵羊肺炎支原体仍存在培养时间长、活菌滴度低、繁殖能力差等问题。此外，现有技术培养基中血清含量普遍为20%，高血清含量的培养基制备的疫苗无疑增加了异源血清对羊体的过敏应激反应，影响疫苗的免疫效果。如果单纯降低现有技术培养基中血清含量会导致培养绵羊支原体抗原滴度低10～100倍左右，既达不到免疫所需抗原剂量，又需提高浓缩倍数，实际增加了生产成本。因此，开发培养绵羊肺炎支原体活菌滴度高、血清含量低的绵羊肺炎支原体培养基成为绵羊肺炎支原体疫苗研究和生产中急需解决的重要问题。
技术实现要素：
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种绵羊肺炎支原体低血清培养基及其制备方法，所述低血清培养基营养成分丰富、渗透压和pH值适合绵羊肺炎支原体生长，且生长速度快、活菌滴度高。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种绵羊肺炎支原体低血清培养基，每1000ml低血清培养基由基础培养基和辅助培养基组成；
所述基础培养基中含有以下组分：
（1）PPLO肉汤 22.0～24.0 g，
（2）丙酮酸钠 5.0～6.0 g，
（3）质量浓度为1%的酚红 2.0～2.5 ml，
（4）去离子水 650 ml；
所述辅助培养基中含有以下组分：
（5）质量浓度为20%的乳糖 45～60 ml
（6）质量浓度为10%的胰蛋白胨 60～70 ml，
（7）质量浓度为25%的新鲜酵母浸出液 110～120 ml，
（8）10 mg/ml的胰岛素 0.8～1.5 ml，
（9）质量浓度为3%的L-谷氨酰胺 16～17 ml，
（10）质量浓度为10%的L-半胱氨酸 4.0～5.0 ml，
（11）质量浓度为15%的水解乳蛋白 32.0～35.0 ml，
（12）10 mg/ml的转铁蛋白 0.8～1.5 ml，
（13）20万IU/ml的青霉素 0.25 ml，
（14）无菌马血清 50 ml。
本发明的第二个目的是提供了上述一种绵羊肺炎支原体低血清培养基的制备方法，包括以下步骤：
1）基础培养基的制备：
取上述的基础培养基组分中的（1）-（3）逐一加入650ml去离子水（4）中，充分混合，115℃高压灭菌20min后冷却至室温备用；
2）辅助培养基的制备：
取经0.22 微米滤膜滤过除菌的上述的（5）-（14）成分，充分混合，即得辅助培养基；
3）混合定容：
无菌条件下，将步骤1）得到的基础培养基和步骤2）得到的辅助培养基混合，用灭菌水补齐定容至1000ml，用灭菌的1M NaOH（4 g溶于100 ml去离子水）调pH值到7.2-7.4，充分摇匀，分装后置4℃保存备用。
本发明的第三个目的是提供了上述一种绵羊肺炎支原体低血清培养基在培养绵羊肺炎支原体中的应用。
本发明的第四个目的是提供了上述一种绵羊肺炎支原体低血清培养基在制备绵羊肺炎支原体疫苗抗原中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明的一种绵羊肺炎支原体低血清培养基是根据绵羊肺炎支原体的生长特性和代谢特点，通过对不同的碳源、氮源、蛋白质、无机盐等诸多营养组分的组合进行了筛选，对培养基的pH值、渗透压、离子强度等进行比较分析，研究出了适合培养绵羊肺炎支原体的低血清培养基。