本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种兽用d型产气荚膜梭菌毒素及其制备方法与专用培养基。
背景技术：
：羊快疫、猝狙、羔羊痢疾和肠毒血症是分别由腐败梭菌、c型产气荚膜梭菌、b型产气荚膜梭菌和d型产气荚膜梭菌引起的羊常见多发性传染病[1、陆承平.兽医微生物学[m].北京：中国农业出版社,2013:192-202.]，它们常常合并发生，病程急剧，发病动物常常不出现症状即行死亡，死亡率高，危害大。因此，免疫接种是控制这些疫病的唯一有效途径。欧美、澳大利亚等畜牧业发达国家均把牛羊的四种疫病作为必须免疫预防的疫病，并有多种含有预防这些疫病成分的疫苗投放市场[2、animalandplanthealthinspectionservice,usda.9cfrch.i(1-1-07edition)[s].washington:u.s.governmentprintingoffice,2007.3、britishpharmacopoeia(veterinary)[s].london:thestationeryoffice,2005.]。我国也采取免疫接种的方法预防这些疫病并取得了良好的效果。我国目前用于预防这些疫病的疫苗有羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗(液体苗)、羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗(液体苗)和羊梭菌病多联干粉疫苗(干粉苗)[4、中国兽药典委员会编.中华人民共和国兽药典二○一○年版三部[s].北京：中国农业出版社,2011.5、农业部兽用生物制品规程委员会编.中华人民共和国兽用生物制品规程二○○○版[s].北京：化学工业出版社,2000.]，预防效果确实。据2015年批签发统计，年产量达2.5亿头份，但实际需要远大于此。年产值约2500万元到3000万元。然而，目前市场上使用的疫苗普遍以牛肉和肝脏的酶消化液为原材料来制备培养基，用这种方法制备培养基其制备过程繁琐、耗时长、需要人力多，尤为重要的是常因原材料质量参差不齐出现产毒性能不稳定的现象，这影响了疫苗的质量，也给疫苗生产带来了极大的浪费和高额的成本。技术实现要素：本发明的一个目的是提供一种d型产气荚膜梭菌产毒培养基及配制方法。所述d型产气荚膜梭菌产毒培养基，每100ml培养基由下述物质组成：大豆蛋白胨1～1.5g，酪蛋白胨1～1.5g，酵母浸粉0.5～0.75g，na2hpo4·12h2o0.5～0.75g、糊精1～1.5g，余量为水；所述培养基的ph值为8.0～8.5。所述d型产气荚膜梭菌产毒培养基的配制方法，包括下述步骤：除糊精外，将组成所述培养基的各物质均用水溶解，混合后加入适量的水，并调节ph值至8.0～8.5，然后加入糊精并充分搅匀，最后用水定容至100％，灭菌，即得。上述方法中，在溶解物质的过程中，可通过加热的方式使物质充分溶解和/或加速溶解。上述方法中，所述调节ph值具体可采用10m的氢氧化钠溶液进行调节。上述方法中，所述灭菌的条件为116℃灭菌30min。上述方法中，所述水优选为纯化水。本发明的另一个目的是提供一种兽用d型产气荚膜梭菌毒素的制备方法。所述兽用d型产气荚膜梭菌毒素的制备方法，包括下述步骤：将d型产气荚膜梭菌生产菌株接种于权利要求1所述d型产气荚膜梭菌产毒培养基中进行培养，收集培养物并离心，然后收集上清液，并将上清液过滤，所得滤液即为兽用d型产气荚膜梭菌毒素。所述d型产气荚膜梭菌生产菌株具体可为兽用d型产气荚膜梭菌c60-2菌株(cvcc编号：60201)和c60-3菌株(cvcc编号：82)，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心(www.cvcc.org.cn，简称cvcc)。