专利名称：金黄色葡萄球菌肠毒素a、b基因pcr同步检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种金黄色葡萄球菌肠毒素A、B基因PCR 同步检测试剂盒。
背景技术：
金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus，简称金葡菌)是动物和人类化脓感染中最常见的病原菌，在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到， 因而食品受其污染的机会很多。食品受其污染后，不仅腐败变质，而且部分菌株产生葡萄球菌肠毒素Staphylococcal Enterotoxins，SEs)。肠毒素是一类结构相关，毒力相似，抗原性不同的胞外蛋白质。根据其抗原性可将其分为5个血清型SEA、SEB、SEC、SED和SEE，这五类称为经典肠毒素(其中SEC中包括SEC1、SEC2和SEC3三种亚型)，也是全球食物中毒中最常见的血清型。各型肠毒素均可引起细菌性食物中毒，其中以A、D型引起的食物中毒最多，B型和C型次之。金黄色葡萄球菌在pH值低于5的条件下很少产生肠毒素，当pH值高于9. 8时，无论何型肠毒素都不能产生。葡萄球菌在牛奶和谷粉粥上于20 37°C下经4 他产生毒素，在5 6°C低温下18d产生毒素或不产生毒素。在含水分、蛋白质和淀粉较多的食品中， 葡萄球菌较易繁殖并产生毒素，如带菌的生肉馅，于37°C下经18 19h产生毒素，若在肉馅中加入少量馒头碎屑，在同样温度下只经过他就能产生毒素，可见淀粉对形成毒素有促进作用。引起金黄色葡萄球菌肠毒素中毒的食品主要为肉、奶、鱼、蛋类及制品等动物性食品。糕、凉拌切粉、剩饭和米酒等也曾引起过中毒；熟肉类如在熟后污染了致病葡萄球菌， 又在20 30°C的环境下放置较长时间，则极易引起中毒；奶和奶制品以及用奶制作的冷饮和奶油糕点常是引起中毒的食品；油煎鸡蛋、熏鱼、油浸鱼罐头等含油脂较多的食品，在污染上致病性葡萄球菌以后也能产生毒素。金黄色葡萄球菌在空气中养分低时较易产生毒素，因此带有此菌的食品，在通风不良的高温下放置，极有利此菌生长并产生毒素。当食品污染了葡萄球菌并同时污染了其它微生物时，葡萄球菌的繁殖则受到抑制。如食品经加热， 原有的各种微生物已被杀死，拮抗微生物也不复存在，熟后再一次被葡萄球菌污染，则将会促进葡萄球菌的生长并形成毒素。金黄色葡萄球菌引起的食物中毒在世界各地均有发现。 常发生于夏秋季节，这是因为气温较高，有利于细菌繁殖。但在冬季，如受到污染的食品在温度较高的室内保存，葡萄球菌也可繁殖并产生毒素。当此细菌数> IO6个/克时，产生的肠毒素可引起食物中毒等病症。目前，检测金黄色葡萄球菌肠毒素的方法有酶联免疫双抗法，双向琼脂扩散法。酶联免疫双抗法的缺点是易受食物成分及葡萄球菌蛋白A的影响，检测时间长，费用较高，不利于在基层单位推广使用。双向琼脂扩散法检测时间长，灵敏度低
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供金黄色葡萄球菌肠毒素A、B基因PCR 同步检测引物、其检测试剂盒和检测方法。本发明提供一种金黄色葡萄球菌肠毒素A、B基因PCR同步检测引物，其为SEAB-F :5，-TGATAAATAYAAAGRKAAAffAMGTAG-3‘ (SEQ ID No. 1)SEAB-R :5’ -GTTACACCACCATACATRCAAG-3，(SEQ ID No. 2)。其中，Y为C或T，R为A或G，K为G或T，W为A或T，M为A或C。其中所述的引物扩增片段为SEA的566-670bp的片段和SEB的338_472bp的片段， PCR扩增产物长度分别为105bp和13^p。根据电泳结果，即可判断为何种肠毒素基因。本发明还提供含有上述引物的金黄色葡萄球菌肠毒素A、B基因PCR同步检测试剂盒，所述试剂盒还可包括PCR缓冲液、dNTPs、无菌超纯水和Taq DNA聚合酶等。本发明还提供应用上述的试剂盒在食品中食品中检测金黄色葡萄球菌肠毒素A、B 基因的方法，其包括1)提取食品中的DNA;2)以步骤1)提取的DNA为模板进行PCR反应；3)对PCR产物进行电泳检测。其中，所述的PCR反应体系为每20μ 1的反应液中，含有10-50ng的模板、 20-3(^] 各上下游引物、10\ 0 缓冲液2“ 1,0. 15-0. 25mM 的 dNTPs，1-1. 5U 的 Taq DNA 聚合酶，无菌超纯水补足体积。其中，所述的PCR反应条件为951预变性％^11，951变性308，50 讨1退火 30 60s，72°C延伸lmin，共25 30个循环，最后72°C延伸lOmin。取5 10 μ 1 PCR扩增产物点样于3%琼脂糖凝胶中进行检测，电压为90V，电泳时间为40min，然后于凝胶成像系统中成像，观察PCR扩增产物有无预期的DNA特异性片段。本发明开发了同步检测金黄色葡萄球菌肠毒素A、B基因引物和试剂盒。本发明的检测试剂盒能够准确灵敏地检测食品中的金黄色葡萄球菌肠毒素A、B, DNA最低检测浓度为3. 58ng，而且与其他细菌无交叉反应，特异性好，同时样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品，样品检测成本低于传统的肠毒素检测方法，而且本发明试剂保存时间长，无放射性污染。本发明对解决大批量样品的金黄色葡萄球菌肠毒素A、B的现场检测技术具有重要的现实意义。
