专利名称：一种快速微量测定糖化酶活力的方法
技术领域：
本发明是涉及生物化学分析方法及微生物菌株筛选方法，具体的说是一种快速微量测定糖化酶活力的方法，属于化学检测技术领域。
背景技术：
糖化酶全称是葡萄糖淀粉酶(GlucoamylaseEC. 3. 2. 1. 3)又称为淀粉α -1，4葡萄糖苷酶，Y淀粉酶。在发酵行业中主要用作将淀粉转化为葡萄糖，所以习惯上被称为糖化酶。糖化酶不仅用于酒类和酒精生产及制取葡萄糖浆，还广泛地用于抗生素、氨基酸、有机酸的生产。在糖化酶生产及糖化酶菌株筛选过程中需要测定糖化酶活力，而国标法测定糖化活力，是采用硫代硫酸钠滴定法测定酶解产物中还原糖含量，需要体系较大，所用试剂需要标定，程序烦琐，耗时较长，测定一个样品需要一个小时，而采用DNS法直接测定，需要稀释很高倍数，造成误差较大，这对于高通量测定糖化酶活力以及糖化酶的性质研究是不利的。
发明内容
本发明提供一种快速微量测定糖化酶活力的方法，其目的是解决了现有糖化酶检测方法存在的检测程序烦琐、耗时较长或需要稀释很高倍数，造成误差较大等缺欠。本发明的快速微量测定糖化酶活力的方法，包括以下步骤
1)96孔板内葡萄糖标准曲线的制备
取烘干至恒重的葡萄糖lg，用去离子水溶解，容量瓶定容至IOOmL,制备lOmg/mL葡萄糖储备液；分别将其稀释成 lmg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/ mL葡萄糖溶液；取8只EP管，分别加入100 μ 1去离子水，再分别加入上述不同浓度的葡萄糖稀释液50 μ 1，最后加入200 μ IDNS溶液，沸水浴准确反应5min，迅速取出，放入冰水浴中 2min,从每只反应管内取出20 μ 1，加入到96孔板内，再加入250 μ 1去离子水，用枪头吹打几次，混合均勻后用酶标仪在540nm处测定其吸光度值，建立葡萄糖浓度与OD值的标准曲线.
一入 ，
2)取A、B两支EP管，分别加入m可溶性淀粉溶液500μ 1和0. 05Μ的ρΗ4. 6醋酸缓冲液100 μ 1，漩涡混合器混均，于(40士0. 2) °C温水浴中预热5 10min ；在B管中加入待测酶液40 μ 1，立即计时，混均；在此温度下准确反应30min后，立即向A、B两管中加IM Na0H20 μ 1，混均后，同时将两管取出，迅速放入冰水浴中，冷却，并于A管中补加热变性的酶液(将酶液沸水浴5min) 40 μ 1，作为空白对照；
3)另取两只EP管，分别加入100μ 1去离子水，吸取上述Α、Β两管溶液各50 μ 1，分别加入到两只EP管内，并加入200 μ IDNS溶液，沸水浴准确反应5min取出，放入冰水浴中2min， 从每只反应管内取出20 μ 1，加入到96孔板内，再加入250 μ 1去离子水，用枪头吹打几次， 混合均勻后用酶标仪在540nm处测定其OD值，根据步骤1)制备的96孔板内葡萄糖与OD 值标准曲线计算其还原糖含量；再根据下列公式计算糖化酶活力； 糖化酶活力(U/mL) =(B-A)拉*16· 5*N 式中，
B为总还原糖含量； A为对照管中还原糖含量； B-A为酶反应生成还原糖含量； 2为反应30min，换算成Ih酶活力系数； 16. 5为换算成ImL的反应体系； N为稀释倍数。注试剂的调配和待测酶液的稀释请参照中华人民共和国国家标准/食品添加剂 Il糖化酶制剂GB8276-2006，中国标准出版社。本发明的积极效果在于克服了传统滴定法和DNS法测定糖化酶活力的缺点，即 传统的滴定法需要配制和标定不同试剂，程序烦琐，且滴定终点需要目测，人为误差严重， 而DNS法测定商品酶活力时需要稀释很高的倍数才能使释放的还原糖控制在线性范围内， 稀释很高倍数后会增加测定误差。本发明不需要稀释很高倍数即可测定糖化酶活力并且操作程序简单，实现了 96孔板高通量快速测定。
图1为本发明96孔板内葡萄糖含量与OD值标准曲线图。
具体实施例方式通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。实施例1
1)葡萄糖标准曲线的制备
取烘干至恒重的葡萄糖lg，用去离子水溶解，容量瓶定容至IOOmL,制备lOmg/mL葡萄糖储备液。分别将其稀释成 lmg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/ mL葡萄糖稀释液。取8只EP管，分别加入100 μ 1去离子水，再分别加入上述不同浓度的葡萄糖稀释液50 μ 1，最后加入200 μ IDNS溶液，沸水浴准确反应5min，迅速取出，放入冰水浴中^iiin,从每只反应管内取出20 μ 1，加入到96孔板内，再加入250 μ 1去离子水，用枪头吹打几次，混合均勻后用酶标仪在MOnm处测定其吸光度值，建立葡萄糖浓度与OD值的关系曲线，实验结果如图1所示。从图1可以看出，葡萄糖浓度在lmg/mL、mg/mL，其浓度与OD值成线性关系，对其进行线性回归，得出相关系数R=O. 9996。实施例2
