本发明涉及干细胞培养基
技术领域：
，具体涉及一种胚胎干细胞无血清培养基。
背景技术：
：胚胎干细胞(embryonicstemcell，escs，简称es、ek或esc细胞。)胚胎干细胞是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，es细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。胚胎干细胞研究在美国一直是一个颇具争议的领域，支持者认为这项研究有助于根治很多疑难杂症，因为胚胎干细胞可以分化成多种功能的apsc多能细胞，被认为是一种挽救生命的慈善行为，是科学进步的表现。而反对者则认为，进行胚胎干细胞研究就必须破坏胚胎，而胚胎是人尚未成形时在子宫的生命形式。由胚胎来源的原始(未分化)细胞，它们具有分化成为众多特异细胞类型的潜能。胚胎干细胞最诱人的前景和用途是生产组织和细胞，用于“细胞疗法”，为细胞移植提供无免疫原性的材料。任何涉及丧失正常细胞的疾病，都可以通过移植由胚胎干细胞分化而来的特异组织细胞来治疗。如用神经细胞治疗神经退行性疾病(帕金森病、亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默病等)，用胰岛细胞治疗糖尿病，用心肌细胞修复坏死的心肌等。胚胎干细胞还是基因治疗最理想的靶细胞。这里的基因治疗是指用遗传改造过的人体细胞直接移植或输入病人体内，达到控制和治愈疾病的目的。这种遗传改造包括纠正病人体内存在的基因突变，或使所需基因信息传递到某些特定类型细胞。cn100465268c中公开了一种人胚胎干细胞的培养方法及其专用培养基。该培养基配方为：n25-30ml，b2710-60ml，谷氨酰胺0.0146-0.73g，β-巯基乙醇5-10μl，非必需氨基酸中的一种或几种共计：3-30ml，碱性成纤维细胞生长因子20-200mg，小牛血清白蛋白0.2-0.8g；用dmem/f12定容至1000ml，ph7.2-7.8。该培养基成分确定，且无任何动物来源的成分，使用安全性高。该方法并不能特异性的针对分化为心肌细胞的用途。cn102994446b中公开了一种诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的诱导分化培养基，其特征在于，诱导剂由丹酚酸b和人参皂苷rgl组成；所述诱导分化培养基通过以下方法制得：诱导剂加入用于胚胎干细胞培养的分化培养基；其中，所述诱导剂中的丹酚酸b在所述诱导分化培养基中的浓度为104-105m，人参皂苷rgl在所述诱导分化培养基中的浓度为104-105m；所述用于胚胎干细胞培养的分化培养基由如下成分配制而成：gmem培养基，胎牛血清，非必须氨基酸，100mm的丙酮酸钠水溶液和10w的二巯基乙醇水溶液，其中gmem培养基：胎牛血清：非必需氨基酸：丙酮酸钠水溶液：二巯基乙醇水溶液的体积比＝77.9:20:1:1:0.1。诱导剂的使用浓度过高，对于生产以及细胞的安全性都有很严重的影响。cn104164402a中公开了一种人胚胎干细胞体外分化为功能性心肌细胞的新型培养方法，包括以下步骤:步骤i)拟胚体的形成:以浓度为(2～4)x15个/ml接种人胚胎干细胞至明胶包被的培养皿中，每天添加培养基并吹打,避免细胞贴壁,所用培养基为无血清拟胚体形成培养基，培养条件是37℃、5％c02和95％饱和湿度，第3天可形成拟胚体并悬浮在培养液中，第5_7天形成大量的拟胚体；步骤2)心肌细胞分化培养:收集拟胚体以i个/孔接种在12孔培养皿中，所用的心肌细胞分化培养基是以80％dmem培养基为基础培养基，添加20％血清替代品，并添加了多种诱导物质；每天更换一次分化培养基，并添加强化营养物质，培养条件为37℃、5％c02和95％饱和湿度的条件下静态培养；跳动心肌细胞在培养的第3天出现，大量的心肌细胞在培养的第5天出现跳动，当大面积观察到节律性搏动细胞团的出现即完成了心肌细胞的分化。