专利名称：一株产漆酶葡萄糖去阻遏担子菌新型隐球酵母tsp2-1Δ的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域。具体涉及一株能产漆酶葡萄糖去阻遏担子菌新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)。
背景技术：
漆酶(EC I. 10. 3. 2)是一类含铜的蓝色酚氧化酶。漆酶可以氧化一系列芳香族化合物，氧作为电子受体，副产物是水，因此是一种环保型酵素。漆酶广泛分布于昆虫、植物、真菌和细菌中。Yoshida首先在漆树中发现了漆酶，一直以来，漆酶受到了科学界的广泛关注，并且在工业生产和环境治理领域得到了广泛的应用。目前，工业上应用的漆酶主要来源于真菌，例如，白腐菌产生的漆酶可用于木质素降解， 纺织品漂白和食物处理等，漆酶还可用于环境污染物降解和土壤有机物转化，漆酶在降解木质纤维素产乙醇中也具有潜在的应用价值。真菌漆酶的工业发酵生产存在以下问题大多数真菌的漆酶表达调控的分子机制不清楚，一些真菌漆酶的表达是组成型的，而另一些真菌漆酶的表达是诱导型的，在真菌的生长过程中漆酶的表达会受到碳源(比如葡萄糖) 的抑制，在有些情况下，漆酶会在蛋白酶的作用下失活。
发明内容
本发明的目的是克服漆酶表达的葡萄糖阻遏抑制问题，提供一株能在高浓度葡萄糖条件下漆酶高产的新菌株。本发明提供的能在高浓度葡萄糖条件下漆酶高产的新菌株是一株担子菌属的新型隐球酵母Cryptococcus neoformans (该菌株是野生型菌株JEC21的基因TSP2-1定向敲除突变株，基因TSP2-1的GenBank编号CNJ00820。该菌株于2011年9月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，菌种保藏号CGMCC No. 5274,分类命名为新型隐球酵母Cryptococcus neoformans) tsp2_l Δ。本发明菌株为国内外首次发现。新型隐球酵母可以产生大量的漆酶，含有2种漆酶基因LACl和LAC2，LACl是表达主要的漆酶活性，而LAC2不表达。新型隐球酵母的漆酶共价结合到细胞壁上，可以氧化酚底物(去甲肾上腺素等) 产生黑色素。影响新型隐球酵母漆酶表达的因素包括(I)铜离子可以诱导漆酶的表达；
(2)高温(37°C )抑制漆酶的活性；(3)葡萄糖抑制漆酶的表达，当葡萄糖耗尽后才起始 LACl的表达。本发明经过多年大量的深入研究，培养了一株担子菌，该菌的漆酶表达不受葡萄糖抑制，可在高浓度葡萄糖条件下产生大量漆酶，解决了漆酶生产的葡萄糖阻遏抑制问题。本发明通过根癌农杆菌介导的高效转化方法，以新型隐球酵母血清型D菌株 JEC21 (MATa)作为野生型菌株，构建了新型隐球酵母的随机突变文库，从中筛选到了漆酶葡萄糖去抑制突变株LZM36。通过反向PCR得到了突变基因TSP2-1 (GenBank编号 CNJ00820)。通过定向敲除基因TSP2-1获得了漆酶葡萄糖去抑制菌株tsp2-lA。通过RT-PCR和漆酶活性测定对菌株tsp2-l Δ的漆酶表达和活性做了详细的分析和检测。本发明利用分子生物学方法对漆酶葡萄糖去阻遏菌株tsp2_l Δ进行了基因突变鉴定、漆酶表达和漆酶活性分析。该菌株可用来在高浓度葡萄糖条件下生产酚氧化酶一漆酶。即在高浓度葡萄糖培养基中培养所述微生物菌株以使所述微生物细胞组成型表达漆酶。所述高葡萄糖培养基为2%葡萄糖Asn培养基g/L :天门冬酰胺lg，葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，pH 5. 1，固体培养基则补加20g琼脂粉。培养是在需氧条件下，在500mL三角瓶中发酵培养，接种方式采用菌液的接种方式，温度为28-30°C。本发明的优点和积极效果本发明提供了一株产漆酶葡萄糖去阻遏担子菌Cryptococcus neoformans tsp2-l Δ。在高浓度葡萄糖(2% )条件下，野生型菌株JEC21的漆酶表达受到抑制，而菌株 tsp2-lA的漆酶组成型高表达。漆酶活性测定发现菌株tsp2-lA是野生型菌株JEC21的 9. 25倍。本发明解决了漆酶生产的葡萄糖阻遏问题。
