本发明属于细胞培养领域，具体涉及将人源胚胎干细胞体外诱导为卵泡的方法及其所用培养基。
背景技术：
：：人源胚胎干细胞细胞系来源于原肠胚之前的人体胚胎，经过数代的培养形成的细胞系具有体外无限增殖，自我更新且具有多功能干性等特点。胚胎干细胞能分化为体内的三个胚层的细胞。胚胎干细胞体外定向分化的研究有助于了解胚胎发育的机制及为再生医学的临床研究提供方法。卵泡由卵母细胞及周围的卵泡颗粒细胞(granulosacell)组成，二者之间相互联系。卵泡的发育阶段大致可分为原始卵泡、初级卵泡、腔前卵泡、有腔卵泡，最终有腔卵泡排出成熟的可受精的卵细胞。大部分的原始卵泡会处于休眠期，每一个生殖周期会激活一些原始卵泡形成初级卵泡，但一般只有一个卵泡能最终成熟并排卵，这个过程同时伴随一部分原始卵泡的凋亡。技术实现要素：本发明的第一个目的是提供一种将胚胎干细胞体外诱导为卵泡的成套培养基。本发明提供的成套培养基包括培养基1、培养基2和培养基3；所述培养基1、所述培养基2和所述培养基3均为哺乳动物细胞分化培养基，所述培养基1含有骨形态发生蛋白4(bmp4)和骨形态发生蛋白8a(bmp8a)，所述培养基2含有gdf9:bmp15二聚体蛋白和表皮生长因子(egf)，所述培养基3含有生长分化因子9(gdf9)和骨形态发生蛋白15(bmp15)；所述gdf9:bmp15二聚体蛋白是由gdf9蛋白和bmp15蛋白组成的二聚体蛋白。所述培养基1中的骨形态发生蛋白4(bmp4)和骨形态发生蛋白8a(bmp8a)是单独的形式。所述培养基3中的生长分化因子9(gdf9)和骨形态发生蛋白15(bmp15)也是单独的形式。上述成套培养基中，所述成套培养基由成套使用的所述培养基1、所述培养基2、所述培养基3、培养基4和培养基5组成；所述培养基4是将滋养层细胞在胚胎干细胞培养基中培养后得到的培养基；所述培养基5是在所述培养基4中添加杀稻瘟菌素后得到的培养基。所述骨形态发生蛋白15的氨基酸序列为序列11；所述生长分化因子9的氨基酸序列为序列12。上述成套培养基中，所述胚胎干细胞培养基是将基础培养基、血清替代物、l-谷氨酰胺、甘氨酸、l-丙氨酸、l-天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、碱性成纤维细胞生长因子(fgf)、青霉素和链霉素混匀得到的液体培养基；所述哺乳动物细胞分化培养基是将基础培养基、胎牛血清、l-谷氨酰胺、甘氨酸、l-丙氨酸、l-天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、青霉素和链霉素混匀得到的液体培养基；所述培养基1是在所述哺乳动物细胞分化培养基中添加所述bmp4和所述bmp8a后得到的液体培养基；所述培养基2是在所述哺乳动物细胞分化培养基中添加所述gdf9:bmp15二聚体蛋白和所述egf后得到的液体培养基；所述培养基3是在所述哺乳动物细胞分化培养基中添加所述gdf9和所述bmp15后得到的液体培养基。上述成套培养基中所述bmp4在所述培养基1中的浓度为150ng/ml；所述bmp8a在所述培养基1中的浓度为50ng/ml；所述gdf9:bmp15二聚体蛋白在所述培养基2中的浓度为0.35ng/ml；所述egf在所述培养基2中的浓度为10ng/ml；所述gdf9在所述培养基3中的浓度为50ng/ml；所述bmp15在所述培养基3中的浓度为25ng/ml；所述杀稻瘟菌素在所述培养基5中的浓度为2μg/ml；所述血清替代物在所述胚胎干细胞培养基中的体积分数为20％；所述fgf在所述胚胎干细胞培养基中的浓度为8ng/ml；所述胎牛血清在所述哺乳动物细胞分化培养基中的体积分数为10％；所述l-谷氨酰胺在所述胚胎干细胞培养基和所述哺乳动物细胞分化培养基中的浓度均为1mm；所述甘氨酸在所述胚胎干细胞培养基和所述哺乳动物细胞分化培养基中的浓度均为7.5mg/l；所述l-丙氨酸在所述胚胎干细胞培养基和所述哺乳动物细胞分化培养基中的浓度均为8.9mg/l；所述l-天冬酰胺在所述胚胎干细胞培养基和所述哺乳动物细胞分化培养基中的浓度均为13.2mg/l；所述l-天冬氨酸在所述胚胎干细胞培养基和所述哺乳动物细胞分化培养基中的浓度均为13.3mg/l；所述l-谷氨酸在所述胚胎干细胞培养基和所述哺乳动物细胞分化培养基中的浓度均为14.7mg/l；所述l-脯氨酸在所述胚胎干细胞培养基和所述哺乳动物细胞分化培养基中的浓度均为11.5mg/l；所述l-丝氨酸在所述胚胎干细胞培养基和所述哺乳动物细胞分化培养基中的浓度均为10.5mg/l；所述青霉素在所述胚胎干细胞培养基和所述哺乳动物细胞分化培养基中的浓度均为100i.u；所述链霉素在所述胚胎干细胞培养基和所述哺乳动物细胞分化培养基中的浓度均为100μg/ml。上述成套培养基中，所述gdf9:bmp15二聚体蛋白是将表达gdf9蛋白和bmp15蛋白的载体转入细胞中表达得到的。所述表达gdf9蛋白和bmp15蛋白的载体具体为piggybac-gdf9-bmp15质粒，所述piggybac-gdf9-bmp15质粒是将序列3所示的dna片段(序列3第1-54位为信号肽序列，787-1218位为bmp15基因成熟肽编码基因序列)插入piggybac载体，且将序列4所示的dna片段(序列4第1-72位为信号肽序列，943-1461位为gdf9基因成熟肽编码基因序列)插入piggybac载体，且保持piggybac载体的其他序列不变得到的载体。所述细胞具体为293t细胞。所述gdf9:bmp15二聚体蛋白的具体制备方法如下：(1)将序列3所示的dna片段(序列3第1-54位为信号肽序列，787-1218位为bmp15基因成熟肽编码基因序列)插入piggybac载体，且将序列4所示的dna片段(序列4第1-72位为信号肽序列，943-1461位为gdf9基因成熟肽编码基因序列)插入piggybac载体，且保持piggybac载体的其他序列不变，得到piggybac-gdf9-bmp15质粒，该质粒同时表达gdf9蛋白和bmp15蛋白；(2)将piggybac-gdf9-bmp15质粒和聚醚酰亚胺共同转染293t细胞，转染后收集上清液。用minipellicon超滤系统将上清液置换成蛋白浓缩液；所述蛋白浓缩液为将gdf9蛋白和bmp15蛋白溶解在缓冲液中得到的溶液；(3)向步骤(2)中的蛋白浓缩液中加入抗c-myc琼脂糖耦联抗体，孵育，离心，弃上清液，收集琼脂糖耦联抗体；所述抗c-myc琼脂糖耦联抗体是用缓冲液对琼脂糖耦联抗体进行预处理得到的，所述预处理的具体方法如下：用缓冲液重悬琼脂糖耦联抗体，离心，弃上清液，洗3次，再用缓冲液进行重悬，得到抗c-myc琼脂糖耦联抗体；(4)清洗2次步骤(3)获得的琼脂糖耦联抗体，每次用缓冲液重悬，离心，弃上清液，再用缓冲液重悬；(5)向步骤(4)中重悬获得的蛋白浓缩液中加入tev蛋白酶进行消化处理，tev蛋白酶与蛋白浓缩液中的蛋白的质量比为1：50-1：200，孵育，离心，转移上清液至新管；(6)向步骤(5)中获得的上清液中加入抗flag琼脂糖耦联抗体(预处理步骤同上)，孵育，离心，弃上清液，收集琼脂糖耦联抗体；(7)清洗2次步骤(6)获得的琼脂糖耦联抗体，每次用1ml缓冲液重悬，离心，弃上清液，收集琼脂糖耦联抗体；然后用400μl3xflag-peptide重悬琼脂糖耦联抗体；孵育，离心，收集上清液，所述上清液中含有gdf9:bmp15二聚体蛋白。