该方法实质上只是步骤上的优化，对于干细胞培养基并没有特异性的优化，使得最终培养得到的分化细胞个树少，质量差，不适于大规模使用。另外，在前期的研究发现悬浮培养诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞具有一定的优势，但是分化效率仅为20.8％，分化时间14d左右。诱导率以及分化时间都还有待进一步提高。基于以上方法或培养基组成方面的不足，在利用培养基培养细胞在过程中，生长速度慢，容易出现老化的特征，从而影响细胞的大量扩增。而心肌细胞在用于临床治疗时对细胞数量有很大的要求，而且还必需在短时间内得到足够的细胞以满足治疗的需要，因此开发一种能够使得商用的人胚胎干细胞高质量的分化为心肌细胞变得迫在眉睫。技术实现要素：本发明的目的是针对现有技术的不足，提供培养人商业用的胚胎干细胞无血清培养基，能够提高人胚胎干细胞地生长速度，提高分化扩增速率，同时保证干细胞和心肌细胞生物学特性。为达到上述目的，本发明采取的技术方案是:提供一种商业用的人胚胎干细胞无血清分化培养基，其特征在于，由以下终浓度的各成分构成：l-谷氨酰胺2mmol/l、l丙酮酸钠0.2mmol/l、转铁蛋白6.5mg/l、亚硒酸钠30mg/l和人表皮细胞生长因子:0.15mg/l，纤连蛋白:0.3mg/l，细胞活性促进肽(序列如seqidno：1-2任一所示)浓度为50ppm，用dmem/f12(1：1)培养基进行配置。dmem/f12(1：1)培养基采用dmem和f12按溶液体积比1:1混合而成。本发明另外提供一种培养胚胎干细胞的方法，首先制备mef；其次，人胚胎干细胞的复苏、培养和传代；再次，人胚胎干细胞悬浮法制备eb以及分化；最后检测分化得到的心肌细胞状况。采用本发明提供的制备方法，具有以下有益效果:1、在分化培养基中由于不含有动物来源的血清，因此可以控制感染风险；2、在分化培养基中加入了特异性促进干细胞分化活性的小肽，使得细胞生长以及分化速度显著提高；3、制备得到的心肌细胞的生物学特性保持不变；4、经过试验验证的心肌细胞在保持了较长的时间内的生物学特性不发生改变。而且细胞的分化效率以及成活率都较高。附图说明图1转化率线图。最上面虚线为实施例1的转化率线；中间线为实施例2的转化率线，最底部的线为对照的转化率线具体实施方式下面结合实施例对本发明进行详细的描述，但它们不是对本发明的进一步限制。实施例1:第一种方法人胚胎干细胞的复苏、培养和传代培养；(1)取商业购买的人胚胎干细胞系(h9)，购买自江苏斯坦福生物技术有限公司。在水浴锅内迅速融化(20s之内)，加入到含20ml人胚胎干细胞培养基(由以下终浓度的各成分构成：l-谷氨酰胺2mmol/l、l丙酮酸钠0.2mmol/l、转铁蛋白6.5mg/l、亚硒酸钠30mg/l和人表皮细胞生长因子:0.15mg/l，纤连蛋白:0.3mg/l，细胞活性促进肽(序列如seqidno：1所示)终浓度为50pppm，用dmem/f12(1：1)培养基进行定容)的50ml离心管中，自然沉淀30min，吸去上清，用3ml培养基轻轻重悬沉淀后将重悬液加入到已经铺好mef的0.1％明胶处理过的6cm培养皿中。当人胚胎干细胞的克隆长满后，用200u/ml胶原酶w，37℃处理lomin后，挑起克隆碎片到mef铺好的6孔板中培养。(2)人胚胎干细胞悬浮法制备eb以及分化：人胚胎干细胞克隆用200u/ml胶原酶iv37℃处理lomin后，挑起克隆碎片转移到低粘附性培养皿中，悬浮培养以形成eb，悬浮培养基为：l-谷氨酰胺2mmol/l、l丙酮酸钠0.2mmol/l、转铁蛋白6.5mg/l、亚硒酸钠30mg/l和人表皮细胞生长因子:0.15mg/l，纤连蛋白:0.3mg/l，细胞活性促进肽(序列如seqidno：1所示)终浓度为50ppm，用dmem/f12(1：1)培养基进行配置定容；4d后将eb转移到基质胶处理过的6孔板中贴壁培养(2ebs/cm2)(培养基成分同悬浮培养基)，每天观察细胞跳动情况，大约5-10d后收获心肌细胞。