1)取A、B两支EP管，分别加入2%可溶性淀粉溶液500 μ 1，和0.05M，ρΗ4. 6的醋酸缓冲液100 μ 1，漩涡混合器混均，于(40士0.2) °C温水浴中预热^lOmin ；在B管(反应管) 中加入待测酶液S (山东淄博国奥集团公司)40μ 1，立即计时，混均；在此温度下准确反应30min后，立即向A、B两管中加IM的NaOH 20 μ 1，混均后，同时将两管取出，迅速放入冰水浴中，冷却，并于A管(对照管)中补加热变性的酶液S (将酶液沸水浴5min) 40 μ 1，作为空白对照；
2)另取两只EP管，分别加入100 μ 1去离子水，吸取上述Α、Β两管溶液各50 μ 1，分别加入到两只EP管内，并加入200 μ IDNS溶液，沸水浴准确反应5min取出，放入冰水浴中2min， 从每只反应管内取出20 μ 1，加入到96孔板内，再加入250 μ 1去离子水，用枪头吹打几次， 混合均勻后用酶标仪在MOnm处测定OD值，根据标准曲线计算其还原糖含量。再根据糖化酶活力计算公式计算糖化酶活力。3)葡萄糖标准曲线的制备参照实施例1。4)糖化酶活力计算公式
糖化酶活力(U/mL) =(B-A)拉*16· 5*N
式中，B:总还原糖含量，Α:对照管中还原糖含量。B-A酶反应生成还原糖含量，2 反应 30min，换算成Ih酶活力系数。16. 5 换算成ImL的反应体系。N 稀释倍数。连续平行测量5次，实验及统计结果见表1 表1 酶液S 5次测量的实验结及统计结果
权利要求
1. 一种快速微量测定糖化酶活力的方法，包括以下步骤1)96孔板内葡萄糖标准曲线的制备取烘干至恒重的葡萄糖lg，用去离子水溶解，容量瓶定容至IOOmL,制备lOmg/mL葡萄糖储备液；分别将其稀释成 lmg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/ mL葡萄糖溶液；取8只EP管，分别加入100 μ 1去离子水，再分别加入上述不同浓度的葡萄糖稀释液50 μ 1，最后加入200 μ IDNS溶液，沸水浴准确反应5min，迅速取出，放入冰水浴中 2min,从每只反应管内取出20 μ 1，加入到96孔板内，再加入250 μ 1去离子水，用枪头吹打几次，混合均勻后用酶标仪在540nm处测定其吸光度值，建立葡萄糖浓度与OD值的标准曲线.一入 ，2)取A、B两支EP管，分别加入m可溶性淀粉溶液500μ 1和0. 05Μ的ρΗ4. 6醋酸缓冲液100 μ 1，漩涡混合器混均，于(40士0.2) °C温水浴中预热flOmin;在B管中加入待测酶液40 μ 1，立即计时，混均；在此温度下准确反应30min后，立即向A、B两管中加IM Na0H20 μ 1，混均后，同时将两管取出，迅速放入冰水浴中，冷却，并于A管中补加热变性的酶液(将酶液沸水浴5min) 40 μ 1，作为空白对照；3)另取两只EP管，分别加入100μ 1去离子水，吸取上述Α、Β两管溶液各50 μ 1，分别加入到两只EP管内，并加入200 μ IDNS溶液，沸水浴准确反应5min取出，放入冰水浴中2min， 从每只反应管内取出20 μ 1，加入到96孔板内，再加入250 μ 1去离子水，用枪头吹打几次， 混合均勻后用酶标仪在540nm处测定其OD值，根据步骤1)制备的96孔板内葡萄糖与OD 值标准曲线计算其还原糖含量；再根据下列公式计算糖化酶活力； 糖化酶活力(U/mL) =(B-A)拉*16· 5*N 式中，B为总还原糖含量； A为对照管中还原糖含量； B-A为酶反应生成还原糖含量； 2为反应30min，换算成Ih酶活力系数； 16. 5为换算成ImL的反应体系； N为稀释倍数。
全文摘要
本发明提供一种快速微量测定糖化酶活力的方法，取A、B两支EP管，分别加入可溶性淀粉溶液和醋酸缓冲液混均；在B管中加入待测酶液混均反应后，向A、B两管中加NaOH混均后冷却，A管中补加热变性的酶液作为空白对照；另取两只EP管，分别加入去离子水，吸取上述A、B两管溶液分别加入到两只EP管内，加入DNS溶液，沸水浴反应取出，冷却后加入到96孔板内，加去离子水混合均匀后用酶标仪在540nm处测定其OD值，根据葡萄糖与OD值标准曲线即可计算其还原糖含量。本发明解决了现有糖化酶检测方法存在的检测程序烦琐、耗时较长或需要稀释很高倍数，造成误差较大等缺欠。
文档编号G01N21/31GK102286610SQ201110198999
公开日2011年12月21日 申请日期2011年7月16日 优先权日2011年7月16日
发明者刘洋, 唐芳荣, 孟兆丽, 徐云, 相宏宇, 谢秋宏 申请人:吉林大学