上述成套培养基中，所述基础培养基为knockouttmd-mem。本发明的第二个目的是提供将胚胎干细胞体外诱导为卵泡的产品。本发明提供的将胚胎干细胞体外诱导为卵泡的产品包括上述成套培养基、表达dazl的慢病毒和表达boule的慢病毒。所述表达dazl的慢病毒是将序列1所示的dazl基因插入到pentrtmdirectional载体的not1和asc1酶切位点间，然后用lr酶将序列1所示的dazl基因重组到p2k7病毒载体的attl1和attl2位点间，得到慢病毒载体dazl，然后与辅助质粒共同转染包装细胞293ft进行包装，得到表达dazl的慢病毒颗粒。所述表达boule的慢病毒为将序列2所示的boule基因插入到pentrtmdirectional载体的not1和asc1酶切位点间，然后用lr酶将序列2所示的boule基因重组到p2k7病毒载体的attl1和attl2位点间，得到慢病毒载体boule，然后与辅助质粒共同转染包装细胞293ft进行包装，得到表达boule的慢病毒颗粒。所述dazl蛋白的氨基酸序列为序列9；所述boule蛋白的氨基酸序列为序列10。本发明提供的将胚胎干细胞体外诱导为卵泡的产品还包括胚胎干细胞。本发明的第三个目的是提供下述a1或a2的制备方法：a1、上述成套培养基的制备方法，包括如下步骤：分别制备所述培养基1、所述培养基2、所述培养基3、所述培养基4和所述培养基5，再将所述培养基1、所述培养基2、所述培养基3、所述培养基4和所述培养基5分别进行独立包装，得到所述成套培养基；a2、上述产品的制备方法，包括如下步骤：将上述成套培养基、所述表达dazl的慢病毒和所述表达boule的慢病毒分别进行单独包装，得到所述产品。本发明的第四个目的是提供将胚胎干细胞体外诱导为卵泡的组合物。本发明提供的将胚胎干细胞体外诱导为卵泡的组合物为如下b1)-b3)中任一种：b1)由上述gdf9:bmp15二聚体蛋白和egf组成；b2)由细胞因子gdf9和bmp15组成；b3)由表达dazl的慢病毒和表达boule的慢病毒组成。本发明的第五个目的是提供将胚胎干细胞体外诱导为卵泡的成套试剂。本发明提供的将胚胎干细胞体外诱导为卵泡的成套试剂为如下c1)-c4)中任一种：c1)由上述b1)所示的组合物、上述b2)所示的组合物与上述b3)所示的组合物组成；c2)由上述b1)所示的组合物与上述b2)所示的组合物组成；c3)由上述b2)所示的组合物与上述b3)所示的组合物组成；c4)由上述b1)所示的组合物与上述b3)所示的组合物组成。所述成套试剂中的所述组合物配套使用。本发明的第六个目的是提供下述1)-7)中任一种应用：1)上述成套培养基在制备将胚胎干细胞体外诱导为卵泡的产品中的应用；2)上述成套培养基在将胚胎干细胞体外诱导为卵泡中的应用；3)上述产品在将胚胎干细胞体外诱导为卵泡中的应用；4)上述组合物在制备将胚胎干细胞体外诱导为卵泡的产品中的应用；5)上述组合物在将胚胎干细胞体外诱导为卵泡中的应用；6)上述成套试剂在制备将胚胎干细胞体外诱导为卵泡的产品中的应用；7)上述成套试剂在将胚胎干细胞体外诱导为卵泡中的应用。本发明的最后一个目的是提供将胚胎干细胞体外诱导为卵泡的方法。本发明的方法包括如下步骤：(1)用上述培养基1培养胚胎干细胞，得到第一次分化培养后细胞；(2)移除所述培养基1，在所述第一次分化培养后细胞中高表达dazl和boule外源基因，恢复培养，得到恢复培养后细胞；(3)在上述培养基2中培养所述恢复培养后细胞，得到第二次分化培养后细胞；(4)移除所述培养基2，在上述培养基3中继续培养所述第二次分化培养后细胞，得到卵泡。上述方法中，所述将胚胎干细胞体外诱导为卵泡的具体步骤如下：(d1)用上述培养基1培养胚胎干细胞1小时，得到第一次分化培养后细胞；(d2)移除所述培养基1，用所述表达dazl的慢病毒和所述表达boule的慢病毒共同转染所述第一次分化培养后细胞，得到转染后细胞；所述转染的时间为1天；(d3)在上述培养基4中恢复培养所述转染后细胞1天，得到第一次恢复培养后细胞；(d4)在上述培养基5中培养所述第一次恢复培养后细胞3天，然后再在所述培养基4中恢复培养1天，得到第二次恢复培养后细胞；(d5)移除所述培养基4，在上述培养基2中培养所述第二次恢复培养后细胞1天，得到第二次分化培养后细胞；(d6)移除所述培养基2，在上述培养基3中继续培养所述第二次分化培养后细胞，得到卵泡。本文中，胚胎干细胞可为离体的哺乳动物胚胎干细胞，如离体的人胚胎干细胞，具体可为人胚胎干细胞h9(xx)细胞系或人胚胎干细胞hsf6细胞系(xx)。本发明通过在人胚胎干细胞中高表达dazl和boule外源基因，同时加入gdf9和bmp15等生长因子进行内源刺激的方法，成功在体外获得人卵泡。本发明首次建立了人源胚胎干细胞向卵泡的体外分化方法。不仅突破了体外研究人早期生殖细胞发育及卵泡发生等发育机理的瓶颈，而且还为研究早期受精卵发育机理提供材料，也为治疗卵巢早衰等女性不孕症提供新的思路。附图说明图1为4n期细胞富集在高表达dazl和boule的细胞中。图1a为dna含量分析。空心线代表对照组，转染egfp和mcherry荧光蛋白的质粒(controlgroup，cg，linecurves)；实心线代表诱导组，转染dazl-ires-egfp(同时表达dazl和egfp)和boule-ires-mcherry(同时表达boule和mcherry)质粒(inducedgroup，ig，solidcurves)。其中，d5代表对照组第5天结果；d5’代表诱导组第5天结果；d6代表对照组第6天结果；d6’代表诱导组第6天结果；d7代表对照组第7天结果；d7’代表诱导组第7天结果；d8代表对照组第8天结果；d8’代表诱导组第8天结果。图1b为流式细胞点状图(facsplots)。图中分别显示普通胚胎干细胞系(图左)、对照组(图中)和诱导组(图右)中egfp单荧光、mcherry单荧光以及egfp和mcherry双荧光细胞群，用以区分表达不同基因的细胞群。nc代表不表达任何荧光的对照组细胞；c代表只表达mcherry细胞；g代表只表达egfp细胞；c+g代表同时表达mcherry和egfp细胞；ni代表不表达任何荧光的诱导组细胞；b代表只表达boule-ires-mcherry(同时表达boule和mcherry)的细胞；d代表只表达dazl-ires-egfp(同时表达dazl和egfp)的细胞；b+d代表同时表达boule-ires-mcherry和dazl-ires-egfp的细胞。图1c为第六天对照组(cg)和诱导组(ig)的dna含量分析结果。图2为体外诱导中的人源胚胎干细胞减数分裂进程的分析。图2a为对照组(ctrl)和诱导组(induced)中prdm9和γh2ax的荧光染色结果。图2b为对照组(ctrl)和诱导组(induced)中sycp3和γh2ax的荧光染色结果。图2c为诱导组(induced)中prdm9和γh2ax的荧光染色高倍镜结果。图中标尺(bar)：20μm。图2d为诱导组(induced)中sycp3和γh2ax的荧光染色高倍镜结果。图中标尺(bar)：20μm。图2e为诱导组(induced)中sycp3和mlh1的荧光染色高倍镜结果。图中标尺(bar)：10μm。图2f为第六天到第九天体外诱导减数分裂中同时表达prdm9和γh2ax的阳性细胞百分比图。每个时间点分析超过200个细胞核，误差线代表标准差。