该培养基中PPLO肉汤是支原体生长基础液；培养基中的乳糖为绵羊肺炎支原体生长提供碳源；丙酮酸钠可作为支原体生长的替代碳源；通过添加胰蛋白胨，为绵羊肺炎支原体提供生长所需氮源和丰富的氨基酸；通过添加新鲜酵母浸出液，为绵羊肺炎支原体生长提供所需的氮源、维生素及微量元素等营养成分；添加L-谷氨酰胺可促进微生物代谢、促进蛋白质合成；添加L-半胱氨酸和水解乳蛋白为绵羊肺炎支原体生长提供合适的氨基酸和生长因子；胰岛素不仅具有促进糖元与脂肪酸的合成，而且能促进蛋白质、脂类和RNA的合成；转铁蛋白是微生物获取微量元素的重要方式，具有促进胰岛素发挥作用；通过添加马血清，向绵羊肺炎支原体提供生长所需的胆固醇和必需的饱和或不饱和脂肪酸；通过添加青霉素可抑制杂菌生长，对支原体无抑制效果，可避免培养基污染和延长培养基保存时间；添加酚红作为pH值指示剂，可判断支原体的生长状况。该培养基的配方中除基本成份外，在培养基中还添加了新鲜酵母浸出液、胰岛素、L-谷氨酰胺、L-半胱氨酸、水解乳蛋白、转铁蛋白等成分，上述成分的添加能明显提高绵羊肺炎支原体的活菌滴度；经反复实验证实，未添加之前活菌滴度为107CCU/ml左右，添加之后活菌滴度可达109～1010 CCU/ml。而本发明最大的优势在于培养基中低血清含量和培养绵羊肺炎支原体活菌滴度高。本发明培养基马血清用量仅为5%左右，是现有技术培养基血清含量的1/4；本发明培养基培养绵羊肺炎支原体活菌滴度为109 ～1010 CCU/ml，平均滴度为7×109 CCU/ml，而改良KM2培养基为107CCU/ml，改良Thiaucourt's培养基和TSB-1培养基分别为4×108 CCU/ml和7×108 CCU/ml，使用本发明低血清培养基培养绵羊肺炎支原体的活菌滴度明显高于改良KM2培养基、改良Thiaucourt's培养基和TSB-1培养基。低血清培养基大大减轻了疫苗中异源体血清对羊体的过敏应激反应，提高了生物安全；同时培养绵羊肺炎支原体活菌滴度明显高于现有技术培养基，降低了疫苗生产成本，为绵羊肺炎支原体优质疫苗的研制奠定了基础。
具体实施方式
本发明所用制剂来源：
PPLO肉汤：美国BD公司产品，货号为2625084。
丙酮酸钠：AMRESCO公司产品，货号为0342。
乳糖：百灵威科技有限公司产品，货号为307213。
胰蛋白胨：OXOID公司产品，货号为LP0042。
胰岛素：HUMOBIO公司产品，货号为HAK4570。
L-谷氨酰胺：sigma公司产品，货号为V900419。
L-半胱氨酸：AMRESCO公司产品，货号为J994。
水解乳蛋白：北京索莱宝科技有限公司产品，货号为L8100。
转铁蛋白：sigma公司产品，货号为T8158。
青霉素：为上海公谊兽药厂产品。
马血清：为Hyclone公司产品，货号为SH30074.03。
酚红：为sigma公司产品，货号为P3532。
质量浓度为1%的酚红的配制：称取酚红1.0 g，置玻璃研钵中，逐滴加入0.1M NaOH（0.4 g溶于10 ml去离子水），研磨至完全溶解。将溶解的酚红吸入100 ml量瓶中，用去离子水小心洗下研钵中残留酚红液至量瓶中，最后补加去离子水至100 ml。
质量浓度为25%的新鲜酵母浸出液的制备：取鲜酵母500 g，加入去离子水2000 ml中，搅拌溶解，用浓盐酸：去离子水以=1:1（体积比）调pH值至4.5-5.0，80℃水浴（瓶内温度）30分钟，3000 转/分离心20分钟，取上清液。将上清液用1 M NaOH（4 g溶于100 ml去离子水）调pH值至7.8-8.0，煮沸，置室温放凉后用双层滤纸过滤，再补去离子水至2000 ml，-20℃保存备用。
实施例1：
1、本发明培养基的制备：
基础培养基：
（1）PPLO肉汤 22.0 g
（2）丙酮酸钠 5.0 g
（3）质量浓度为1%的酚红 2.5 ml
（4）去离子水 650 ml。
辅助培养基：
（5）质量浓度为20%的乳糖 60ml
（6）质量浓度为10%的胰蛋白胨 60 ml
