一株具有广谱抗菌活性的海洋放线菌S‑19‑3的制作方法

本发明涉及一株具有广谱抗菌活性的海洋放线菌s-19-3，其属于微生物学中放线菌领域。

背景技术：

放线菌(actinomycetes)是一类高(g+c)含量(>55％)的革兰氏阳性细菌，因其菌落边缘菌丝常呈放线状而得名[1]。放线菌作为一类有价值的微生物资源，拥有合成丰富的生物活性的次级代谢产物的能力。目前在已发现的33500种天然活性产物中，40％以上在放线菌中发现[2]；生活中普遍应用的各类抗生素约70％也是由放线菌生产[3]。

海洋环境由于其特殊的极端性(高压、低温、高盐、缺乏光照、营养匮乏等)，造就了海洋微生物独特的生存方式、代谢途径，从而具备合成新颖活性化合物的能力[4]，使得海洋微生物成为了活性天然产物的重要来源之一，也成为新药研发的主力军[5]。据统计，来源于放线菌的活性化合物约占微生物天然活性产物的45％，这些结构新颖、功能多样和具有特殊生理活性的海洋放线菌次级代谢产物的发现和其蕴含的应用价值潜力，为海洋微生物来源的天然产物的开发奠定基础，为海洋微生物资源的高效利用提供科学依据。

[1]周长林，微生物学，北京：中国医药科技出版社，2009

[2]bérdyj.thoughtsandfactsaboutantibiotics:wherewearenowandwhereweareheading.journalofantibiotics,2012,65(8):385～395

[3]bérdyj.bioactivemicrobialmetabolites.journalofantibiotics,2005,58(1):1～26

[4]赵成英，朱统汉，朱伟明，2010～2013之海洋微生物新天然产物，有机化学2013，33(6)：1195-1234

[5]hugp,yuanj,sunl,etal.statisticalresearchonmarinenaturalproductsbasedondataobtainedbetween1985and2008.marinedrugs,2011,9(4):514～525

技术实现要素：

鉴于上述，本发明利用胶州湾海洋微生物资源，提供一株具有广谱抗菌活性的海洋放线菌，具体技术如下：

一株具有广谱抗菌活性的海洋放线菌s-19-3，其拉丁文分类名：micromonosporasp.保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，cgmcc号：12140，保藏日期：2016年2月18号。

所述的海洋放线菌s-19-3，对藤黄八叠微球菌(micrococcusluteus)、大肠杆菌(escherichiacoli)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、白色假丝酵母(candidaalbicans)具有抑菌效果，并含有pksi基因。

海洋放线菌s-19-3的具有16srdna的seqidno.:1序列结构；pksi具有seqidno.:2的氨基酸序列。

本发明的的海洋放线菌s-19-3的制备方法，取胶州湾海域观测站位采集的表层沉积物，用干热法进行预处理，稀释成不同浓度在重铬酸钾筛选培养基上培养14-21天后纯化；进行菌株发酵，其基内菌丝呈棕黄色，气生菌丝呈橘红色。

具体说明如下：

取胶州湾海域观测站位采集的表层沉积物，用干热法进行预处理，稀释成不同浓度在重铬酸钾筛选培养基上培养14-21天后纯化。进行菌株发酵，采用牛津杯法和纸片扩散法检测发酵液抗菌活性。观察菌株形态特征，进行生理生化试验。提取菌株基因组，扩增16srdna和pksi基因，分别对两段序列进行比对分析。

s-19-3对供试m.luteus、e.coli、p.aeruginosa、和c.albicans均具有良好的抑菌效果。通过形态观察，在生长最佳的isp4培养基上，s-19-3基内菌丝呈棕黄色，气生菌丝呈橘红色。通过生理生化试验，发现s-19-3不能液化明胶，不能凝固和胨化牛奶，可以水解淀粉，不产生硫化氢；碳源试验中，只能利用葡萄糖和阿拉伯糖。通过对16srdna的鉴定，结合上述特征，鉴定放线菌s-19-3为小单孢菌。对其pksi基因的扩增揭示了其产聚酮化合物的潜力。