所述培养在三角瓶中进行，所述培养的条件为：35～37℃培养17～18h。所述培养在发酵罐中进行，所述培养的条件为：发酵罐以全程控制ph值为7.0±0.05，以35～37℃共培养19～20h。上述方法中，所述接种是指将种子液接种于所述d型产气荚膜梭菌产毒培养基中。所述种子液的接种量为1～2％。所述种子液的制备方法为：将真空度良好的含有冻干菌种的安瓿，无菌操作打开，接种厌气肉肝汤，置37℃培养17～19小时，经纯粹检验合格者作为一级种子。将一级种子按1％接种量接种厌气肉肝汤，置37℃培养6～8小时，经纯粹检验合格者作为二级种子，即为所述种子液。上述方法制备得到的d型产气荚膜梭菌毒素也属于本发明的保护范围。本发明的再一个目的是提供上述d型产气荚膜梭菌毒素的应用。本发明提供的d型产气荚膜梭菌毒素的应用是其在制备d型产气荚膜梭菌类毒素疫苗中的应用；所述d型产气荚膜梭菌类毒素疫苗具体可选自下述至少一种：(1)羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗(液体苗)、(2)羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗(液体苗)、(3)羊梭菌病多联干粉灭活疫苗(干粉苗)。本发明以商品化蛋白胨、酵母粉等成品作为原材料替代原有质量不可控的牛肉、牛肝等原材料，通过筛选培养基配方并优化产毒素培养条件，使培养基的产毒能力达到甚至超过原有规程标准并具备较高的可重复性，来制备兽用d型产气荚膜梭菌毒素。本发明通过筛选获得了以下述各组分物质的质量配比(按生产1000ml培养基成品计算)为基础的产毒培养基：大豆蛋白胨10～15g、酪蛋白胨10～15g、酵母浸粉5～7.5g、na2hpo4·12h2o5～7.5g、糊精10～15g，纯化水加至1000ml。该培养基用三角瓶或发酵罐培养均产毒能力强，产毒性能稳定，质量可控，配制使用方便，价格低廉。本发明分别在家兔和绵羊上对疫苗的效果进行了评价。结果用本发明制备的d型产气荚膜梭菌类毒素疫苗，可保护家兔和绵羊免受该型毒素的攻击，血清中和效价也超过了《中国兽药典》的相应标准。本发明具有如下优点(详细结果可参见附表1-3)：本发明涉及兽用d型产气荚膜梭菌毒素及其制备方法与应用。本发明所使用的培养基及使用方法，配制简单(由原肉肝胃酶消化汤所需30小时缩减为5小时即可)，成本降低(综合成本降为原肉肝胃酶消化汤的1/5)。按本发明方法毒力最高可提至《中国兽用生物制品规程》制苗标准的45倍。所研制的培养基用三角瓶培养毒力达到10000mld/ml(c60-2菌株)，用发酵罐培养毒力可达到23000mld/ml(c60-2菌株)、60000mld/ml(c60-3菌株)，均超过了《兽用生物制品规程》的制苗标准(0.0005～0.00075ml/mld)。本发明的产出投入比提高至原传统工艺的30～225倍。并且，用其制备的类毒素疫苗可以在家兔和绵羊上产生有效的免疫保护，在家兔和绵羊上的相应血清中和效价也分别提高至规程标准的8.3和13.3倍。本发明用于替换现有肉肝胃酶消化汤(见附注1)用于羊肠毒血症灭活疫苗的生产具有广阔的前景。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所采用的d型产气荚膜梭菌生产菌株为兽用d型产气荚膜梭菌c60-2菌株(cvcc编号：60201)和c60-3菌株(cvcc编号：82)，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心(www.cvcc.org.cn，简称cvcc)。