（7）质量浓度为25%的新鲜酵母浸出液 110 ml
（8）胰岛素（10 mg/ml） 1.0 ml
（9）质量浓度为3%的L-谷氨酰胺 16.5 ml
（10）质量浓度为10%的L-半胱氨酸 5.0 ml
（11）质量浓度为15%的水解乳蛋白 32.0 ml
（12）转铁蛋白（10 mg/ml） 1.0 ml
（13）青霉素 (20万IU/ml) 0.25 ml
（14）无菌马血清 50 ml
将基础培养基中（1）-（3）成分逐一溶入650ml去离子水（4）中，115℃高压灭菌20min后冷却至室温；取经0.22 微米滤膜滤过除菌的辅助培养基（5）-（14）成分，充分混合；无菌条件下将基础培养基和辅助培养基混合，用灭菌水补齐定容至1000ml，用灭菌的1M NaOH调pH值到7.4，充分摇匀后分装，置4℃保存备用。
实施例2：
本发明培养基的制备：
基础培养基：
（1）PPLO肉汤 22.5 g
（2）丙酮酸钠 5.0 g
（3）质量浓度为1%的酚红 2.5 ml
（4）去离子水 650 ml。
辅助培养基：
（5）质量浓度为20%的乳糖 60ml
（6）质量浓度为10%的胰蛋白胨 60 ml
（7）质量浓度为25%的新鲜酵母浸出液 110 ml
（8）胰岛素（10 mg/ml） 1.2 ml
（9）质量浓度为3%的L-谷氨酰胺 17 ml
（10）质量浓度为10%的L-半胱氨酸 5.0 ml
（11）质量浓度为15%的水解乳蛋白 34.0 ml
（12）转铁蛋白（10 mg/ml） 1.2 ml
（13）青霉素 (20万IU/ml) 0.25 ml
（14）无菌马血清50 ml
将基础培养基中（1）-（3）成分逐一溶入650ml去离子水（4）中，115℃高压灭菌20min后冷却至室温；取经0.22 微米滤膜滤过除菌的辅助培养基（5）-（14）成分，充分混合；无菌条件下将基础培养基和辅助培养基混合，用灭菌水补齐定容至1000ml，用灭菌的1M NaOH调pH值到7.4，充分摇匀后分装，置4℃保存备用。
实施例3：
应用本发明培养基、改良KM2培养基、改良Thiaucourt's培养基、TSB-1培养基对绵羊肺炎支原体Y98株进行比较试验：
1、本发明培养基的制备
基础培养基：
（1）PPLO肉汤 22.0 g
（2）丙酮酸钠 5.0 g
（3）质量浓度为1%的酚红 2.5 ml
（4）去离子水 650 ml。
辅助培养基：
（5）质量浓度为20%的乳糖 50ml
（6）质量浓度为10%的胰蛋白胨 60 ml
（7）质量浓度为25%的新鲜酵母浸出液 120 ml
（8）胰岛素（10 mg/ml） 1.0 ml
（9）质量浓度为3%的L-谷氨酰胺 16.5 ml
（10）质量浓度为10%的L-半胱氨酸 5.0 ml
（11）质量浓度为15%的水解乳蛋白 32.0 ml
（12）转铁蛋白（10 mg/ml） 1.0 ml
（13）青霉素 (20万IU/ml) 0.25 ml
（14）无菌马血清50 ml
将基础培养基中（1）-（3）成分逐一溶入650ml去离子水（4）中，115℃高压灭菌20min后冷却至室温；取经0.22 微米滤膜滤过除菌的辅助培养基（5）-（14）成分，充分混合；无菌条件下将基础培养基和辅助培养基混合，用灭菌水补齐定容至1000ml，用灭菌的1M NaOH调pH值到7.4，充分摇匀后分装，置4℃保存备用。
2、改良Thiaucourt's培养基的制备（1000ml）
基础液：
PPLO肉汤 21.0 g
去离子水 700 ml。
115℃高压灭菌20 min；
培养基：
基础液 700ml
50%丙酮酸钠 4.0 ml
50%葡萄糖 2.0 ml
