专利名称：提高罗伦隐球酵母控制苹果采后青霉病及展青霉素效力的方法
技术领域：
本发明属于生物防治技术领域，涉及一种罗伦隐球酵母{Cryptococcuslaurentii)以及利用海藻糖提高罗伦隐球酵母控制苹果采后青霉病及展青霉素效力的方法。
背景技术：
展青霉素又称棒曲霉素，是青霉属、曲霉属、丝衣霉属等霉菌代谢产生的一种有毒的真菌次级代谢产物，是一种遗传毒性化合物，具有潜在的细胞和动物毒性，存在致畸性、致癌性和免疫毒性，是对人类危害最大的霉菌毒素之一。展青霉素是一种世界范围内的水果污染物，食品生产中展青霉素的污染相当普遍，广泛存在于苹果、葡萄、橘子、菠萝、玉米、奶酪和谷物等产品中，特别是在苹果及以苹果为加工原料的产品中展青霉素的污染最为严重。我国是世界最大的苹果生产国，但由于贮藏加工能力不足，导致大量的苹果出现腐烂现象。引起苹果采后腐烂的致病菌主要有灰葡萄孢ci/ 6 rea)和扩展青霉iPenicillium expansum )。扩展青霉引起的苹果损失不仅在于由扩展青霉引起的苹果腐烂，而且在于由扩展青霉产生的展青霉素污染。苹果上展青霉素的积累量与苹果腐烂程度直接相关，苹果腐烂程度越高，展青霉素平均含量越大；腐烂苹果中的展青霉素可以扩散至未腐烂部分，腐烂部位展青霉素含量最大，展青霉素含量随着和腐烂部位的距离增加而降低。因此控制苹果腐烂可以有效控制苹果上展青霉素的积累量。低温贮藏、气调贮藏是抑制水果采后病害的有效方法，但这两种方法需要相应的设备，成本比较高，在广大的发展中国家很难实施。另外，有些致病霉菌比较耐低温，在冷藏情况下仍能在水果上生长并造成水果腐烂，甚至产生霉菌毒素。有些水果，特别是热带、亚热带水果不能在低温下贮藏(低温下贮藏冷害严重)，只能在亚低温下贮藏，此时致病霉菌繁殖仍然比较快，水果在贮藏期的腐烂比较严重，产生霉菌毒素，特别是展青霉素的机会就更多。长期以来，控制水果采后病害及霉菌毒素污染的主要措施是使用杀菌剂。但是由于杀菌剂的长期大量使用对环境及健康的影响，化学杀菌剂的使用受到越来越多的限制，事实上，目前多种杀菌剂(如Captan、Benomyl等)已被美国环保局明令禁止使用或者在部分水果产品上限制使用。用拮抗微生物对水果采后病害的生物防治方法被认为是最有希望取代化学杀菌剂的果蔬采后病害防治方法之一。国内外研究表明，许多酵母菌应用于水果表面，可以防治水果由致病霉菌引起的病害，这些酵母被称为拮抗酵母。通过近20年的研究，已经有数十种酵母显示具有拮抗真菌的特性，特别是假丝酵母属(Candit/a )、隐球酵母属(Cryp tococcus )、毕赤酵母属iPichia)、红酵母属iRhodotorula)、梅奇氏酵母属(Metschnikowia)、丝抱酵母属(Jrichosporon)和(类酵母)短梗霉属iAureobasidium)等的研究相对较多。值得注意的是，国外近年来的研究表明，一些拮抗酵母不仅能直接抑制苹果上的扩展青霉，抑制扩展青霉产生展青霉素，而且还能分解已经存在的展青霉素。Coelho等用体外试验(// vitro test)的方法研究拮抗酵母对展青霉素的降解作用，结果表明，将223呢的展青霉素添加到含有25 ml酵母培养液的三角瓶中，再在其中接种3 X IO6 cells奥默毕赤酵母iPichia ohmeri),在25 ° C培养,经过2d,展青霉素减少83% ;经过5d,展青霉素减少99% ;再经过15d的培养，展青霉素的量减少到无法测定的水平。