检测光滑假丝酵母菌的试剂盒、引物和方法

检测光滑假丝酵母菌的试剂盒、引物和方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测光滑假丝酵母菌的试剂盒、引物和方法，所述试剂盒包括序列组成如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的内引物、如SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的外引物、以及如SEQ ID No:5所示的环引物，以待测样本组织的基因组DNA作为模板，采用所述引物进行实时荧光环介导恒温PCR反应，收集荧光信号，绘制扩增曲线，即可快速检测光滑假丝酵母菌。本发明的快速检测光滑假丝酵母菌的方法特异性好，灵敏度高，重复性好，且操作要求低，简单快速，具有较好的发展意义和推广前景。
【专利说明】
检测光滑假丝酵母菌的试剂盒、引物和方法
技术领域
[0001 ]本发明属于微生物的检测方法技术领域，更具体地，本发明涉及一种快速检测光 滑假丝酵母菌的引物、试剂盒和方法。
【背景技术】
[0002] 近年来随着广谱抗菌药物和免疫抑制剂的广泛使用，由光滑假丝酵母菌引起的黏 膜和系统性感染病显著地增加，常见于免疫力低下或者合并糖尿病人群，且治疗十分困难 往往对许多唑类抗真菌药物耐受，特别是氟康唑，因此具有很高的死亡率。由于临床对光滑 假丝酵母菌分离率及其感染率的上升，因此加强对光滑假丝酵母菌的快速鉴定研究具有现 实的意义。
[0003] 随着科学的发展和生物分子学的深入研究，Notomi等科学家发明了一种新型的等 温扩增技术一环介导等温扩增技术，此法是针对目的基因的6个区域设计4-6条特异性引 物，利用Bst DNA酶在恒温条件(60°C~65°C)下反应60min，便可将目的基因扩增IO9~IOiq 倍，扩增结果产物可与加入的DNA结合染料结合产生颜色变化，操作简单，可高效、快速地检 测序列，适用于多种检测环境。
[0004] 国内有报道采用重复序列PCR(REP-PCR)方法检测光滑假丝酵母菌的研究，但是实 时荧光LAMP检测光滑假丝酵母菌具有快速、敏感的特性，具有广阔的发展前景，且此法检测 光滑假丝酵母菌在国内外尚未开展，故本发明希望探索出一套快速、灵敏检测光滑假丝酵 母菌的方法。

【发明内容】

[0005] 基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种快速检测光滑假丝酵 母菌的引物、试剂盒和方法。
[0006] 为了实现以上发明目的，本发明采取了以下技术方案：
[0007] 一种检测光滑假丝酵母菌的试剂盒，包括有序列组成为SEQ ID No: 1和SEQ ID No: 2的内引物，序列组成为SEQ ID No:3和SEQ ID No:4的外引物，序列组成为SEQ ID No:5 的环引物。
[0008] 在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括有荧光染料SYT0-9。
[0009] 本发明还提供了一种检测光滑假丝酵母菌的引物，包括有序列组成为SEQ ID No: 1和SEQ ID No: 2的内引物，序列组成为SEQ ID No:3和SEQ ID No:4的外引物，序列组成为 SEQ ID No:5的环引物。
[0010] 本发明还提供了一种检测光滑假丝酵母菌的方法，采用上述试剂盒，主要包括以 下步骤：
[0011] 1)提取待检测样品的基因组；
[0012] 2)加样和加荧光染料后构成反应体系，进行环介导恒温扩增；
[0013] 3)检测扩增产物。
[0014] 在其中一些实施例中，反应体系中引物SEQ ID No:l、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、 SEQ ID No:4、SEQ ID 吣：5的浓度比为8:8:1:1:4。
[0015] 在其中一些实施例中，所述SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、SEQ ID No: 4、SEQ ID No: 5在反应体系中的浓度分别为I · 6ymol/L、I · 6ymol/L、0 · 2ymol/L、0 · 2ymol/L、 0·8ymol/L。
[0016] 与现有技术相比，本发明具有以下显著效果：
[0017] 1、本发明采用特殊的引物对，利用Rea-LAMP法(Real-Time Fluorescence Loop-Mediated Isothermal Amplif i cat ion) 测定 10 株相关菌株 ，只 有光滑假丝酵母菌出 现强阳 性，其他均为阴性;利用倍比稀释法测定目的菌株，检测下限达到2.23pg/ml，远远高于普通 PCR;重复测定3次样本，变异系数CV小于5%，说明本发明的Rea-LAMP法测定光滑假丝酵母 菌具有较好的特异性、灵敏性、重复性;具有鉴定简单、实时监测等优点，有利于快速检测光 滑假丝酵母菌；