质量浓度为1%的酚红 2.5 ml
质量浓度为25%的新鲜酵母浸出液 100 ml
青霉素（20万IU/ml） 1.0 ml
10%醋酸铊 1.0 ml
无菌马血清 200 ml
混合用灭菌的1M NaOH调pH值到7.4，经0.22 微米滤膜滤过除菌分装备用。
3、TSB-1培养基（1000ml）
胰蛋白胨大豆肉汤 30g
乳糖 10 g
DNA 0.02g
质量浓度为1%的酚红 2.5 ml
青霉素（20万IU/ml） 1.0 ml
10%醋酸铊 1.0 ml
无菌猪血清 200 ml
用去离子水定容至1000ml，用灭菌的1M NaOH调pH值到7.4，经0.22 微米滤膜滤过除菌分装备用。
4、改良KM2培养基（500ml）
1.7%水解乳蛋白Hank’s液 150 ml
MEM 2.5 g
葡萄糖 2.0 g
丙酮酸钠 1.0 g
质量浓度为1%的酚红 1.25 ml
25%新鲜酵母浸出液 10 ml
青霉素（20万IU/ml） 0.5 ml
10%醋酸铊 0.5 ml
无菌马血清 100 ml
用去离子水定容至500ml，用灭菌的1M NaOH调pH值到7.4，经0.22 微米滤膜滤过除菌分装备用。
5、绵羊肺炎支原体的培养 将绵羊肺炎支原体Y98株（购自中国兽医微生物菌种保藏中心CVCC，编号CVCC384）分别接种本发明低血清培养基（血清含量为5%）、改良KM2培养基（血清含量为20%）、改良Thiaucourt's培养基（血清含量为20%）、TSB-1培养基（血清含量为20%），种子继代复壮后，分别按10% (V/V) 的比例接种对应培养基，37℃恒温培养，当培养基的颜色变黄、pH值由7.4降至6.5～6.8时，无菌取出培养物。
6、活菌滴度（CCU）测定。方法如下：取12支试管，每管加对应培养基4.5 ml，在第1管中加入0.5 ml生长良好的绵羊肺炎支原体培养物，用振荡器充分混匀，换新的移液管，从第1管吸取0.5 ml加入到第2管中，依次进行10倍稀释至第11管，第11管中弃去0.5 ml培养液；得到培养液的稀释度分别为10-1-10-11，第12管为对应培养基对照。试验管设3个重复。将试管置37℃恒温培养箱中静置培养，每天观察颜色变化，连续观察10天，发生颜色变化的最高稀释度即为该培养物的活菌滴度，用颜色变化单位（CCU）表示。用3份样品的活菌滴度平均值表示平均生长滴度。试验重复3次。
7、结果：
绵羊肺炎支原体接种4种培养基3次生长试验CCU测定结果见表1。
试验结果显示，在同样条件下，使用本发明培养基、改良KM2培养基、改良Thiaucourt's培养基、TSB-1培养基培养绵羊肺炎支原体的生长时间均为48h。使用改良KM2培养基培养绵羊肺炎支原体3次CCU测定结果均为107CCU/ml,改良Thiaucourt's培养基培养绵羊肺炎支原体3次CCU测定结果为108 ～109 CCU/ml，平均滴度为4×108 CCU/ml；TSB-1培养基培养绵羊肺炎支原体的3次CCU测定结果为108 ～109CCU/ml，平均滴度为7×108 CCU/ml；使用本发明培养基培养绵羊肺炎支原体3次CCU测定结果为109～1010 CCU/ml，平均滴度为7×109 CCU/ml。同样条件下，使用本发明低血清培养基培养绵羊肺炎支原体的活菌滴度远远高于改良KM2培养基，分别是改良Thiaucourt's培养基和TSB-1培养基的17.5和10倍。结果说明，本发明的绵羊肺炎支原体培养基具有血清含量低、生长迅速和活菌滴度高的特点。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。