图2g为第七天细胞核的sycp3表达百分比堆砌条形图。其中，n代表没有sycp3表达；p代表点状sycp3表达；e代表条状sycp3表达，每组分析超过200个细胞核。图3为人卵泡(humanfollicle-likecells)体外分化。图3a为从未分化的胚胎干细胞(hesc)到诱导人卵泡(humanfollicle-likecells)的实验流程及简要步骤。图3b为第十一天未诱导的胚胎干细胞在相差显微镜下结果，形态学上与卵泡类似。图3c为第十一天诱导的胚胎干细胞在相差显微镜下结果，形态学上与卵泡类似。图3d为第十一天四个不同的人卵泡(humanfollicle-likecells)在相差显微镜高倍镜下结果，形态学上与卵泡类似。图3e为第十一天诱导的人卵泡(humanfollicle-likecells)在体式镜下结果，形态学上与卵泡类似。图3f为第十一天收集人卵泡(humanfollicle-likecells)在体式镜下结果。图3g为zp2荧光染色结果。图3h为nobox荧光染色结果。图3i为amh荧光染色结果。p.c.代表相差显微镜下结果。图3b、c、e和f的标尺：500mm；图3d的标尺：100mm；图3g、h和i的标尺：50mm。图4为人源类卵泡全基因组rna测序与反转录荧光定量pcr结果。图4a为人源胚胎干细胞(es)、自发分化的人源胚胎干细胞(sde)和人源卵泡(flc，flc_1来源于hsf6细胞系，flc_2来源于h9细胞系)的全基因组rna测序结果的非监督聚图(unsupervisedhierarchicalclustering)。图4b为人源胚胎干细胞(es)、自发分化的人源胚胎干细胞(sde)和人源卵泡(flc，flc_1来源于hsf6细胞系，flc_2来源于h9细胞系)的热图(heatmap)与基因本体(geneontology)分析。其中，左图是热图结果；右图是基因本体分析。图4c为自发分化的人源胚胎干细胞(sde)和人源卵泡(flc)转录组散点图。红色的点指示出在人源生殖组织(如卵子和颗粒细胞)中特异表达的基因会在卵泡样本中富集表达。图4d为30个卵泡的反转录荧光定量pcr结果。图5为人源类卵泡的小鼠肾包囊移植(mousekidneycapsules)结果。图5a为获得人源卵泡并做小鼠肾包囊移植的简要流程。红色箭头指示移植后的肾包囊组织。图5b为移植点附近的肾脏苏木精-伊红(h&estaining)染色结果。图5c为对照组(自发分化细胞的肾包囊移植)的苏木精-伊红(h&estaining)染色结果。图5d为实验组(人源卵泡肾包囊移植)的苏木精-伊红(h&estaining)染色结果。箭头指示初级卵泡结构。图5e为实验组的苏木精-伊红(h&estaining)染色高倍镜结果。双箭头指示gv(germinalvesicle)期卵泡样结构。图5f为nobox的荧光染色结果。图5g为amh荧光染色结果。图5b，c，d，e的标尺：50μm；图5f的标尺：10μm；图5g的标尺：20μm。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的人胚胎干细胞h9(xx)细胞系是wicell,inc.的产品。下述实施例中的人胚胎干细胞hsf6(xx)细胞系在“kee,k,etal.humandazl,dazandboulegenesmodulateprimordialgerm-cellandhaploidgameteformation.nature462.7270(2009):222.”文献中公开过，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。下述实施例中的滋养层细胞的制备方法如下：取怀孕13.5天icr品系小鼠胚胎，在体式显微镜下去掉头、尾巴、四肢及内脏，用手术刀切碎留下的肉块，用5mltrypletmexpress(货号12605010)消化10min，然后铺入用0.1％明胶(sigma，g6144)包被的175培养瓶中。用滋养层培养基培养(成分为dmem,10％fbs,甘氨酸7.5mg/l,l-丙氨酸8.9mg/l，l-天冬酰胺13.2mg/l,l-天冬氨酸13.3mg/l，l-谷氨酸酸14.7mg/l，l-脯氨酸11.5mg/l,l-丝氨酸10.5mg/l)，l-谷氨酰胺1mm，青霉素100i.u.，链霉素100μg/ml)，传代三次之后，用5mltrypletmexpress(货号12605010)消化5min，收集细胞，接着用滋养层培养基30ml重悬细胞，然后去清华大学辐射动物中心使用70gray计量辐射细胞15min。最后分装冻存，冻存液配方为10％dmso(sigam，货号：d2650，dmso为溶剂)和90％fbs。下述实施例中的培养基及其配方如下：1、胚胎干细胞培养基是将knockouttmd-mem(公司为invitrogen，货号为10829018)、血清替代物(knockoutserumreplacer)(knockouttmserumreplacement，货号：10828028)、l-谷氨酰胺(l-glutamine)、甘氨酸、l-丙氨酸、l-天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、人源fgfbasic(碱性成纤维细胞生长因子，r&dsystems)、青霉素和链霉素(penicillin-streptomycinsolution)混匀得到的培养基，溶剂为knockouttmd-mem，其余为溶质，其中各溶质在胚胎干细胞培养基中的浓度如下：血清替代物20％(体积分数)，l-谷氨酰胺1mm，甘氨酸7.5mg/l，l-丙氨酸8.9mg/l，l-天冬酰胺13.2mg/l，l-天冬氨酸13.3mg/l，l-谷氨酸14.7mg/l，l-脯氨酸11.5mg/l，l-丝氨酸10.5mg/l，人源basicfgf8ng/ml，青霉素100i.u.，链霉素100μg/ml。2、分化培养基是将knockouttmd-mem、胎牛血清(fbs)、l-谷氨酰胺、甘氨酸、l-丙氨酸、l-天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、青霉素和链霉素混匀得到的培养基，溶剂为knockouttmd-mem，其余为溶质，其中各溶质在分化培养基中的浓度为胎牛血清10％(体积分数)，l-谷氨酰胺1mm，甘氨酸7.5mg/l，l-丙氨酸8.9mg/l，l-天冬酰胺13.2mg/l，l-天冬氨酸13.3mg/l，l-谷氨酸14.7mg/l，l-脯氨酸11.5mg/l，l-丝氨酸10.5mg/l，青霉素100i.u.，链霉素100μg/ml。3、293ft细胞培养液是将dmem、胎牛血清(fbs)、l-谷氨酰胺、甘氨酸、l-丙氨酸、l-天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、青霉素和链霉素、1mm丙酮酸钠、10μg/ml遗传霉素混匀得到的培养基，溶剂为dmem，其余为溶质，其中各溶质在分化培养基中的浓度为胎牛血清10％(体积分数)，l-谷氨酰胺1mm，甘氨酸7.5mg/l,l-丙氨酸8.9mg/l，l-天冬酰胺13.2mg/l，l-天冬氨酸13.3mg/l，l-谷氨酸14.7mg/l，l-脯氨酸11.5mg/l，l-丝氨酸10.5mg/l(是在293ft培养基中的终浓度)，青霉素100i.u.