图1为简并引物SEAB特异性的琼脂糖凝胶电泳分析图。M =DNA Marker B ；1,8 金黄色葡萄球菌SEA ；2，9 金黄色葡萄球菌SEB ；3 阴性对照；4 金黄色葡萄球菌；5 表皮葡萄球菌；6 大肠杆菌；7 沙门氏菌。图2为金黄色葡萄球菌肠毒素B的DNA灵敏性试验琼脂糖凝胶电泳分析图。M =DNA Marker B ；1,2 :358ng ；3，4 :35. 8ng ；5，6 3. 58ng ；7，8 :358pg ；9，10 :35. 8pg。图3为SEA、SEB在同一个PCR反应管中反应的电泳分析图。M =DNA Marker B ；1 SEA、SEB在同一 PCR反应管中扩增的结果。图4为细菌菌数10倍系列稀释的PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析图。M =DNAMarker B ；1 :2X106cfu/ml ；2 :2X 105cfu/ml ；3 :2X 104cfu/ml ；4 :2X 103cfu/ml ；5 :2X 102cfu/ml ；6 :1. 9 X IO1CfVml ；7 阴性对照。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1简并引物检测金黄色葡萄球菌肠毒素A、B的PCR试剂盒的组建(1)简并引物SEAB上、下游各15mM, 100μ L·(2) IOX PCR 缓冲液(含 Mg2+20mM)，1. 5ml。(3) dNTPs (IOmM)，1. 5ml。(4)无菌超纯水，3. Oml。 (5) Taq DNA 聚合酶(5U/ μ 1)，100 μ 1。其中，上游引物为SEAB-F :5，-TGATAAATAYAAAGRKAAAffAMGTAG-3‘ (SEQ ID No. 1)下游引物为SEAB-R :5，-GTTACACCACCATACATRCAAG-3，(SEQ ID No. 2)。实施例2试剂盒操作取简并上游引物(SEQID No. 1)0. 5 μ 1，简并下游引物(SEQ ID No. 2)0. 5 μ 1, 10 X PCR缓冲液2 μ 1，dNTPs 0. 5 μ 1，Taq DNA聚合酶0. 5 μ 1，无菌超纯水补足至20 μ 1，放入0. 2ml的离心管中，把提取的菌体DNAl μ 1加入上述体系中，总体积为20 μ 1，离心混勻后置PCR仪上进行自动化扩增反应。提取菌体DNA的方法①将Iml无水乙醇、Iml氨水和Iml石油醚加入到5ml人工污染金黄色葡萄球菌肠毒素A、B的乳品样品中，混勻。②混合物以12000xg，离心lOmin。弃去上清液，剩余的沉淀用300 μ 1 10mM/L TE(pH7. 8)溶解。将Syl(IOmgAil)的溶葡萄球菌酶加入到上述液体中，37°C水浴lh，期间不断剧烈振荡。③将50μ1 10%的SDS加入上述液体中，煮沸5min。④将等体积的氯仿加入上述混合液中，充分振荡混勻，17000xg离心lOmin，弃沉
淀，保留上清液。⑤将上清液移入一新的离心管中，用0. 1倍体积2. 5M乙酸铵(pH5.4)，2.5倍体积预冷无水乙醇和5 μ 1 (10mg/ml)糖原沉淀DNA，混合物17000xg，离心20min。DNA沉淀干燥后用50 μ 1 TE溶解，置于-20°C备用。反应条件为95°C预变性％iin，95°C变性30s，52°C退火30s，72°C延伸lmin，共30 个循环，最后72°C延伸IOmin。取5 μ 1 PCR扩增产物点样于3%琼脂糖凝胶中进行检测，电压为90V，电泳时间为 40min，然后于凝胶成像系统中成像，观察PCR扩增产物有无预期的DNA特异性片段。结果表明，在IOObp和130bp左右出现两条特异的条带，而阴性对照则无条带出现。实验例1以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、表皮葡萄球菌为对照菌，利用上述检测方法同时对金黄色葡萄球菌肠毒素SEA菌株，金黄色葡萄球菌肠毒素SEB菌株和对照菌株进行PCR检测，然后对PCR扩增产物进行电泳检测，实验结果见图1。由图可知，简并引物 SEAB只对金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB菌出现PCR阳性扩增反应，对照组未出现特异性片段，该简并引物显示了良好的特异性。