一种测定黑果枸杞花粉活力的方法与流程

技术领域：
：本发明涉及一种植物花粉活力的测定方法，特别涉及一种茄科枸杞属植物黑果枸杞花粉活力的方法。
背景技术：
：：黑果枸杞(lyciumruthenicum)为茄科枸杞属多棘刺灌木，在我国西北荒漠区广泛分布，在干旱荒漠区风沙治理、盐渍化治理中发挥着极为重要的作用。黑果枸杞果实富含蛋白质、枸杞多糖等多种营养成分，药用价值远远高于普通红枸杞，被誉为植物“软黄金”。在长期自然选择和不同生态环境作用下,该植物天然群体内存在着极为丰富的表型变异,其中有些变异具有很高的经济价值。为了更好的利用黑果枸杞,发掘其优良类型潜力,选育黑果枸杞优良品种,对提高种植效益和荒漠化治理有着重要的现实意义。在植物常规育种中，花粉活力测定是必不可少的基础性工作。测定花粉活力主要有三类方法：花粉染色法、田间授粉法和花粉离体培养法。花粉染色法快速、方法简单，但被染色的花粉未必萌发，不一定会升出花粉管，因此，染色法测定的花粉活力往往偏高，结果不可靠；田间授粉法是在田间进行的杂交育种实验，该方法可靠、直接，但费时费力，且受环境影响较大，难以满足生产需要；花粉离体培养法快速、简单、准确度也高。当前有关黑果枸杞花粉活力测定的研究主要集中在花粉染色法，而离体培养法未见相关报道。申请人通过离体培养法，筛选测定黑果枸杞花粉活力的最佳培养基，为黑果枸杞育种工作提供理论依据和技术指导。技术实现要素：：本发明提供一种测定黑果枸杞花粉活力的方法，所述方法包括以下步骤：步骤1，收集黑果枸杞花粉；步骤2，将黑果枸杞花粉置于盛有培养液的凹面载玻片上进行离体培养；步骤3，离体培养结束后，统计花粉萌发数；其中，步骤1所述收集黑果枸杞花粉，方法如下：剪取已全面开放的新鲜花枝，带回实验室自然阴干。其中，步骤2所述离体培养，方法如下：取凹面载玻片，用滴管吸取配制好的培养基2～3滴，滴于凹面载玻片上，用毛笔蘸取少量阴干的花粉播于凹面载玻片上。取已灭过菌的培养皿，底部垫上湿润的滤纸，将凹面载玻片放到盛有湿润滤纸的培养皿上进行培养。其中，步骤3所述统计花粉萌发数，方法如下：培养后，将凹面载玻片置于光学显微镜下观察花粉萌发情况。步骤2所述培养基的组成为：蔗糖120～210g/l，硼酸10～40mg/l，氯化钙5-20mg/l；培养基的配制方法如下：取蔗糖、硼酸、氯化钙混合均匀，配制成上述不同浓度的液体培养基。优选的，所述培养基的组成为：蔗糖170-190g/l，硼酸15～25mg/l，氯化钙5-15mg/l；最优选的，所述培养基的组成为：蔗糖180g/l，硼酸20mg/l，氯化钙10mg/l；步骤2中，所述离体培养的时间为：5h～15h；所述离体培养的温度为：20℃～40℃。优选的，所述离体培养的时间为：8-12h；所述离体培养的温度为：30℃～40℃。最优选的，所述离体培养的时间为：10h；所述离体培养的温度为：35℃。本发明的花粉的离体培养法是测定花粉活力的有效方法，结果可重复性高。花粉的萌发是反映花粉活力的指标之一，花粉的萌发能力通常以花粉萌发率来表示，通过统计花粉的萌发率可以测定花粉的活力。离体培养的培养基、培养温度和培养时间是影响准确率的主要因素，本发明对培养基、培养温度、培养时间进行了优化，能快速、准确的测定黑果枸杞的花粉活力。