Castoria等报道粘红酵母iRhodotorula glut in is)和罗伦隐球酵母laurentii )在体外培养情况下能分解展青霉素；将其应用于苹果上，可以显著降低展青霉素在苹果上的积累。Morales等报道清酒假丝酵母QCandida sake)在冷藏条件下(1°C )既能降低苹果上青霉病的发生率，又能防治展青霉素在苹果上的积累。Tolaini等的研究发现，在实验室及半商业贮藏情况下，香燕{Lentinula et/oofes)培养液能够增强罗伦隐球酵母(C laurentii)防治苹果上扩展青霉的生长及展青霉素产生的效力。Lima等将罗伦隐球酵母(C与低剂 量的杀菌剂boscalid (BOSC), cyprodinil (CYPR)结合使用，有效地降低了苹果上青霉病的发病率及展青霉素的积累。目前，生物降解展青霉素以降低水果及其制品中霉菌毒素含量已成为国际学术界研究的热点。但到目前为止，已实际应用于生产的拮抗菌种类并不多，只有Biosave和Aspire等少数几种产品上市，我国目前尚没有拮抗菌应用于实际生产。由于环境条件的不确定性，商业生产条件下生物拮抗菌作为活菌保鲜剂，其生物防治效果或者达不到所需要求或者不稳定，单一运用酵母拮抗菌来防治水果采后病害难以达到理想的效果。探索能够增强现有拮抗菌拮抗能力的有效措施就显得尤为重要。罗伦隐球酵母控制苹果采后青霉病的作用已经得到证实，进一步提高其拮抗效力，是提高其对水果青霉病、展青霉素控制效力，并将其应用于水果贮藏保鲜的重要策略之
o海藻糖对生物体和生物大分子具有非特异性保护作用，它能有效地保护细胞膜和蛋白质的结构，使生物体在异常情况下，如高温、干燥、高渗透压、冷冻时仍保持细胞内湿润，防止细胞因失水而造成养分的损失和细胞的损伤。而且体外海藻糖同样具有稳定生物膜和蛋白质结构的特性。Li和Tian报道,通过海藻糖培养C laurentii后,能在该酵母细胞内积累较高浓度水平的海藻糖，保持细胞活性，显著提高低温及人工气调条件下酵母对苹果青霉病的控制效力。
发明内容
本发明为了克服上述现有技术中的不足，提供了一种提高罗伦隐球酵母控制苹果采后青霉病及展青霉素效力的方法。罗伦隐球酵母经海藻糖补充培养基培养制备成菌悬液，将菌悬液应用到水果上，能提高罗伦隐球酵母对苹果采后青霉病及展青霉素的控制效力。在体外培养(/ 情况下，经海藻糖补充培养基培养能提高罗伦隐球酵母对扩展青霉在PDA平板上生长的抑制作用；能提高罗伦隐球酵母对扩展青霉在PDA平板上展青霉素积累的抑制作用。本发明具有安全、高效、成本低等优点，可以广泛地用于水果采后病害的生物防治过程中，减少水果青霉病造成的损失及展青霉素造成的危害。本发明同时提供了提高罗伦隐球酵母控制苹果采后青霉病及展青霉素效力的方法，按照下述步骤进行(I)将罗伦隐球酵母(jCryptococcus laurentii)固体活化NYDA培养基28°C培养48h ; (2)液体培养在三角瓶中装入以体积计1/5的NYDB种子培养基，用接种环接入一环活化好的罗伦隐球酵母，在200rpm，28°C条件下培养20h ; (3)诱导培养接种到海藻糖补充培养基中进行培养，离心得到菌体；将菌体制备成5 X IO8个/ml的菌悬液；在水果果实伤口处加入30 Ul酵母菌悬液，自然晾干后，将果实放入塑料筐并用保鲜膜密封，室温下贮藏，即可达到提高控制苹果采后青霉病及展青霉素效力的目的。其中所述的NYDB种子培养基中含牛肉膏Sg，酵母浸膏5g，葡萄糖IOgjK 1000ml ；