下述实施例中所采用的厌气肉肝汤组成及制备方法如下：组成：制法：1、取牛肉除去脂肪和筋膜，用绞肉机绞碎，与切成100g左右的肝块混合，加蒸馏水，充分搅拌后，冷浸20～24小时。2、煮沸20～60分钟，补足失去的水分，用白布滤过，弃去肉渣，取出肝块。3、滤液加入蛋白胨和氯化钠，加热融化，以氢氧化钠溶液调整ph7.8～8.0，加热煮沸10～20分钟。4、用滤纸或绒布滤过，加入葡萄糖搅拌，使其融化。5、将煮过的肝块洗净，切成小方块，用蒸馏水充分冲洗后，分装于试管或中性玻璃瓶内，其量为预计分装肉肝汤量的1/10。6将滤液分装于含有肝块的中性容器中(如为试管，还应加入适量液体石蜡)，以116℃灭菌30～40分钟。用途供一般厌气菌培养及检验用。用于菌种保存时，不加葡萄糖。下述实施例中所采用的明胶缓冲液组分及配制方法蒸馏水1000ml明胶2gna2hpo4·12h2o9.25gnah2po4·2h2o8.34g制法明胶蒸汽融化后，混合、煮开、滤过，116℃灭菌30分钟备用。实施例1、d型产气荚膜梭菌产毒培养基的筛选(1)设计了三种不同的培养基配方：配方1：大豆蛋白胨15g，酪蛋白胨15g，酵母浸粉5g，葡萄糖5g，纯化水加至1000ml。配方2：示蛋白胨10g，酪蛋白胨10g，酵母浸粉15g，氯化钠4g，碳酸钠0.6g，氯化钙0.1g，胱氨酸2g，葡萄糖10g，纯化水加至1000ml。配方3：大豆蛋白胨10g，酪蛋白胨10g，酵母浸粉5g，na2hpo4·12h2o5g，糊精10g，纯化水加至1000ml。(2)配制培养基除糊精、葡萄糖外，按上述含量分别称取或量取各组分物质，加入纯化水，加热充分溶解，添加纯化水将其定容至配制所需的终体积，用10m氢氧化钠调ph值至7.5～8.0。配方3按需要量加入糊精，充分搅匀。116℃灭菌30min。葡萄糖按终浓度在接种前加入所需体积的50％葡萄糖溶液。(3)细菌培养及毒素的制备将真空度良好的含有冻干菌种的安瓿，无菌操作打开，接种厌气肉肝汤，置37℃培养17～19小时，经纯粹检验合格者作为一级种子。将一级种子按1％接种量接种厌气肉肝汤，置37℃培养6～8小时，经纯粹检验合格者作为二级种子。将二级种子以1％的接种量分别接种以上三种不同配方的产毒培养基，置37℃培养17～19小时。培养完成后将菌液3000r/min离心30min，弃菌体沉淀留上清，将上清用0.22μm滤膜过滤，经接种厌气肉肝汤无菌生长即作为毒素，分装成1ml的小份置-80℃冰冻保存，每次取1小份融化后用于测毒。(4)测定培养完成后菌液中毒素对小白鼠的毒力取毒素融化后，用明胶缓冲液按如下方法稀释后尾静脉注射16～18g小白鼠，每滴度注射2只，每只注射0.2ml，观察小鼠在注射后72h内的死亡情况。能使小鼠发生2/2死亡的最小毒素量即为腐败梭菌毒素对小鼠的mld。(5)三种不同配方的产毒结果汇总：由以上结果可知，配方1、2、3分别经8次重复试验的毒力为0.00025～0.0005ml、0.0005～0.00075ml、0.000075～0.00025ml毒素原液，配方3产毒能力最强、配方1次之、配方2最弱，均达到了原《中华人民共和国兽用生物制品规程》二○○○年版规定羊三联四防苗中d型产气荚膜梭菌0.0005～0.00075ml毒素原液的制苗标准，而配方3产毒能力最强甚至超过了《规程》的0.0001～0.00025ml毒素原液的毒力标准。结果表明，配方3培养基产毒能力最强，重复性好，可作为d型产气荚膜梭菌制苗用首选产毒培养基。实施例2、d型产气荚膜梭菌产毒培养基配制及使用方法的优化(1)三角瓶培养条件的优化以三角瓶静置培养的方式分别对培养温度、初始ph值、培养时间进行优化，确定最优条件为“培养基初始ph值为8.0～8.5，以35～37℃培养17～18h”。用优化后的条件进行三角瓶培养的毒力结果表由上表可知，按本发明方法毒力最高可提至规程制苗标准的10倍。