图I是本发明提供的菌株tsp2_l Δ的黑色素合成；图2是本发明提供的菌株tsp2_l Δ的DNA印迹杂交(Southern Blot)；图3是本发明提供的菌株tsp2_l Δ中LACl的转录表达量。下面结合具体实施例，说明本发明中漆酶葡萄糖去阻遏菌株tsp2_l Λ的构建、基因突变鉴定、漆酶表达和漆酶活性分析等内容。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
具体实施例方式下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人所著的“分子克隆实验室手册”(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例I、本发明提供了通过基因突变得到漆酶葡萄糖去阻遏菌株tsp2_l Δ的方法I、菌株和培养基(I)菌株新型隐球酵母血清型D菌株JEC21 (ΜΑΤ α )作为野生型菌株。B4500F0A是JEC21 的尿嘧啶营养缺陷性突变株，作为构建随机突变库的受体菌株。含有质粒PBI121-URA5的根癌农杆菌LBA4404用于B4500F0A的转化。(2)培养基YH)培养基(10g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖；pH 6. O)用于培养新型隐球酵母。LB液体培养基(100 μ g/ml卡那霉素)用于培养根癌农杆菌LBA4404。诱导培养基(磷酸氢二钾O. 136g/L，磷酸二氢钾O. 228g/L，氯化钠O. 146g/L，硫酸镁O. 493g/L，氯化钙O. 103g/L，硫酸亚铁2. 5mg/L，硫酸铵O. 529g/L，2-N-玛琳代乙烷磺酸 7. 8g/L,葡萄糖O. 198g/L,甘油5ml/L,乙酰丁香酮O. 039g/L ；pH 5. 3)用于根癌农杆菌介导的转化。高葡萄糖培养基含有100mg/L去甲肾上腺素的高葡萄糖培养基(20g/L葡萄糖， 1.0g/L天门冬酰胺，3g/L KH2PO4 ；pH 5. I)用于检测黑色素的合成。2、随机突变文库的构建和葡萄糖去阻遏突变株的分离(I)含有pBI121-URA5的根癌农杆菌LBA4404在LB液体培养基(100 μ g/ml卡那霉素)中，28°C培养过夜。离心收集菌体，重新悬浮于液体诱导培养基中，继续培养6小时。 用新鲜的诱导培养基调节菌液OD66tl到I. O (大约IO9个细胞/ml)。(2)新型隐球酵母B4500F0A (JEC21的尿嘧啶营养缺陷型)在YPD培养基中，30°C 培养过夜。用新鲜的Yro培养基I : ο稀释菌液，继续培养6小时。离心收集菌体，重新悬浮于诱导培养基中，利用血球计数板调节细胞浓度到IO8个细胞/ml。等体积的⑴步中的细菌和(2)步中的酵母培养液混合，取100 μ I混合液涂布到含有尿嘧啶的固体诱导培养基上(在诱导培养基中补加50mg/L尿嘧啶，20g/L琼脂粉)， 25°C共培养72小时。用无菌水把菌体洗下，涂布到100mg/L去甲肾上腺素和100mg/L氨苄青霉素(杀死农杆菌LBA4404)的高葡萄糖培养基上，30°C培养3-5天，检测黑色素的合成 (参见图I)。我们分离到了漆酶葡萄糖去抑制突变株LZM36。3、通过反向PCR获得葡萄糖去抑制突变株LZM36的突变基因TSP2-1取菌株tsp2_lA突变株LZM36基因组DNA(2yg)经过Xba I酶切后，用T4DNA 连接酶在200 μ I反应体系中自连过夜(4°C)。取10 μ I连接产物作为模板，用引物( PI-S5'-ACTGGAACAACACTCAACCCTA-3' 和 pl_A 5'-TGGGGTTTCTACAGGACG-3'，或 p2_S 5' -TGGCGGGTAAACCTAAGAG-3' 和 p2_A 5' -CGCACAATCCCACTATCC-3')进行反向 PCR扩增。PCR 产物经测序后与GenBank数据库中的隐球酵母测序计划中的序列进行比对，确定了突变基因 TSP2-1(CNJ00820)。4、通过同源重组定向敲除获得葡萄糖去抑制突变株tsp2_l Δ我们用URA5基因作为Marker，构建敲除载体pBS_TSP21-URA5，通过电转化方法把敲除载体导入受体菌B4500F0A。利用PCR筛选方法得到葡萄糖去抑制突变株tsp2-lA (见图I)，进一步通过Southern Blot验证(见图2)。图I是本发明提供的菌株tsp2_lA的黑色素合成。在2%葡萄糖Asn固体培养基上，30°C，培养16小时后，野生型JEC21菌株没有黑色素合成，而tsp2-l Δ菌株合成了大量