其中所述的海藻糖补充培养基中含酵母膏5g，牛肉浸膏Sg，海藻糖0. 2-lg,葡萄糖
0.2-lg,纯化水1000ml,自然pH ;优选酵母膏5g,牛肉浸膏8g,海藻糖4g,葡萄糖6g,纯化水1000ml,自然 pH。其中所述的水果为苹果。本发明的优点
(I)本发明使用海藻糖培养罗伦隐球酵母控制苹果青霉病的腐烂率及展青霉素积累，使用方法简单，操作方便，效果好，成本低。(2)海藻糖培养罗伦隐球酵母可以代替化学杀菌剂防治苹果青霉病及控制展青霉素积累，避免了化学杀菌剂对人体健康的危害，具有显著的经济效益和社会效益。
其中图I为不同浓度海藻糖诱导的罗伦隐球酵母对苹果青霉病的抑制效应；注CK :对照；NYDB :碳源为1%的葡萄糖；0. 2 :碳源为0. 2%的海藻糖和0. 8%的葡萄糖；0. 4 :碳源为0. 4%的海藻糖和0. 6%的葡萄糖；0. 6 :碳源为0. 6%的海藻糖和0. 4%的葡萄糖；0. 8 :碳源为
0.8%的海藻糖和0. 2%的葡萄糖；NYTB :碳源为I. 0%的海藻糖。不同字母代表差异显著性(p=0. 05)。图2为不同浓度海藻糖诱导后的罗伦隐球酵母对展青霉素积累的抑制效果；注CK :对照；0 :碳源为1%的葡萄糖；0. 2 :碳源为0. 2%的海藻糖和0. 8%的葡萄糖；0. 4 :碳源为0. 4%的海藻糖和0. 6%的葡萄糖；0. 6 :碳源为0. 6%的海藻糖和0. 4%的葡萄糖；0. 8 :碳源为0. 8%的海藻糖和0. 2%的葡萄糖；1 :碳源为I. 0%的海藻糖。不同字母代表差异显著性(p=0. 05)。图3为不同浓度海藻糖诱导后罗伦隐球酵母对扩展青霉在PDA培养基上生长的影响；注=CK :对照；NYDB :碳源为1%的葡萄糖；0. 2 :碳源为0. 2%的海藻糖和0. 8%的葡萄糖；
0.4 :碳源为0. 4%的海藻糖和0. 6%的葡萄糖；0. 6 :碳源为0. 6%的海藻糖和0. 4%的葡萄糖；
0.8 :碳源为0. 8%的海藻糖和0. 2%的葡萄糖；NYTB :碳源为I. 0%的海藻糖。不同字母代表差异显著性(P=O. 05)。图4为海藻糖诱导罗伦隐球酵母对PDA培养基上展青霉素积累的影响；
注CK :对照；NYDB :碳源为1%的葡萄糖；0. 4% :碳源为0. 4%的海藻糖和0. 6%的葡萄糖。不同字母代表差异显著性(P=O. 05)。
具体实施例方式通过借助以下实施实例将更加详细的说明本发明。以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施实例的限制。
罗伦隐球酵母)购于中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)，于NYDA (NYDB培养基的基础上添加2%的琼脂)培养基4°C低温保存。实施例I :本发明实施过程如下(I)菌种固体活化NYDA培养基28°C培养48h ；