，链霉素100μg/ml。4、无抗生素和遗传霉素的293ft细胞培养液是将dmem、胎牛血清(fbs)、l-谷氨酰胺、甘氨酸、l-丙氨酸、l-天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、丙酮酸钠混匀得到的培养基，溶剂为dmem，其余为溶质，其中各溶质在分化培养基中的浓度为胎牛血清10％(体积分数)，l-谷氨酰胺1mm，甘氨酸7.5mg/l,l-丙氨酸8.9mg/l，l-天冬酰胺13.2mg/l，l-天冬氨酸13.3mg/l，l-谷氨酸14.7mg/l，l-脯氨酸11.5mg/l，l-丝氨酸10.5mg/l，丙酮酸钠1mm。下述实施例中的如下细胞因子：骨形态发生蛋白4(bmp4)、骨形态发生蛋白8a(bmp8a)、人表皮生长因子(egf)、生长分化因子9(gdf9)和骨形态发生蛋白15(bmp15)均是r&dsystems的产品。下述实施例中的基质胶(matrigel)是corning公司的产品，货号为356234。下述实施例中的p2k7病毒载体在文献“suter,d.m.etal.rapidgenerationofstabletransgenicembryonicstemcelllinesusingmodularlentivectors.stemcells24,615–623，2006”中公开过，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。下述实施例中的免疫荧光检测中所使用的抗体及货号如表1所示。表1、免疫荧光检测中所使用的抗体及货号实施例1、人源胚胎干细胞体外诱导卵泡的方法一、人源胚胎干细胞培养及传代将未分化的人源胚胎干细胞h9(xx)传代到含有滋养层细胞的六孔板中，每个孔中加入3ml胚胎干细胞培养基，在37℃，5％co2培养箱中培养。每天换液，直到细胞克隆长到合适大小时继续传代。二、人源胚胎干细胞体外诱导卵泡1、诱导分化培养基的制备(1)诱导分化培养基1诱导分化培养基1是将分化培养基、bmp4和bmp8a混匀得到的培养基。其中，bmp4在诱导分化培养基1中的浓度为150ng/ml，bmp8a在诱导分化培养基1中的浓度为50ng/ml。(2)诱导分化培养基2诱导分化培养基2是将分化培养基、gdf9:bmp15二聚体蛋白和人源egf混匀得到的培养基。其中，gdf9:bmp15二聚体蛋白在诱导分化培养基2中的浓度为0.35ng/ml，人源egf在诱导分化培养基2中的浓度为10ng/ml。(3)诱导分化培养基3诱导分化培养基3是将分化培养基、gdf9和bmp15混匀得到的培养基。其中，gdf9在诱导分化培养基3中的浓度为50ng/ml，bmp15在诱导分化培养基3中的浓度为25ng/ml。(4)预处理胚胎干细胞培养基1预处理胚胎干细胞培养基是将滋养层细胞在胚胎干细胞培养基中培养24小时后，去除滋养层细胞，得到的培养基。(5)预处理胚胎干细胞培养基2预处理胚胎干细胞培养基2是将杀稻瘟菌素(blasticidin)(invitrogen，货号为r21001)混匀得到的培养基。其中，杀稻瘟菌素在预处理胚胎干细胞培养基2中的浓度为2μg/ml。2、表达dazl和boule慢病毒的制备(1)慢病毒载体的构建将序列1所示的dazl基因插入到pentrtmdirectional载体(公司为invitrogen，货号为k2400-20)的not1和asc1酶切位点间，然后用lr酶(cat.no.11791-020)将序列1所示的dazl基因重组到p2k7病毒载体(文献“suter,d.m.etal.rapidgenerationofstabletransgenicembryonicstemcelllinesusingmodularlentivectors.stemcells24,615–623，2006”中公开过，公众可从清华大学获得)的attl1(caactttgtacaaaaaagcag)和attl2(cagctttcttgtacaaagttg)位点间，得到慢病毒载体dazl。慢病毒载体dazl表达dazl蛋白。dazl蛋白的氨基酸序列为序列9。将序列2所示的boule基因插入到pentrtmdirectional载体的not1和asc1酶切位点间，然后用lr酶(cat.no.11791-020)将序列2所示的boule基因重组到p2k7病毒载体的attl1(caactttgtacaaaaaagcag)和attl2(cagctttcttgtacaaagttg)位点间，得到慢病毒载体boule。慢病毒载体boule表达boule蛋白。boule蛋白的氨基酸序列为序列10。(2)慢病毒载体的包装使用293ft细胞(invitrogen，货号为r70007)分别对步骤(1)中构建的慢病毒载体进行包装，分别得到表达dazl的慢病毒的病毒液和表达boule的慢病毒的病毒液。具体步骤如下：在包装前一天或两天传代293ft细胞，然后将该细胞传入铺有明胶包被的t175细胞培养瓶，加入293ft细胞培养液。待细胞生长至密度为80-90％时，将15ml的转染混合液加入至已经吸走培养液的t175细胞培养瓶中，于细胞培养箱中静置6小时。然后吸走转染混合液，加入无抗生素和遗传霉素的293ft细胞培养液25-30ml。于细胞培养箱中培养3天。最后将t175细胞培养瓶中的培养液转移到50ml离心管，2000rpm离心5分钟，使细胞碎片沉在底部，保留上清液并使用0.45μm规格的滤膜过滤病毒，得到病毒液。之后分装入细胞冻存管，-80℃保存。所述转染混合液的制备方法如下：将15ml的减血清培养基(货号为31985070，购买于thermofish公司)分为a液和b液两部分，其中，a液10ml，b液5ml。向a液中加入10μg的无内毒素病毒载体质粒(慢病毒载体)、10μg的vsvg质粒和15μg的δ8.9质粒(vsvg质粒和δ8.9质粒均在文献“suter,d.m.etal.rapidgenerationofstabletransgenicembryonicstemcelllinesusingmodularlentivectors.stemcells24,615–623，2006”中公开过，公众可从清华大学获得)，得到混合a液；b液中加入120μl的lipofectamine2000(invitrogen，货号为11668019)，得到混合b液。然后将混合a液和混合b液分别温柔混匀，室温静置5分钟。再将混合a液与混合b液温柔混匀，室温静置20分钟，得到15ml的转染混合液。3、gdf9:bmp15二聚体蛋白的制备(1)将序列3所示的dna片段(序列3第1-54位为信号肽序列，787-1218位为成熟bmp15基因序列)用无缝克隆试剂盒(clonesmaster公司，货号为c5891-50)并按照试剂盒中的说明书插入piggybac载体(piggybac载体在文献“guo,jianying,etal.aninduciblecrispr-onsystemforcontrollablegeneactivationinhumanpluripotentstemcells.protein&cell(2017):1-15.”中公开过，公众可从清华大学获得)，且将序列4所示的dna片段(序列4第1-72位为信号肽序列，943-1461位为成熟gdf9基因序列)用无缝克隆试剂盒插入piggybac载体，且保持piggybac载体的其他序列不变，得到piggybac-gdf9-bmp15质粒，该质粒同时表达gdf9蛋白和bmp15蛋白。