本发明的优点是：

海洋放线菌s-19-3具有广谱抗菌活性，对供试革兰氏阳性菌m.luteus、革兰氏阴性菌e.coli和p.aeruginosa、真菌c.albicans均具有良好的抑菌效果。从海洋放线菌s-19-3中扩增出的pksi基因揭示了其产聚酮化合物的潜力。

具有广谱抗菌活性的海洋放线菌s-19-3，分离自胶州湾海域观测站位采集的表层沉积物；预处理方法为干热法，分离抑制剂为重铬酸钾；其基内菌丝呈棕黄色，气生菌丝呈橘红色。结合生理生化实验与16srdna鉴定该菌为小单孢菌。

海洋放线菌s-19-3具有广谱抗菌活性，对革兰氏阳性菌藤黄八叠微球菌、革兰氏阴性菌大肠杆菌和铜绿假单胞菌、真菌白色假丝酵母均具有良好的抑菌效果。

海洋放线菌s-19-3，从其基因组中扩增出i型聚酮合酶基因，揭示了其产聚酮化合物的潜力。

附图说明

图1：s-19-3在isp4培养基生长示意图

菌株s-19-3在isp4培养基上28℃培养两周的形态如图1所示。培养6天时生出基内菌丝，呈浅橘黄色，坚硬难挑起；培养10天时生出深橘红色孢子，此后菌株表面为孢子包围，呈黑色。

图2：基于16srdna的菌株s-19-3与相关菌株的系统进化发育树

在系统进化发育树上，菌株s-19-3与西班牙学者分离的新菌micromonosporalupinistr.lupac08(dsm44870)亲缘关系最近，其序列同源性高达98％。进化树节点上数字为53，低于变种或亚种的界定数字66，表明该菌可能是小单孢菌属内的新种。

具体实施方式

1.样品的采集与预处理

样品采集信息：在胶州湾海域9个不同观测站位采集的表层沉积物，由中国海洋大学海洋化学理论与工程技术教育部重点实验室提供。将采集得到的样品保存于4℃低温冰箱中，用无菌塑料袋长期保存。使用时，将10ml海底沉积物样品铺于无菌培养皿内，80℃或120℃干热处理1-2h，磨细成粉末，稀释后做分离待用。

2.海洋放线菌的分离

海洋放线菌的分离主要采取平板梯度稀释法，具体步骤如下：

(1)均称取干热处理的样品10g，加入90ml无菌海水中，150r/min震荡20min后，静置30min取上清液，逐级稀释至10^-2、10^-3、10^-4，各取100微升涂布上述个选择性平板，每个梯度设3个重复；

(2)培养基中含0.0075％的重铬酸钾，以抑制细菌和真菌的生长，放入28℃的培养箱中倒置培养14d～21d；

(3)挑取不同形态的菌落到放线菌筛选培养基平板上进行培养，然后将分离的菌落在平板上反复划线纯化，直至得到菌落形态单一的培养物，命名为s-19-3。

3.抗菌活性测定

采用牛津杯和纸片扩散法来检测s-19-3发酵液抗菌活性，具体步骤如下：

(1)牛津杯法

1)以无菌操作在固体培养基(细菌为lb，真菌为ypd)表面直接垂直放上4～6支牛津杯，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，

2)在杯中加入待检测s-19-3发酵液(离心取上清)，一般可以装200μl，勿使其外溢。

3)加满后置37℃(细菌)或28℃(真菌)培养2～3d，观察结果，用尺子量抑菌圈直径。

(2)纸片扩散法

1)取较厚的平整滤纸，用打孔器制作直径为6mm的滤纸片，将无菌滤纸片均匀放置于生物检定平板中，每板4～8个均可。

2)取10μls-19-3发酵液(离心取上清)置于在生物检定平板中的滤纸片上，将生物检定平板先置于4℃冰箱中1～2h。培养并观察测量抑菌圈直径。

表1s-19-3对供试菌株的抑菌直径

4.形态学特征观察

s-19-3在葡萄糖-天门冬素培养基上28℃条件下培养2～3周后，通过光学显微镜观察菌丝体形态。参照国际链霉菌规划(internationalstreptomycesprojects，isp)的标准方法，采用的标准培养基进行，在isp2、isp3、isp4、isp5、营养琼脂、察氏琼脂、马铃薯琼脂七种典型的放线菌培养基进行培养，观察培养过程中菌落形态、菌丝的变化。