(2)菌种液体培养在250 ml的三角瓶中装入50 ml的NYDB种子培养基(牛肉膏8g，酵母浸膏5g,葡萄糖10 g,水1000 ml)用接种环接入一环活化好的C. lau rentii,^￡ 200rpm,28°C条件下培养20 h ;(3)诱导培养将上述培养混合物7000Xg条件下离心10 min，无菌蒸馏水洗涤两次，以去除培养介质，并用无菌蒸馏水重新悬浮酵母细胞，血球记数板调节细胞浓度为5X IO8个/ml。在250ml的三角瓶中分别装入50ml NYDB培养基或海藻糖补充培养基(海藻糖浓度分别为0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%)，并加入上述浓度的酵母细胞培养液1ml，然后在200印111，281条件下培养2411;(4)离心分离再悬浮上述不同处理酵母培养混合物在7000Xg条件下,离心10-15min,并用无菌蒸懼水洗漆2次，以去除培养介质，用无菌蒸馏水重新再悬浮，并用血球计数板调节酵母细胞浓度为5X IO9个/ml。实施例2 :海藻糖诱导培养罗伦隐球酵母对苹果青霉病的控制 一、试验方案
苹果处理后，用消过毒的打孔器在每个果实表面赤道部位形成统一大小和深度的伤口5mm (直径)X3_ (深)。在每个伤口处等量加入30 (I)经NYDB培养基培养的罗伦隐球酵母菌悬液(浓度为5X108 cells/ml)； (2)经海藻糖补充培养基(碳源为海藻糖和葡萄糖)培养的酵母悬浮液，海藻糖浓度分别为0. 2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0% (NYTB培养基，以海藻糖全部取代葡萄糖)；(3)无菌水(作为对照)。3h后，在每个伤口处等量加入30 Ul P.expansum孢子悬浮液(浓度为5 X IO4 spores/ml )。自然晾干后,将苹果放入塑料筐内，用保鲜膜密封以保持筐内湿度，置于20°C相对湿度为95%RH的恒温恒湿培养箱内进行贮藏。每处理重复3次，每个重复12个果实，整个试验重复2次。经过若干天的培养，用游标卡尺测定水果病斑，记录病斑直径并计算发病率，以此评价罗伦隐球酵母对苹果青霉病的防治效果。发病率的计算公式如下
发病率(%)= E发病的果实/接种病原菌的果实总数X 100%
_■、试验结果
按照上述步骤试验，海藻糖诱导培养罗伦隐球酵母对苹果青霉病的控制效果如下 从图I可以看出，试验中接种罗伦隐球酵母的所有处理均能降低扩展青霉引起的青霉病的发生率。当培养基中碳源组份海藻糖浓度0. 4%、葡萄糖0. 6%培养罗伦隐球酵母时，其对苹果青霉病的抑制效应最为显著。NYDB培养的罗伦隐球酵母处理组青霉病的发病率为45. 8%，为对照处理的68. 7%。经过0. 4%海藻糖和0. 6%葡萄糖为碳源诱导培养罗伦隐球酵母处理的苹果青霉病的发病率为34%，为对照处理的50%。实施例3 :海藻糖诱导培养罗伦隐球酵母对苹果展青霉素的控制 一、试验方案
苹果处理后，用消过毒的打孔器在每个果实表面赤道部位形成统一大小和深度的伤口5mm (直径)X3_ (深)。在每个伤口处等量加入30 (I)经NYDB培养基培养的罗伦隐球酵母菌悬液(浓度为5X108 cells/ml)； (2)经海藻糖补充培养基(碳源为海藻糖和葡萄糖)培养的酵母悬浮液，海藻糖浓度分别为0. 2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0% (NYTB培养基，以海藻糖全部取代葡萄糖)；(3)无菌水(作为对照)。