(2)发酵罐培养条件的优化以发酵罐培养的方式分别对控制ph值、培养时间、补糖进行优化，确定最优培养工艺为“培养基初始糊精为1～2％，初始ph值为8.0～8.5，发酵全过程控制ph值为7.0±0.05，以37℃共培养19～20h”。用优化后的条件进行发酵罐培养的毒力结果表由上表可知，按本发明方法毒力最高可提至《中国兽用生物制品规程》制苗标准的45倍。实施例3、d型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备及效力评价取培养完成的细菌培养物，按体积加入0.7％甲醛溶液(40％)，置35℃灭活脱毒5天。取灭活脱毒菌液接种厌气肉肝汤、普通肉汤、普通琼脂斜面，观察5日均无菌生长表明灭活完全；同时灭活脱毒菌液3000r/min离心30min，弃菌体沉淀留上清，将上清用0.22μm滤膜过滤，尾静脉注射16～18g小白鼠2只，每只注射0.4ml，观察3日均健活表明脱毒完全。取灭活脱毒完全的菌液，3000r/min离心30min，弃沉淀，留上清(类毒素)置4℃保存备用。取类毒素加入装有高压灭菌铝胶的瓶中，再添加生理盐水定容至所需体积，加10m氢氧化钠调ph值至6.8，使铝胶的终浓度为20％，使类毒素的含量为2000mld/ml。振摇混匀，置4℃冰箱保存备用。d型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的效力评价(1)类毒素疫苗在家兔上的效力评价取制备好的类毒素疫苗，颈背部皮下注射1.5～2.0kg家兔，每滴度注射4只，共四个滴度组：0.1ml(200mld)、0.3ml(600mld)、0.5ml(1000mld)、0.75ml(1500mld)。免疫后18日，对家兔进行耳中动脉采血制备血清，用血清中和法测定对d型产气荚膜梭菌毒素的血清中和效价。免疫后21日，对家兔攻击1mld的d型产气荚膜梭菌毒素，观察5日，记录攻毒保护结果。d型产气荚膜梭菌类毒素对家兔的效力评价结果注：“*”该组家兔在饲养过程中意外死亡1只，故攻毒时仅剩3只。(2)类毒素疫苗在绵羊上的效力评价取制备好的类毒素疫苗，颈部肌肉注射5～6月龄绵羊，每滴度注射5只，共三个滴度组：2.0ml(4000mld)、1.5ml(3000mld)、1.0ml(2000mld)。免疫后18日，对绵羊进行颈静脉采血制备血清，用血清中和法测定对d型产气荚膜梭菌毒素的血清中和效价。免疫后21日，对绵羊攻击1mld的d型产气荚膜梭菌毒素，观察5日，记录攻毒保护结果。d型产气荚膜梭菌类毒素对绵羊的效力评价结果综合血清中和法和免疫攻毒法结果：用本发明研制的培养基及制造使用方法制备的d型产气荚膜梭菌类毒素疫苗，家兔免疫200mld的类毒素、绵羊免疫4000mld的类毒素即可保护动物免受该型毒素的攻击，血清中和效价也可分别达到25、40，超过了《中国兽药典》所规定的“达到3”的标准，可作为研制类毒素疫苗免疫接种时的参考剂量。实施例4、本发明方法与传统工艺比较附表1本发明方法与传统工艺相关参数比较附表2本发明方法成本核算附表3传统工艺成本核算附注1厌气肉肝胃酶消化汤组成及制备方法1.1成分牛肉200g肝(牛、羊、猪)50g胃蛋白酶(1：3000)3～4g盐酸10～11ml蛋白胨10g糊精10g蒸馏水加至1000ml1.2制法1.2.1在65℃左右温水内加入盐酸和绞碎的牛肉、肝，充分搅匀，再加入胃蛋白酶充分搅拌，混合后的温度应在56～58℃。1.2.2置53～55℃消化22～24小时。前10小时每小时充分搅拌1次。1.2.3提取上清液，加热至80℃，然后加入蛋白胨煮开，调ph7.6～7.8。煮沸10分钟，滤过或经沉淀后取上清液，按量加入糊精溶解后分装。1.2.4116℃灭菌40分钟。当前第1页12