的黑色素。图2是本发明提供的菌株tsp2_l Δ的Southern Blot。野生型基因TSP2-1的 3. 3kb PCR产物作为探针，JEC21含有两条带，4. 9kb和4. 7kb ;tsp2-lA也含有两条带，
5.7kb 和 4. 2kb。实施例2、本发明提供的漆酶葡萄糖去抑制菌株tsp2_l Δ的漆酶表达和活性分析。I、RT-PCR检测漆酶编码基因LACl的表达量野生型菌株JEC21和漆酶葡萄糖去抑制突变株tsp2_l Δ以相同初始接种量(IO6 个细胞/ml)接种到液体高葡萄糖培养基中，在30°C，200rpm条件下培养。分别在0、2、4、6和8小时取样IO8个细胞，提取RNA，通过RT-PCR检测LACl的表达量。结果如图3所示，菌株JEC21中在0-8小时范围内检测不到LAClmRNA，而突变株tsp2-l Δ中任何时间点都检测到了大量的LAClmRNA(见图3，本发明提供的菌株tsp2_l Λ中LACl的转录表达量)，说明漆酶葡萄糖去抑制突变株tsp2-l Δ中解除了 LACl表达的葡萄糖阻遏。2、漆酶活性测定野生型菌株JEC21和漆酶葡萄糖去阻遏突变株tsp2_l Δ以相同初始接种量(IO6 个细胞/ml)接种到2%葡萄糖Asn液体培养基中，在30°C，200rpm条件下培养。在6小时取样IO7个细胞，检测细胞的漆酶活性。用去甲肾上腺素作为底物，IO7个tsp2-lA细胞的漆酶活力是291 ±8U，而等量的野生型JEC21和互补菌株细胞的漆酶活力分别是109±3U 和141 ±41U (测定上清液A475值，定义A475值为O. 001为一个酶活单位)；用2,2'-azinobi s- (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)作为底物，IO7 个 tsp2_l Δ 细胞的漆酶活力是O. 518±0. 004ymol/min，而等量的野生型JEC21的漆酶活力是O. 056±0. 004ymol/ min。结果进一步证实了漆酶葡萄糖去阻遏突变株tsp2-l Λ中解除了漆酶表达的葡萄糖阻遏。
权利要求
1.一株产漆酶葡萄糖去阻遏担子菌新型隐球酵母tsp2_l △，其分类命名为新型隐球酵母 Cryptococcus neoformans tsp2_l Δ ,菌种保藏号CGMCC No. 5274。
2.根据权利要求I所述的微生物菌株，其特征在于该菌株是野生型菌株JEC21的基因 TSP2-1定向敲除突变株，基因TSP2-1的GenBank编号CNJ00820。
3.根据权利要求I所述的微生物菌株，其特征是该菌株可用来在高浓度葡萄糖条件下生产酚氧化酶-漆酶。
4.一种使用权利要求I所述的微生物菌株生产漆酶的方法，其特征在于在高浓度葡萄糖培养基中培养权利要求I所述微生物菌株，以使所述微生物细胞组成型表达漆酶；所述的葡萄糖培养基为2%葡萄糖Asn培养基g/L:天门冬酰胺lg，葡萄糖20g，磷酸二氢钾 3g，pH 5. 1，固体补加20g琼脂粉。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的培养是在需氧条件下进行，温度为 28-30。。。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述微生物菌株在500mL三角瓶中发酵培养，接种方式采用菌液的接种方式。
全文摘要
一株产漆酶葡萄糖去阻遏担子菌新型隐球酵母(Cryptococcusneoformans)tsp2-1△，菌种保藏号CGMCCNo.5274。属于生物工程技术领域。本发明提供了一株产漆酶葡萄糖去阻遏担子菌－新型隐球酵母tsp2-1△。在高浓度葡萄糖(2%)条件下，野生型菌株JEC21的漆酶表达受到抑制，而菌株tsp2-1△的漆酶组成型高表达。漆酶活性测定发现菌株tsp2-1△是野生型菌株JEC21的9.25倍。本发明解决了新型隐球酵母中漆酶生产的葡萄糖阻遏问题。
文档编号C12N9/02GK102586126SQ20121005413
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月5日 优先权日2012年3月5日
发明者孙智雄, 朱旭东, 李中明, 潘皎 申请人:南开大学