3h后，在每个伤口处等量加入30 Ul P.expansum孢子悬浮液(浓度为5 X IO4 spores/ml )。自然晾干后,将苹果放入塑料筐内，用保鲜膜密封以保持筐内湿度，置于20°C相对湿度为95%RH的恒温恒湿培养箱内进行贮藏。每处理重复3次，每个重复12个果实，整个试验重复2次。样品提取和净化苹果添加等量的无菌蒸馏水用高速组织捣碎机匀浆，取一定量的匀浆转移至250ml锥形瓶中，加入等量果胶酶于40°C恒温摇床水浴锅中酶解2h，4000rpm离心取上清液作为试样，将上清液转移到125ml分液漏斗中，用25ml乙酸乙酯振摇5min，静置3min。待分层后,用刻度吸管移取上层有机相于另一分液漏斗中，再加用25ml乙酸乙酯于水相中，重复上述振摇提取过程两次。弃去水层，合并三次乙酸乙酯提取液于分液漏斗中，加入IOml碳酸钠水溶液，立即振摇，静置分层，此净化操作应在2min内完成。再用IOml乙酸乙酯提取碳酸钠水层一次，弃去碳酸钠水层，合并乙酸乙酯提取液，加入5滴冰乙酸后，全部转移至旋转蒸发器于40°C下蒸发至近干，用Iml乙酸盐缓冲溶液溶解残留物，经
0.45um滤膜滤至样品瓶内，采用高效液相色谱测定展青霉素的含量。二、试验结果
按照上述步骤试验，海藻糖诱导培养罗伦隐球酵母对苹果展青霉素的控制效果如下由图2结果可知，接种罗伦隐球酵母的所有处理均能降低苹果上展青霉素的积累量。当培养基中碳源组份为海藻糖0. 4%和葡萄糖0. 6%培养罗伦隐球酵母时，其对苹果上展青霉素的积累量的抑制效应最为显著。经过0. 4%海藻糖和0. 6%葡萄糖为碳源诱导培养罗伦隐球酵母处理的苹果展青霉素含量为14. 5呢，为对照处理的48%。实施例4 :海藻糖诱导培养罗伦隐球酵母对扩展青霉在PDA培养基上生长的影响 一、试验方案
用无菌打孔器在PDA培养基中间打一个直径为Icm的洞，加入IOOu I (I)经NYDB培养基培养的罗伦隐球酵母菌悬液(浓度为5X IO8 cells/ml) ；(2)经海藻糖补充培养基(碳源为海藻糖和葡萄糖)培养的酵母悬浮液，海藻糖浓度分别为0. 2%，0. 4%，0. 6%，0. 8%，1.0% (NYTB培养基，以海藻糖全部取代葡萄糖)；(3)无菌水(作为对照)。3h后再分别加入IOOiU扩展青霉孢子悬浮液(5X IO4 spores/ml)。用保鲜膜密封以防治交叉感染，置于温度为28°C、相对湿度为95%RH的恒温恒湿培养箱中培养7d，用游标卡尺测量病斑直径。每个处理重复3次，整个试验重复2次。二、试验结果
不同浓度海藻糖诱导后罗伦隐球酵母对扩展青霉在PDA培养基上生长的影响结果如
下
由图3结果可知，在PDA培养基中，接种罗伦隐球酵母的所有处理均能抑制扩展青霉的生长。当培养基中碳源成分为海藻糖0. 4%葡萄糖和0. 6%培养罗伦隐球酵母时，其对扩展青霉生长的抑制效应最为显著。对照组病斑直径为22. 6mm,海藻糖0. 4%葡萄糖0. 6%培养后的罗伦隐球酵母处理组病斑直径仅为13. 5mm,扩展青霉在PDA平板上的生长得到显著抑制。实施例5 :海藻糖诱导罗伦隐球酵母对PDA培养基上展青霉素合成量的影响 一、试验方案