实验例2灵敏性实验提取的金黄色葡萄球菌肠毒素B的DNA经紫外分光光度计检测并计算其浓度。DNA 定量测定方法将提取的DNA模板进行适度稀释，用紫外分光光度计测定260nm波长下的 OD值，DNA含量=OD260 X 50 μ g/ml (双链DNA) X 10 (稀释倍数)，经计算得DNA含量=358ng/ μ 1，将其逐步10—1 ； 10_2 ； 10_3 ； 10_4 ； 10_5稀释，分别取1 μ 1为模板进行PCR反应，确定DNA最低检测浓度为3. 58ng,电泳结果见图2所示。实验例3简并引物同时检测肠毒素A、B的实验分别取SEA、SEB菌的DNA 1μ 1为模板，加入到同一个PCR反应管中，无菌超纯水 12 μ 1，其余用量不变，PCR反应条件也不变，电泳结果见图3，由图可知SEA、SEB菌的PCR 特异性片段已扩增出并分离开，说明特异性简并引物SEAB既可以分别检测金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB菌，又可以检测出一个样品中是否同时含有金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、 SEB菌。不但减少了引物用量，节约成本，而且缩短了检测时间，提高检测效率。实验例4菌体灵敏性实验本实验不可以直接进行菌体PCR，因为金黄色葡萄球菌的细胞壁比较厚，煮沸不能破坏其细胞壁，因此必须提取其DNA。本实验的目的就要建立一种能够同时快速检测食品中 A型和B型金黄色葡萄球菌的PCR方法。以金黄色葡萄球菌肠毒素SEB菌株作为检测菌，营养肉汤过夜增菌培养后用无菌生理盐水做一系列10倍稀释，再经平板菌落计数得知各梯度浓度为2X106、2X105、 2X 104、2X 103、2X 102、1. 9X IOlJcfuAil,分别用PCR方法进行检测。检测结果表明本方法的灵敏性为2X103cfu/ml，显示了较好的灵敏性，电泳结果见图4所示。实验例5本发明试剂盒检测生牛乳中的金黄色葡萄球菌肠毒素A、B实施例1的试剂盒检测了 50份生牛乳，结果见表1可知，其中有3份被检出含有 SEA，有4份被检出含有SEB，有2份含有SEA和SEB，产毒素率为18%。本试验结果与Mork 等及Jorgensen等报告生鲜乳中葡萄球菌产毒素率分别为38. 0%和22. 1%，基本一致。表1金黄色葡萄球菌及其肠毒素的检测结果
权利要求
1.金黄色葡萄球菌肠毒素A、B基因PCR同步检测引物，其为SEAB-F :5’ -TGATAAATAYAAAGRKAAAffAMGTAG-3',SEAB-R :5’ -GTTACACCACCATACATRCAAG-3’。其中，Y为C或T，R为A或G，K为G或T，W为A或T，M为A或C。
2.含有权利要求1所述引物的金黄色葡萄球菌肠毒素A、B基因PCR同步检测试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包含PCR缓冲液、dNTPs、无菌超纯水和Taq DNA聚合酶。
4.应用权利要求2或3所述的试剂盒检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素A、B基因的方法，其包括1)提取食品中的DNA;2)以步骤1)提取的DNA为模板进行PCR反应；3)对PCR产物进行电泳检测。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的PCR反应体系为每20μ 1的反应液中，含有10-50ng的模板、20-30pM各上下游引物、10XPCR缓冲液2μ 1、0. 15-0. 25mM的 dNTPs, 1-1. 5U的I1aq DNA聚合酶，无菌超纯水补足体积。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的PCR反应条件为95°C预变性 4min, 95°C变性30s，50 54°C退火30 60s，72°C延伸lmin，共25 30个循环，最后72°C 延伸lOmin。
全文摘要
本发明公开了一种金黄色葡萄球菌肠毒素A、B基因PCR同步检测引物、其检测试剂盒和检测方法。本发明提供的同步检测引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1和2所示。本发明还提供含有所述引物的PCR检测试剂盒。本发明的检测试剂盒能准确灵敏地检测食品中的金黄色葡萄球菌肠毒素A、B，DNA最低检测浓度为3.58ng，而且与其他细菌无交叉反应，特异性好，同时样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品，成本低。
文档编号C12R1/445GK102534041SQ20121005420
公开日2012年7月4日 申请日期2012年3月2日 优先权日2011年4月13日
发明者刘继超, 周伟明, 姜铁民, 陈历俊 申请人:北京三元食品股份有限公司