表2s-19-3形态特征

5.生理生化实验

内容包括：明胶液化、牛奶凝固与胨化、淀粉水解、硫化氢产生和碳源利用实验，其中碳源有葡萄糖、果糖、木糖、鼠李糖、甘露醇、蔗糖、阿拉伯糖、棉子糖和肌醇。

表3s-19-3生理生化特征

6.16srdna序列测定和系统进化树构建

提取海洋放线菌s-19-3基因组dna，采用细菌通用引物扩增16srdna并纯化测序，测序结果通过ncbi的blastn程序进行同源性比较，采用mega5.1软件，用neighbor-joining法建立系统发育树。通过序列分析，发现s-19-3与西班牙学者分离的新菌micromonosporalupinistr.lupac08(dsm44870)同源性高达98％。结合其形态特征和生理生化特征，初步判定s-19-3为小单孢菌。

7.pksi基因的扩增

利用简并引物对pksi基因进行扩增，得到的片段纯化后，进行转化实验并测序，测序结果通过ncbi的blastp程序进行氨基酸序列同源性比较，采用mega5.1软件，用neighbor-joining法建立系统发育树。通过序列分析，发现s-19-3的pksi序列与micromonosporasubsp.carbonacealuedemannandbrodsky1965的pksi序列(ncbireferencesequence:wp_052503806.1)以及polyketidesynthase序列(ncbireferencesequence:wp_052503807.1)较为接近。

seqidno.:1

16srdna

cgtgacgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcagcgttgctgatctgcgattactagcgactccgacttcacggggtcgagttgcagaccccgatccgaactgagaccggctttttgggattcgctccacctcacggtatcgcagcccattgtaccggccattgtagcatgcgtgaagccctggacataaggggcatgatgacttgacgtcatccccaccttcctccgagttgaccccggcagtcttcgatgagtccccgccataacgcgctggcaacatcgaacgagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcaccacctgtgaccgcccccgaaggaccccccatctctgaaggttttgcggccatgtcaaacccaggtaaggttcttcgcgttgcatcgaattaatccgcatgctccgccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagttttagccttgcggccgtactccccaggcggggcgcttaatgcgttagctgcggcacagagaaccggagaggccccccacacctagcgcccaacgtttacagcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagtatcggcccagagacccgccttcgccaccggtgttcctcctgatatctgcgcatttcaccgctacaccaggaattccagtctcccctaccgaactctagcctgcccgtatcgaccgcaggcttggggttgagccccaagttttcacggtcgacgcgacaagccgcctacgagctctttacgcccaataaatccggacaacgctcgcgccctacgtcttaccgcggctgctggcacgtagttggccggcgcttcttctgcaggtaccgtcacttgcgcttcgtccctgctgaaagaggtttacaacccgaaggccgtcatccctcacgcggcgtcgctgcatcaggcttccgcccattgtgcaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccggtcgccctctcaggccggctacccgtcgtcgccttggtaggccatcaccccaccaacaagctgataggccgcgagcccatcccaggccgaaaaactttccacccccagtcatgcgaccaaaggttgtatccggtattagcccccgtttccgagggttatcccaaagcctagggcaggttgctcacgtgttactcac

seqidno.:2

pksi氨基酸

mettidtlcssslvalhtavrsirsvecdqaivagvhlametspqyfqlgsrlrsfsptgasrafdaaadgfvpgegvvgvvvkplahavhdedqihgvipvtavnhggrtsgltvpsssaqqdvilaalrdagvgpegigmetvdthgtstngtslnhpnathnahnhraapprgikispistop