以下通过实验数据说明本发明对培养条件的考察：培养基的筛选：培养效果由以上实验结果可知，本发明的蔗糖的浓度优选为180g/l，硼酸的优选浓度为20mg/l氯化钙的优选浓度为10mg/l。在确定了培养基配方后，进行了以下培养条件的筛选：培养温度的筛选：温度20℃25℃30℃35℃萌发率11.40％15.80％20.50％26.40％由以上实验结果可知，本发明的最佳培养温度是35℃。培养时间的筛选：时间4h6h8h10h12h萌发率8.76％9.38％11.19％26.40％16.16％由以上实验结果可知，本发明的最佳培养时间是10个小时。通过上述实验并对对培养条件的考察，得出了本发明最优选的以下培养条件：蔗糖是花粉萌发和花粉管伸长的主要营养物质来源，本发明蔗糖的浓度优选为180g/l。硼酸能够增加花粉对蔗糖的吸收、转运和代谢，促进花粉的萌发和花粉管生长，本发明硼酸的优选浓度为20mg/l。氯化钙是促进花粉管的正常生长，本发明氯化钙的优选浓度为10mg/l。以上所述的最佳培养时间是10个小时；以上所述的最佳培养温度是35℃；本发明黑果枸杞花粉活力测定方法的有益效果为：提供了一种用花粉离体培养对黑果枸杞花粉活力进行测定的方法，这种方法操作简单、可操作性强、数据科学可靠，并可完全定量，对提高黑果枸杞育种工作效率具有重要意义。附图说明：图1为实例1培养基培养4h的图像；图2为实例1培养基培养6h的图像；图3为实例1培养基培养10h的图像。具体实施方式：实施例1:(1)将已开花未开裂散粉的黑果枸杞花药放入装有硫酸纸的干燥培养皿中，将培养皿置于室内24h，花粉散出。(2)用毛笔蘸取适量花粉抖入凹面载玻片，轻轻滴加含有蔗糖180g/l,硼酸20mg/l,氯化钙10mg/l的培养液2～3滴，轻轻混匀。(3)将凹面载玻片放入盛有湿润滤纸的培养皿中，置于35℃的环境中培养10h。(4)轻轻取出载玻片，置于40倍显微镜下观察花粉萌发情况，视野内观察具有活力的花粉萌发出花粉管。(5)挑选5个视野，计算5个视野的萌发率的平均值即为花粉的萌发率，萌发率为26.40％。实施例2：(1)将已开花未开裂散粉的黑果枸杞花药放入装有硫酸纸的干燥培养皿中，将培养皿置于室内24h，花粉散出。(2)用毛笔蘸取适量花粉抖入凹面载玻片，轻轻滴加含有蔗糖120g/l,硼酸10mg/l,氯化钙5mg/l的培养液2～3滴，轻轻混匀。(3)将凹面载玻片放入盛有湿润滤纸的培养皿中，置于35℃的环境中培养10h。(4)轻轻取出载玻片，置于40倍显微镜下观察花粉萌发情况，视野内观察具有活力的花粉萌发出花粉管。(5)挑选5个视野，计算5个视野的萌发率的平均值即为花粉的萌发率，萌发率为15.07％。实施例3：(1)将已开花未开裂散粉的黑果枸杞花药放入装有硫酸纸的干燥培养皿中，将培养皿置于室内24h，花粉散出。(2)用毛笔蘸取适量花粉抖入凹面载玻片，轻轻滴加含有蔗糖150g/l,硼酸20mg/l,氯化钙10mg/l的培养液2～3滴，轻轻混匀。(3)将凹面载玻片放入盛有湿润滤纸的培养皿中，置于35℃的环境中培养10h。(4)轻轻取出载玻片，置于40倍显微镜下观察花粉萌发情况，视野内观察具有活力的花粉萌发出花粉管。(5)挑选5个视野，计算5个视野的萌发率的平均值即为花粉的萌发率，萌发率为18.24％。当前第1页12