[0018] 2、本发明的Rea-LAMP法在配制反应体系时便加入荧光物质，无需像大多传统的 LAMP检测方法那样在反应结束后开盖加入荧光染料，故在整个扩增检测过程中都是闭管工 作，可从源头上控制气溶胶污染；同时，由于荧光染料的预先加入，仪器可在预先设置好的 每30秒检测一次荧光信号，从而做到实时监测；
[0019] 3、传统的LAMP检测方法结果判读利用肉眼观察扩增产物的浊度，故存在较大的主 观误差，而Rea-LAMP法利用荧光信号检测扩增产物，具有较高的准确性；
[0020] 4、本发明的Rea-LAMP法使用的恒温荧光检测仪工作原理简单，提供LAMP反应体系 需要的温度和人为设置每30秒的对扩增产物进行检测。
【附图说明】
[0021 ]图1为本发明试验例1中的引物筛查结果图；
[0022]图2为本发明试验例2中的Rea-LAMP方法引物特异性结果图；
[0023]图3为本发明试验例3中的Rea-LAMP方法引物灵敏度结果图；
[0024]图4为本发明试验例4中的Rea-LAMP方法重复性实验结果图。
【具体实施方式】
[0025]以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发 明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发 明的保护范围。
[0026]以下实施例中所使用的菌株由广州医科大学附属第三医院检验科微生物室分离、 VITEK2全自动微生物鉴定仪鉴定并于-70°C保存。实验用菌株如下:光滑假丝酵母菌、化脓 性链球菌、近平滑假丝酵母、克柔假丝酵母、肺炎克雷伯杆菌、热带念珠菌、金黄色葡萄球 菌、粪肠球菌、白色念珠菌、马尔尼非菌。
[0027]以下实施例中所使用的仪器有：加样枪、微型离心机、振荡器、干式恒温金属浴、 Thermo Scientific Nanodrop 2000微量分光光度计、超净工作台、迪澳恒温焚光检测仪 Deaou-308C、VITEK 2全自动微生物鉴定仪。主要试剂有:血平板、迪澳DNA扩增试剂盒24测 试/盒、天根细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型）、天根酵母基因组DNA提取试剂盒(离心 柱型）、ITSII基因引物由英潍捷基上海贸易有限公司合成）、超纯水等除了特殊说明外，均 来源于市售。
[0028] 实施例中的步骤除了特殊说明外，均为本领域常规操作步骤，以下实施例中所使 用的原料，均来源于市售。
[0029] 实施例1光滑假丝酵母菌的快速检测方法
[0030] 本实施例的光滑假丝酵母菌的快速检测方法包括以下具体步骤：
[0031] (1)、细菌基因组DNA提取
[0032] 将-70°C保存的光滑假丝酵母菌201503A3、化脓性链球菌20150321、近平滑假丝酵 母GYSY14019001、克柔假丝酵母GYSY14019002、肺炎克雷伯杆菌20150322、热带念珠菌 201503A4、金黄色葡萄球菌20150324、粪肠球菌20150323、白色念珠菌GYSY14019003、马尔 尼非菌GYSY14019004接种于血平板，在37°C温箱培养18~24小时，取平板上的菌混于无菌 生理盐水中制成Iml菌悬液。按照天根细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作。
[0033] (2)、引物设计与合成
[0034] 根据光滑假丝酵母菌的ITSII基因序列，利用LAMP引物设计软件Primer Explorer 3设计引物。引物序列由英潍捷基上海贸易有限公司合成(见表1)。
[0035] 表1 Rea-LAMP检测体系引物
[0037] (3)、Rea_LAMP反应体系及配制
[0038]按照DNA扩增试剂说明书(迪澳公司）配制LAMP反应体系。反应体系如表2。
[0039] 表2 Rea-LAMP的反应体系
LUU^Ij 兵1f，引被J丄rr/仪田女照浓度比8:8:1:1:4混合配制，使上述引 物加入25yL体系后浓度分别为1.6UM、1.6UM、0.2UM、0.2UM、0.8UM;加入DNA模板前加入20ul 密封液，防止DNA被污染。每次试验均设置用CldH2O代替DNA模板的阴性对照。
[0042] (4)、Rea_LAMP 反应
[0043] 在迪澳恒温荧光检测仪Deaou_308C中进行Rea-LAMP反应，反应温度为63°C，反应 时间为60~90min，每30秒检测一次荧光信号，收集荧光信号，绘制扩增曲线。
[0044] (5)、反应结果
[0045] 当机器收集的荧光强度达到1000 Omv时报阳，并呈峰，说明检测到目标菌，本实施 例的样品中只有光滑假丝酵母菌201503A3报阳，并呈峰形，其他菌都没有呈峰形。
[0046]试验例1实施例1的Rea-LAMP反应的引物筛选
[0047]分别配制工作液:①加环引物工作液，②不加环引物工作液，把这两种工作液分别 加入Rea-LAMP体系，对光滑假丝酵母菌的ITSII基因进行扩增，观察扩增曲线，比较加、不加 环引物对基因 ITSII扩增的影响。