用无菌打孔器在PDA培养基中间打一个直径为Icm的洞，加入IOOu I (I)经NYDB培养基培养的罗伦隐球酵母菌悬液(浓度为5X IO8 cells/ml) ；(2)经海藻糖补充培养基(碳源为海藻糖和葡萄糖)培养的酵母悬浮液，海藻糖浓度分别为0. 2%，0. 4%，0. 6%，0. 8%，1.0% (NYTB培养基，以海藻糖全部取代葡萄糖)；(3)无菌水(作为对照)。3h后再分别加入IOOiU扩展青霉孢子悬浮液(5X IO4 spores/ml)。用保鲜膜密封以防治交叉感染，置于温度为28°C、相对湿度为95%RH的恒温恒湿培养箱中培养7d，用无菌刀沿病斑外围0. 5cm处取出PDA培养基，研钵研磨后转移到125ml分液漏斗中，展青霉素经过提取和净化处理后采用高效液相色谱测定展青霉素的含量。 二、试验结果
由图4可知，在PDA培养基中，接种罗伦隐球酵母的处理均能抑制展青霉素的合成量。经过0. 4%海藻糖0. 6%葡萄糖为碳源诱导培养的罗伦隐球酵母对展青霉素合成的抑制效果最好，为对照处理的42%。
权利要求
1.提高罗伦隐球酵母控制苹果采后青霉病及展青霉素效力的方法，其特征在于按照下述步骤进行(I)将罗伦隐球酵母(ococcys Iaurentii固体活化NYDA培养基28°C培养48h ; (2)液体培养在三角瓶中装入以体积计1/5的NYDB种子培养基，用接种环接入一环活化好的罗伦隐球酵母，在200 rpm, 28°C条件下培养20h ; (3)诱导培养接种到海藻糖补充培养基中进行培养，离心得到菌体；将菌体制备成5 X IO8个/ml的菌悬液；在水果果实伤口处加入30 u I酵母菌悬液，自然晾干后，将果实放入塑料筐并用保鲜膜密封，室温下贮藏，即可达到控制苹果采后青霉病及展青霉素效力的方法。
2.根据权利要求I所述的提高罗伦隐球酵母控制苹果采后青霉病及展青霉素效力的方法，其特征在于其中所述的NYDB种子培养基中含牛肉膏Sg，酵母浸膏5 g，葡萄糖10 g，水 1000 ml O
3.根据权利要求I所述的提高罗伦隐球酵母控制苹果采后青霉病及展青霉素效力的方法，其特征在于其中所述的海藻糖补充培养基中含酵母膏5g，牛肉浸膏Sg，海藻糖0.2-lg,葡萄糖0. 2-lg,纯化水1000ml,自然pH。
4.根据权利要求I所述的提高罗伦隐球酵母控制苹果采后青霉病及展青霉素效力的方法，其特征在于其中所述的水果为苹果。
5.根据权利要求3所述的提高罗伦隐球酵母控制苹果采后青霉病及展青霉素效力的方法，其特征在于其中所述的海藻糖补充培养基中含酵母膏5g，牛肉浸膏Sg，海藻糖4g，葡萄糖6g,纯化水1000ml,自然pH。
全文摘要
本发明公开了提高罗伦隐球酵母控制苹果采后青霉病及展青霉素效力的方法，属于生物防治技术领域。按照下述步骤进行将罗伦隐球酵母(Cryptococcuslaurentii)活化，接种到海藻糖补充培养基(碳源为0.4%海藻糖和0.6%葡萄糖)中进行培养，离心得到菌体；将菌体制备成1×108个/ml的菌悬液；在果实伤口处加入30μl酵母菌悬液，自然晾干后，将果实放入塑料筐并用保鲜膜密封，在室温下贮藏。本发明使用海藻糖提高罗伦隐球酵母控制苹果采后青霉病及展青霉素的效力环保、安全、经济、高效、实用，具有重要的社会价值和经济价值。
文档编号A23B7/155GK102696755SQ201210190959
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月11日 优先权日2012年6月11日
发明者任晓锋, 张晓云, 张红印, 李超兰, 靳莎莎 申请人:江苏大学