bmp15蛋白的氨基酸序列为序列11；gdf9蛋白的氨基酸序列为序列12。(2)将1mg的piggybac-gdf9-bmp15质粒和4ml浓度为1mg/ml的聚醚酰亚胺溶液(polyetherimide，pei，货号23966-2，polyscience公司)共同转染1l密度为(1.5-2)×106的293t悬浮细胞中，转染5天后收集1l上清液。用minipellicon超滤系统将1l上清液置换成6-9ml蛋白浓缩液(蛋白浓缩液为将gdf9蛋白和bmp15蛋白溶解在缓冲液中得到的溶液，缓冲液配方为10nmhepes，150mmnacl，ph7.4)。(3)向步骤(2)中的蛋白浓缩液中加入250ul抗c-myc琼脂糖耦联抗体(antic-mycbeads)溶液，4℃孵育过夜，然后2000g离心3min，弃上清液，收集琼脂糖耦联抗体。抗c-myc琼脂糖耦联抗体溶液是用缓冲液对琼脂糖耦联抗体进行预处理得到的。预处理的具体方法如下：用1ml缓冲液重悬300μl的琼脂糖耦联抗体(abmart，m200125)，然后2000g离心3min，弃上清液，洗3次，再用400μl缓冲液进行重悬，得到抗c-myc琼脂糖耦联抗体溶液。(4)清洗2次步骤(3)获得的琼脂糖耦联抗体，每次用1ml缓冲液重悬，然后2000g离心3min，弃上清液，再用400μl缓冲液重悬。(5)向步骤(4)中重悬获得的蛋白浓缩液中加入tev蛋白酶(sigma，货号为t4455-1mg)进行消化处理，tev蛋白酶与蛋白浓缩液中蛋白的质量比(bca测蛋白浓度试剂盒，货号：23225，piercetm)为1：50-1：200，4℃孵育16小时。然后2000g离心3min，转移上清液至新管。(6)向步骤(5)中获得的400ul上清液中加入150ul抗flag琼脂糖耦联抗体(abmart，m20008，预处理步骤同上)，4℃孵育5h30min。然后2000g离心3min，弃上清液，收集琼脂糖耦联抗体。(7)清洗2次步骤(6)获得的琼脂糖耦联抗体，每次用1ml缓冲液重悬，2000g离心3min，弃上清液，收集琼脂糖耦联抗体。然后用400μl3xflag-peptide(sigma,400ug/ml)重悬琼脂糖耦联抗体。4℃孵育45min，2000g离心3min，转移上清液(含有gdf9:bmp15二聚体蛋白)至新管，调整浓度为0.35μg/ml。4、人源胚胎干细胞体外诱导卵泡的方法(1)将步骤一中大约为5×104个未分化的胚胎干细胞传代到基质胶(matrigel)(基质胶与knockouttmd-mem培养基的体积比为1:100)包被的六孔板中(覆盖面积约占一个孔的50％)，得到含有胚胎干细胞的六孔板。(2)向步骤(1)中的含有胚胎干细胞的六孔板中加入2ml诱导分化培养基1，在37℃，5％co2条件下培养1小时，得到第一次分化培养后细胞。(3)吸走诱导分化培养基1，将表达dazl的慢病毒的病毒液和表达boule的慢病毒的病毒液各0.5ml共同转染步骤(2)获得的第一次分化培养后细胞，在37℃，5％co2条件下处理1天。(4)吸走病毒液，向六孔板中加入2ml预处理胚胎干细胞培养基1，恢复培养1天。(5)吸走预处理胚胎干细胞培养基1，向六孔板中加入2ml预处理胚胎干细胞培养基2，培养3天，然后在预处理胚胎干细胞培养基1中恢复培养1天。(6)从加入病毒液起第七天时，吸走预处理胚胎干细胞培养基1，向六孔板中加入2ml诱导分化培养基2培养1天。(7)吸去诱导分化培养基2，向六孔板中加入3ml诱导分化培养基3继续培养，每三天换液，在相差显微镜下观察细胞形态，当观察到显微镜下出现如下描述的细胞群：中间一个可见的卵母细胞及周围有大量颗粒细胞围绕的三维结构，即获得卵泡。实施例2、验证卵泡的成功分化一、dna含量分析证明体外诱导的胚胎干细胞进入减数分裂1、对照组质粒的制备(1)egfp/mcherry质粒的制备按照实施例1步骤二的2中的慢病毒载体的构建方法，将序列1所示的dazl基因替换为序列5所示的egfp基因，构建得到表达egfp的慢病毒载体egfp；按照实施例1步骤二的2中的慢病毒载体的构建方法，将序列1所示的dazl基因替换为序列6所示的mcherry基因，构建得到表达mcherry的慢病毒载体mcherry。2、诱导组质粒的制备(1)dazl-ires-egfp质粒的制备按照实施例1步骤二的2中的慢病毒载体的构建方法，将序列1所示的dazl基因替换为序列7所示的dazl-ires-egfp基因，构建得到同时表达dazl和egfp的慢病毒载体dazl-ires-egfp；按照实施例1步骤二的2中的慢病毒载体的构建方法，将序列1所示的dazl基因替换为序列8所示的boule-ires-mchery，构建得到同时表达boule和mchery的慢病毒载体boule-ires-mchery。3、人源胚胎干细胞体外诱导卵泡按照实施例1步骤二的2中的慢病毒载体的包装方法，分别获得表达egfp的慢病毒的病毒液、表达mchery的慢病毒的病毒液、表达dazl和egfp的慢病毒的病毒液、表达boule和mchery的慢病毒的病毒液。(1)将实施例1步骤二的4(3)中的表达dazl的慢病毒的病毒液和表达boule的慢病毒的病毒液替换为表达egfp的慢病毒的病毒液，并按照实施例1中将人源胚胎干细胞体外诱导为卵泡的方法，对人源胚胎干细胞h9细胞系进行体外诱导，得到只表达egfp的细胞。(2)将实施例1步骤二的4(3)中的表达dazl的慢病毒的病毒液和表达boule的慢病毒的病毒液替换为表达mcherry的慢病毒的病毒液，并按照实施例1中将人源胚胎干细胞体外诱导为卵泡的方法，对人源胚胎干细胞h9细胞系进行体外诱导，得到只表达mcherry的细胞。(3)将实施例1步骤二的4(3)中的表达dazl的慢病毒的病毒液和表达boule的慢病毒的病毒液分别替换为表达egfp的慢病毒的病毒液和表达mcherry的慢病毒的病毒液，并按照实施例1中将人源胚胎干细胞体外诱导为卵泡的方法，对人源胚胎干细胞h9细胞系进行体外诱导，得到同时表达mcherry和egfp的细胞。(4)将实施例1步骤二的4(3)中的表达dazl的慢病毒的病毒液和表达boule的慢病毒的病毒液替换为表达dazl和egfp的慢病毒的病毒液，并按照实施例1中将人源胚胎干细胞体外诱导为卵泡的方法，对人源胚胎干细胞h9细胞系进行体外诱导，得到同时表达dazl和egfp的细胞。(5)将实施例1步骤二的4(3)中的表达dazl的慢病毒的病毒液和表达boule的慢病毒的病毒液替换为表达boule和mcherry的慢病毒的病毒液，并按照实施例1中将人源胚胎干细胞体外诱导为卵泡的方法，对人源胚胎干细胞h9细胞系进行体外诱导，得到同时表达boule和mcherry的细胞。(6)将实施例1步骤二的4(3)中的表达dazl的慢病毒的病毒液和表达boule的慢病毒的病毒液分别替换为表达dazl和egfp的慢病毒的病毒液、表达boule和mchery的慢病毒的病毒液，并按照实施例1中将人源胚胎干细胞体外诱导为卵泡的方法，对人源胚胎干细胞h9细胞系进行体外诱导，得到同时表达dazl、boule、mcherry和egfp的细胞。4、dna含量分析分别取自加入病毒液时起第5、6、7、8天后诱导得到的细胞，并对自加入病毒液时起第5、6、7、8天后诱导得到的细胞的dna含量进行分析。