实施例2:第二种方法人胚胎干细胞的复苏、培养和传代培养；(1)取商业购买的人胚胎干细胞系(h9)，购买自江苏斯坦福生物技术有限公司。在水浴锅内迅速融化(20s之内)，加入到含20ml人胚胎干细胞培养基(由以下成分构成：l-谷氨酰胺2mmol/l、l丙酮酸钠0.2mmol/l、转铁蛋白6.5mg/l、亚硒酸钠30mg/l和人表皮细胞生长因子:0.15mg/l，纤连蛋白:0.3mg/l，细胞活性促进肽(序列如seqidno：2所示)终浓度为50ppm，用dmem/f12(1：1)培养基进行定容)的50ml离心管中，自然沉淀30min，吸去上清，用3ml培养基轻轻重悬沉淀后将重悬液加入到已经铺好mef的0.1％明胶处理过的6cm培养皿中。当人胚胎干细胞的克隆长满后，用200u/ml胶原酶w，37℃处理lomin后，挑起克隆碎片到mef铺好的6孔板中培养。(2)人胚胎干细胞悬浮法制备eb以及分化：人胚胎干细胞克隆用200u/ml胶原酶iv37℃处理lomin后，挑起克隆碎片转移到低粘附性培养皿中，悬浮培养以形成eb，悬浮培养基为：l-谷氨酰胺2mmol/l、l丙酮酸钠0.2mmol/l、转铁蛋白6.5mg/l、亚硒酸钠30mg/l和人表皮细胞生长因子:0.15mg/l，纤连蛋白:0.3mg/l，细胞活性促进肽(序列如seqidno：2所示)终浓度为50ppm，用dmem/f12(1：1)培养基进行配置定容；4d后将eb转移到基质胶处理过的6孔板中贴壁培养(2ebs/cm2)(培养基成分同悬浮培养基)，每天观察细胞跳动情况，大约5-10d后收获心肌细胞。对照例采用文献：“悬浮培养诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞的研究中方法，李献帅等，心肺血管病杂志，第33卷，第1期，2014年1月，p93-97”的方法作为对照，具体实施步骤按照该文章记载的步骤和条件进行，其中干细胞来源与实施例1和2中的相同。实施例3分化转化效率分析从分化的第5天开始，每天镜下观察和记录克隆跳动的情况，以及跳动的频率，最后统计绘图如(图1)所示。可以看到，实施例1和实施例2所示的培养基能够使得跳动细胞在较短的时间内实现了干细胞向心肌细胞的转化达到了50％以上，而对照的方法在5天内没有心肌细胞的转化，直到第13天才实现9.9％的转化率，而实施例1和2实现了96.4％的转化率，具有非常显著高的转化率。通过统计，发现实施例1和2得到的心肌细胞大多数跳动克隆的频率分布在55-75次/min之间，跳动克隆的平均跳动频率为(67.86)次/min，具有较好的细胞活性。表1转化率表格实施例4心肌细胞凋亡检测采用本领域常用的凋亡试剂盒检测各组心肌细胞凋亡比例。实施例1和2以及对照的方法制备得到的心肌细胞，分别将跳动的心肌细胞经24h缺氧处理后hoechst33258染色，正常细胞的细胞核呈正常的蓝色，而凋亡细胞的细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，颜色有些发白。随机选择10个高倍镜视野(x100)进行统计，缺氧24h后跳动心肌细胞的凋亡比例结果如下：实施例1实施例2对照凋亡比例3.1±0.2％3.4±0.2％8.4±0.4％从检测结果可以看出，实施例1和2的方法得到的心肌细胞具有较好的细胞活性。另外，采用细胞耐久性试验，实施例1和2制备的人胚胎干细胞诱导出现跳动的心肌细胞持续跳动的时间在体外可以维持4.5个月以上。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表〈110〉朱猛〈120〉一种人胚胎干细胞分化专用的无血清培养基〈160〉2〈210〉1〈211〉26〈212〉prt〈213〉人工序列〈400〉细胞活性促进肽1pvqmrsfrhpkdyysfspnppyphwr〈160〉2〈210〉1〈211〉24〈212〉prt〈213〉人工序列〈400〉细胞活性促进肽2rqdqfafgddhgscqesithynas当前第1页12