[0048] 结果见图1，可观察到在反应后40min，加环引物(Positive control)出峰，且焚光 强度达到17021mV，不加环引物无出峰现象，由此可以得出结论:加环引物ITSII对光滑假丝 酵母ITSII基因有相对高的扩增效率，选择该引物进行后续的实验。
[0049] 试验例2实施例1的Rea-LAMP反应的引物特异性
[0050] 按实施例1的方法提取光滑假丝酵母菌及其他常见病原菌(化脓性链球菌、近平滑 假丝酵母、克柔假丝酵母、肺炎克雷伯杆菌、热带念珠菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、白色 念珠菌、马尔尼非菌）的基因组DNA，按照Rea-LAMP的反应条件进行扩增，分析检测信号，评 价该引物的特异性。
[0051 ] 结果见图2,可以看出，除了粪肠球菌在35min处出峰，且峰值仅仅达到5704mV，而 光滑假丝酵母菌在32min内被特异性地检测出来，峰值达到15000,而本试验例选取其他常 见的病原菌在同样的处理下均未出现扩增现象，表明该引物对光滑假丝酵母菌检测的特异 性较好。本发明所设计的Rea-LAMP引物具有良好的特异性，与非目标菌不存在交叉反应。
[0052] 试验例3实施例1的Rea-LAMP反应的引物灵敏性
[0053] 测定光滑假丝酵母菌的DNA液浓度，先用IyL TE液对Thermo ScientificNanodrop 2000微量分光光度计调0,再加1此光滑假丝酵母菌的DNA提取液，测量DNA模板浓度，为 22.3ngAiL。取5yL DNA原液用超纯水进行10倍梯度稀释6次，得到7个不同浓度的DNA模板， 加入Rea-LAMP体系中反应，观察扩增曲线，检测引物对光滑假丝酵母菌的检测灵敏度。 [0054] 结果见图3,可以看出，本试验例DNA模板浓度为22.3ngAiL、2.23 ngAxL、223pgAi L、22 · 3 pg/ml、2 · 23pg/ml，可分别在20min、23min、28min、30min、60min时出峰，说明可检测 到原浓度为22.3ng/yL的DNA模板。说明本试验例的检测灵敏度可达到2.23pg/ml。
[0055] 试验例4实施例1的Rea-LAMP反应的重复性实验
[0056] 用同一光滑假丝酵母菌DNA同时做3个重复性实验，比较反应曲线的重合度。
[0057]结果见图4,可以看出，3个重复管几乎同时出峰，且扩增曲线重合度好，报阳时间 为45min、44.5min、45min，CV值=0.64%，小于5%，说明Rea-LAMP的重复性良好。
[0058]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护 范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种检测光滑假丝酵母菌的试剂盒，其特征在于，包括有序列组成为SEQ ID N〇:l和 SEQ ID No:2的内引物，序列组成为SEQ ID No:3和SEQ ID No:4的外引物，序列组成为SEQ ID No:5的环引物。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括有荧光染料SYTO-9。3. -种检测光滑假丝酵母菌的引物，其特征在于，包括有序列组成为SEQ ID No: 1和 SEQ ID No: 2的内引物，序列组成为SEQ ID No:3和SEQ ID No:4的外引物，序列组成为SEQ ID No:5的环引物。4. 一种检测光滑假丝酵母菌的方法，其特征在于，采用权利要求1-2任一项所述的试剂 盒，主要包括以下步骤： 1) 提取待检测样品的基因组； 2) 加样和加荧光染料后构成反应体系，进行环介导恒温扩增； 3) 检测扩增产物。5. 根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述反应体系中SEQ ID No: 1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID 吣：5的浓度比为8:8:1:1:4。6. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述SEQ ID No :1、SEQ ID No: 2、SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID 如：5在反应体系中的浓度分别为1.6以111〇1/1、1.6以111〇1/1、 0·2ymol/L、0·2ymol/L、0·8ymol/L〇
【文档编号】C12N15/11GK106086181SQ201610438496
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月16日
【发明人】郭旭光, 何淑君, 黄美淦, 刘庆锋, 邓穗燕, 陈琼, 夏勇
【申请人】广州医科大学附属第三医院