dna含量分析方法参考hoechst33342说明书(thermofish公司，货号为62249)中的方法。每组实验分析超过500,000个细胞，均有3次生物学重复。结果如图1a和图1c所示。其中，空心线代表对照组(只转染egfp和mcherry荧光蛋白的质粒)；实心线代表诱导组(转染dazl-ires-egfp和boule-ires-mcherry质粒；d5：对照组第5天结果；d5’：诱导组第5天结果；d6：对照组第6天结果；d6’：诱导组第6天结果；d7：对照组第7天结果；d7’：诱导组第7天结果；d8：对照组第8天结果；d8’：诱导组第8天结果。由于细胞进入减数分裂会有dna复制过程,细胞dna含量会翻倍，由原来的2n变为4n，图中荧光强度与dna含量成正比，2n代表细胞处于未开始dna复制时期，s代表dna开始复制但没有完成复制的时期，4n代表细胞完成dna复制准备进入减数分裂。结果表明：诱导组中，从第五天(d5)4n细胞比例上升，第6天最大，到第八天(d8)下降到与对照组持平，说明诱导组出现细胞进入减数分裂前dna复制的动态过程。第六天对照组(单独转染egfp或mcherry及一起转染egfp和mcherry荧光蛋白的质粒)(cg)和诱导组(ig)的dna含量分析结果表明：同时高表达dazl和boule的细胞群中处于s期和4n期细胞是最多的，说明dazl和boule同时表达能促进细胞进入减数分裂前期的dna复制过程。5、流式细胞分析采用流式细胞仪检测加入自加入病毒液时起第6天后诱导得到的细胞。流式细胞点状图(facsplots)如图1b所示。图中从左至右分别显示胚胎干细胞h9细胞系、对照组(cg，只转染egfp和mcherry荧光蛋白的质粒)和诱导组(ig)中egfp单荧光、mcherry单荧光以及egfp和mcherry双荧光细胞群，用以区分表达不同基因的细胞群。其中，nc:不表达任何荧光的对照组细胞；c:只表达mcherry细胞；g:只表达egfp细胞；c+g:同时表达mcherry和egfp细胞；ni:不表达任何荧光的实验组细胞；b:只表达boule-ires-mcherry(同时表达boule和mcherry)的细胞；d:只表达dazl-ires-egfp(同时表达dazl和egfp)的细胞；b+d:同时表达boule-ires-mcherry和dazl-ires-egfp的细胞。从图中可以看出：单独表达egfp，单独表达mcherry和同时表达egfp及mcherry的细胞可以清楚的被流式细胞仪分群，结合图1c说明了同时表达dazl-ires-egfp及boule-ires-mcherry的细胞具有最多比例的细胞处在s及4n期。二、蛋白染色分析证明体外诱导的胚胎干细胞进入减数分裂1、供试细胞的制备(1)诱导组细胞实施例1中的方法诱导得到的卵泡。(2)对照组细胞将人源胚胎干细胞h9细胞系按照实施例1步骤二的4中的方法进行诱导培养，培养中，将诱导分化培养基1、诱导分化培养基2和诱导分化培养基3均替换为分化培养基，且将步骤(3)中的表达dazl的慢病毒的病毒液和表达boule的慢病毒的病毒液替换为p2k7病毒载体，且其他步骤不变，得到对照组细胞。2、免疫荧光染色借助减数分裂铺展技术(meioticspread)分别对诱导组和对照组细胞进行细胞铺展，并进行免疫荧光染色(prdm9和γh2ax的荧光染色、sycp3和γh2ax荧光染色、sycp3和mlh1荧光染色)，每组分析超过200个细胞核，误差线代表标准差，以上所有实验均有三次生物学重复。试验方法参考文献“kee,k.,angeles,v.t.,flores,m.,nguyen,h.n.,andreijopera,r.a.(2009).humandazl,dazandboulegenesmodulateprimordialgerm-cellandhaploidgameteformation.nature462,222–225.”中的方法。其中，免疫荧光染色步骤简述如下：收集细胞加入4％多聚甲醛固定15分钟后吸弃，加入含有0.25％tritonx-100的pbs透膜10分钟，之后吸弃，室温使用含有10％驴血清的pbs封闭1小时，之后按照1:10，100的比例加入一抗，室温1小时或4℃过夜。然后吸走含有一抗的封闭液(保存留下次使用)，加入pbs清洗3遍，每次5分钟。接下来操作需要严格避光：按照1:1000比例加入荧光二抗，室温1小时，吸走，加入pbs清洗3遍，每次5分钟。加入终浓度100ng/mldapi染料，室温10分钟，吸走，加入pbs清洗3遍，每次5分钟。置于荧光显微镜下观察并拍照。细胞铺展简述如下：细胞用trypletmexpress(货号12605010)消化离心，500g离心5min，用pbs清洗一次，500g离心5min，1mlheb1(30mmtrisph8.2，50mm蔗糖，17mm柠檬酸，5mmedta，2.5mmdtt，1mmpmsf，ddh2o为溶剂，最后调ph8.2-8.4)重悬，避光冰上孵育30min。500g离心5min，然后用heb2(heb1+蔗糖0.1m)100μl重悬细胞，然后1000rpm离心三分钟将细胞甩到载玻片上。接着4％多聚甲醛固定15分钟后吸弃，加入含有0.1％tritonx-100的pbs透膜10分钟，吸去，接着0.04％photo-flo(kodak，货号1464510)处理5min，接着孵育抗体方法同蛋白荧光染色。荧光染色结果如图2所示。图2a和图2c为prdm9和γh2ax的荧光染色结果，从图中可以看出：诱导组细胞表达减数分裂特异表达的蛋白prdm9及dna双链断裂蛋白γh2ax。图2b和图2d为sycp3和γh2ax的荧光染色结果，从图中可以看出：诱导组细胞表达减数分裂联会复合体蛋白sycp3及dna双链断裂蛋白γh2ax。图2e为sycp3和mlh1的荧光染色高倍镜结果，从图中可以看出：诱导组细胞表达减数分裂特异蛋白，指示细胞进入减数分裂。图2f为诱导第6天到第9天体外诱导减数分裂中同时表达prdm9和γh2ax的阳性细胞百分比图，从图中可以看出：体外诱导的细胞分化过程中有一个减数分裂瞬时发生的动态过程。每个时间点分析超过200个细胞核。图2g为诱导第7天细胞核的sycp3表达百分比堆砌条形图，其中，n代表没有sycp3表达，p代表点状sycp3表达，e代表条状sycp3表达，从图中可以看出：约20-30％体外诱导的细胞表达减数分裂联会复合体蛋白sycp3。三、从形态学和特异蛋白表达染色水平上证明卵泡的成功分化使用相差显微镜观察胚胎干细胞(h9)和按照实施例1中的方法自加入病毒液时起诱导11天后的已出现的卵泡的形态。结果如图3所示。图3b为第十一天诱导的胚胎干细胞在相差显微镜下结果，形态学上与卵泡类似。图3c为第十一天诱导的胚胎干细胞在相差显微镜下结果，形态学上与卵泡类似。图3d为第十一天四个不同的诱导的卵泡在相差显微镜高倍镜下结果，形态学上与卵泡类似。图3e为第十一天诱导的人卵泡在体式镜下结果，形态学上与卵泡类似。图3f为第十一天收集卵泡在体式镜下结果。所有的卵泡改为卵泡上述结果表明：从形态学上鉴定从胚胎干细胞体外成功分化出卵泡。四、从特异蛋白表达染色水平上证明卵泡的成功分化对实施例1中诱导得到的卵泡中的特异蛋白zp2、卵细胞特异蛋白nobox、颗粒细胞特异蛋白amh按照上述步骤二中的方法进行免疫荧光染色。结果如图3所示。图3g为zp2荧光染色结果，从图中可以看出：在蛋白水平上证明分化的卵泡表达卵细胞特异蛋白zp2；图3h为nobox荧光染色结果。从图中可以看出：在蛋白水平上证明分化的卵泡表达卵细胞特异蛋白nobox。图3i为amh荧光染色结果，从图中可以看出：在蛋白水平上证明分化的卵泡含有颗粒细胞特异蛋白amh。五、从转录水平上证明体外成功分化出卵泡1、供试细胞的制备(1)对照组细胞随机选取两个人源胚胎干细胞h9，分别将其记作es1和es2。随机选取两个步骤二的1中的(2)的对照组细胞，分别将其记作sde1和sde2。(2)人源卵泡按照实施例1中的方法，将胚胎干细胞hsf6细胞系诱导为卵泡，将得到的卵泡记作flc_1；按照实施例1中的方法，将胚胎干细胞h9细胞系诱导为卵泡，将得到的卵泡记作flc_2。2、转录组测序委托北京诺禾致源科技股份有限公司公司分别对步骤1中的供试细胞进行转录组测序，序列分析参考文献“trapnell,c.,pachter,l.,andsalzberg,s.l.(2009).tophat:discoveringsplicejunctionswithrna-seq.bioinformatics25,1105–1111.”中方法。图4a为供试细胞的全基因组rna测序结果的非监督聚图(unsupervisedhierarchicalclustering)，从图中可以看出：在全基因组转录水平上卵泡单独聚类不与自发分化的细胞和胚胎干细胞聚类。图4b为人源胚胎干细胞(es)、自发分化的人源胚胎干细胞(sde)和人源卵泡(flc_1和flc_2的热图(heatmap)与基因本体(geneontology)分析。左图是热图结果，显示出不同组的细胞有不同的基因表达谱；右图是基因本体分析，显示不同组细胞参与不同的生物学过程。从图中可以看出：卵泡在转录组水平上表达多个生殖进程的基因。图4c为自发分化的人源胚胎干细胞(sde)和人源卵泡(flc)的转录组散点图。红色的点指示出在人源生殖组织(如卵子和颗粒细胞)中特异表达的基因会在卵泡样本中富集表达，说明体外分化的卵泡表达卵细胞和颗粒细胞的特异基因。3、反转录荧光定量pcr分别以30个卵泡(实施例1中制备得到的卵泡，30个重复)的rna为模板进行反转录荧光定量pcr，分别检测sohlh2、zp2、nobox、h1foo、cyp19a和rspo1的转录水平。以gapdh为内参基因，将上述步骤二的1中的(2)的对照组细胞作为对照。每组至少有三个生物学重复，误差线显示的是标准差。表2、引物序列基因前引物后引物gapdhtgttgccatcaatgaccccttctccacgacgtactcagcgcyp19agtggacgtgttgacccttctcaactcagtggcaaagtccasohlh2ggttgtatttcagggcatggcgaactctgacaacgaagcazp2tcttcttcgcccttgtgactctcagggtgagcttttctggnoboxgccagaaagctggagagaagcagttcctcactctgagtgtrspo1aagtgctcacccaagctgttttcacattgcgcaggactach1foogtgaaaaaggcagccaagagctgtaggcctcagcatctcc图4d为30个卵泡的反转录荧光定量pcr结果。结果表明：sohlh2、zp2、nobox、h1foo、cyp19a和rspo1的转录水平明显高于等量细胞的对照组，说明体外分化的卵泡表达卵细胞和颗粒细胞的特异基因。六、人源卵泡的小鼠肾包囊移植进一步证明体外分化的卵泡具有人卵泡的发育特性1、肾包囊移植将小鼠(icr品系)腹腔打开，将人源卵泡(实施例1中制备得到的卵泡)注射到小鼠肾包囊部位，然后收集移植后的肾包囊组织(图5a)。并且以步骤二的1中的(2)的对照组细胞作为对照。肾包囊移植步骤具体参考文献“chen,b.etal.recoveryoffunctionaloocytesfromculturedpremeioticgermcellsafterkidneycapsuletransplantation.stemcellsdev.22,567–580(2013).”中的方法。2、苏木精-伊红(h&estaining)染色取移植后的肾包囊组织进行苏木精-伊红(h&estaining)染色，染色的具体步骤参考文献“chen,b.etal.recoveryoffunctionaloocytesfromculturedpremeioticgermcellsafterkidneycapsuletransplantation.stemcellsdev.22,567–580(2013).”中的方法。图5b为移植点附近的肾脏苏木精-伊红(h&estaining)染色结果。图5c和图5d分别为对照组(自发分化细胞的肾包囊移植)和实验组(人源卵泡肾包囊移植)的苏木精-伊红(h&estaining)染色结果。箭头指示初级卵泡结构。图5e为实验组的苏木精-伊红(h&estaining)染色高倍镜结果。双箭头指示gv(germinalvesicle)期卵泡样结构。以上所有的苏木精-伊红(h&estaining)染色从形态学上证明体外分化的卵泡移植入体内之后依然维持卵泡的结构与发育特性。3、nobox和amh的荧光染色分别取移植后的肾包囊组织进行nobox和amh的免疫荧光染色，免疫荧光的具体步骤同上。每个移植实验有三次生物学重复。图5f为nobox的荧光染色结果。从图中可以看出：nobox荧光与卵泡样结构的细胞核共定位。图5g为amh的荧光染色结果。从图中可以看出：amh荧光围绕在卵泡样结构周围，与颗粒细胞共定位。以上荧光染色结果从蛋白水平上证明卵泡移植入体内之后依然维持卵泡的结构与发育特性。序列表<110>清华大学<120>将人源胚胎干细胞体外诱导为卵泡的方法及其所用培养基<160>12<210>1<211>948bp<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1atggcggctccctcgtgtggcggcgacagaaaagctcgcctgacgccatctttgccgcac60gagtctactgcaaatcctgaaactccaaactcaaccatctccagagaggccagcacccag120tcctcatcagctgcaaccagccaaggctatattttaccagaaggcaaaatcatgccaaac180actgtttttgttggaggaattgatgttaggatggatgaaactgagattagaagcttcttt240gctagatatggttcagtgaaagaagtgaagataatcactgatcgaactggtgtgtccaaa300ggctatggatttgtttcattttttaatgacgtggatgtgcagaagatagtagaatcacag360ataaatttccatggtaaaaagctgaagctgggccctgcaatcaggaaacaaaatttatgt420gcttatcatgtgcagccacgtcctttggtttttaatcatcctcctccaccacagtttcag480aatgtctggactaatccaaacactgaaacttatatgcagcccacaaccacgatgaatcct540ataactcagtatgttcaggcatatcctacttacccaaattcaccagttcaggtcatcact600ggatatcagttgcctgtatataattatcagatgccaccacagtggcctgttggggagcaa660aggagctatgttgtacctccggcttattcagctgttaactaccactgtaatgaagttgat720ccaggagctgaagttgtgccaaatgaatgttcagttcatgaagctactccaccctctgga780aatggcccacaaaagaaatctgtggaccgaagcatacaaacggtggtatcttgtctgttt840aatccagagaacagactgagaaactctgttgttactcaagatgactacttcaaggataaa900agagtgcatcactttagaagaagtcgggcaatgcttaaatctgtttga948<210>2<211>852bp<212>dna<213>人工序列<220><223><400>2atgcaaacagattcattatctccatcccctaatcctgtgtcacctgtgcctttgaataac60ccaacaagtgccccaagatatggaacagtgatccctaatcgcatctttgtaggaggaatt120gattttaagacaaacgaaagtgatttaagaaaatttttttcccagtatgggtctgtgaaa180gaagtgaagattgtaaatgacagagctggagtatccaaagggtatggtttcgtcactttt240gaaacacaagaagatgcacaaaaaattttacaagaggctgaaaaacttaattataaggat300aagaagctgaacattggtccagcaataagaaaacaacaagtagggatccctcgttctagt360ataatgccagcagctggaacaatgtatctaacaacttcaactggatatccttatacttac420cataatggtgttgcttattttcatactccagaggtaacttcggtcccaccgccttggcct480tcacgttctgtatgtagctcccctgtgatggtagctcagcccatttatcagcaacctgca540tatcactaccaggccaccacacagtatttaccaggacagtggcagtggagtgttcctcag600ccttctgcctcttctgctccattcttatacctgcaaccttctgaggttatttatcaacca660gtggaaattgcacaggatggtggatgtgttcctcctccactgtctctgatggaaacttca720gttccagagccttattctgatcatggagttcaagcaacatatcaccaggtttatgctcca780agtgccatcactatgcctgcgcctgtgatgcagcctgagccaattaaaacagtgtggagc840attcattattaa852<210>3<211>1218bp<212>dna<213>人工序列<220><223><400>3atggtcctcctcagtattcttagaattctttttctttgtgaactcgtgcttttcatggaa60cacagggcccaaatggcagaaggagggcagtcctctattgcccttctggctgaggcccct120actttgcccctgattgaggagctgctagaagaatcccctggcgaacagccaaggaagccc180cggctcctagggcattcactgcggtacatgctggagttgtaccggcgttcagctgactcg240catgggcaccctagagagaaccgcaccattggggccaccatggtgaggctggtgaagccc300ttgaccaatgtggcaaggcctcacagaggtacctggcatatacagatcctgggctttcct360ctcagaccaaaccgaggactataccaactagttagagccactgtggtttaccgccatcat420ctccaactaactcgcttcaatctctcctgccatgtggagccctgggtgcagaaaaaccca480accaaccacttcccttcctcagaaggagattcctcaaaaccttccctgatgtctaacgct540tggaaagagatggatatcacacaacttgttcagcaaaggttctggaataacaagggacac600aggatcctacgactccgttttatgtgtcagcagcaaaaagatagtggtggtcttgagctc660tggcatggcacttcatccttggacattgccttcttgttactctatttcaatgatactcat720aaaagcattcggaaggctaaatttcttcccaggggcatggaggagttcatggaaagggaa780tctcttcaccgcagcaagcgcagcctgagcggcggcgactacaaggacgacgacgacaag840caagcagatggtatctcagctgaggttactgcctcttcctcaaaacatagcgggcctgaa900aataaccagtgttccctccaccctttccaaatcagcttccgccagctgggttgggatcac960tggatcattgctccccctttctacaccccaaactactgtaaaggaacttgtctccgagta1020ctacgcgatggtctcaattcccccaatcacgccattattcagaaccttatcaatcagttg1080gtggaccagagtgtcccccggccctcctgtgtcccgtataagtatgttccaattagtgtc1140cttatgattgaggcaaatgggagtattttgtacaaggagtatgagggtatgattgctgag1200tcttgtacatgcagatga1218<210>4<211>1461bp<212>dna<213>人工序列<220><223><400>4atggcacgtcccaacaaattcctcctttggttttgctgctttgcctggctgtgttttcct60attagccttggttctcaggcttctgggggagaagctcagattgctgctagtgctgagttg120gaatctggggctatgccttggtccttgctgcagcatatagatgagagagacagagctggc180ctccttcccgcgcttttcaaagttctatctgttgggcgaggtgggtcacctaggctgcag240ccagactccagagctttgcactacatgaagaagctctataagacatatgctaccaaggaa300gggattcctaaatccaatagaagtcacctctacaacactgttcggctcttcaccccctgt360acccggcac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