专利名称：黄姑鱼物种特异性标记引物及黄姑鱼成分的分子溯源方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和食品安全领域，公开了一种食品中黄姑鱼成分的溯源方法，及黄姑鱼物种特异性标记引物序列。
背景技术：
食品溯源制度，也叫可追踪系统，是食品安全管理一项重要手段，最初由欧盟为应对“疯牛病”问题于1997 年开始逐步建立。在渔业方面的溯源主要有鱼种鉴定溯源、地域溯源、生产方式溯源(野生或养殖，有机生产或集约化生产)、加工方式溯源(烘焙、油炸、辐照)等方面，因此食品鉴伪作为食品溯源的一个内容，通过对食品成分的鉴定，以及对食品标签的核实，进而可以有效预防食品造假，从真正意义上保障消费者权益。当发生食物中毒或者过敏时，对呕吐物等残渣进行快速成分检测，便于物种鉴定溯源，以及时确定是哪种食物出现问题。鱼糜制品营养价值高，携带食用方便，原料来源丰富，不受鱼种、大小的限制，可以将商品价值低但营养价值高的鱼类资源，充分合理地利用。近十年来，我国冷冻鱼糜、鱼糜制品的生产及其出口量逐年增加，已成为重要的水产加工品种之一，2008年全国鱼糜制品产量有819122t。但是，在鱼糜加工中，物种的原始可识别形态特征消失，这使得物种的鉴别变得相对困难。生产商常常是采用一些与原材料成分相似的成分进行替代，比如以低价鱼产品代替高附加值产品出售，一方面大大损害了消费者的利益，另一方面也造成了不正当的商业竞争。为杜绝此类现象的发生，国际上很多国家都制定了标签法，规定在海洋食品标签中明确海洋食品的种类和来源。由于食物产品标签容易丢失、记录出差、标记图案模糊不清以及标签容易人为改换等方面的缺点，使得标签上的欺诈性错误描述是一个普遍存在的问题。因此，迫切需要一些灵敏的和可靠的检测方法来鉴定加工海洋食品的物种来源。现代分子生物学技术因其易分型、重复性好、检测手段简单快捷、成本低廉等成为目前国际上被公认为的最具发展潜力和应用价值的快速溯源技术，其中物种的特异性鉴定PCR对样品的需要量很少，灵敏度高、结果可靠、操作简便，对特定物种的检测效果良好，已被广泛应用于猪、牛、鸵鸟、鸡等的畜禽类的物种鉴定。但是目前利用物种特异性分子标记对鱼糜制品等海洋深加工食品，以及对呕吐物进行全程监测鉴定以达到对原料鱼追溯的研究尚未见报道。本研究采用普通PCR方法，用一对黄姑鱼的特异性引物对加工过程以及食用过程中的黄姑鱼成分进行鉴定。该方法特异性强，灵敏度高，具有很高的应用价值，可为质检部门和检验检疫部门提供技术支持。
发明内容
本发明旨在提供一种黄姑鱼的分子溯源和鉴定方法。本发明还提供了黄姑鱼物种特异性标记引物，用于鉴定和溯源黄姑鱼的成分。这种黄姑鱼物种特异性标记引物，DNA序列如SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2所示；即 上游引物序列为5'-aacctcacccttccttgtcct-31 ；下游引物序列为5'-atcctccttcaggcgtgtttcaa-3'。采用该引物，可对黄姑鱼成分进行溯源鉴定，包括以下步骤(I)取样品，提取基因组DNA，得到模板DNA ；(2)采用上述黄姑鱼物种特异性标记引物，PCR扩增模板DNA，扩增产物为193bpDNA片段的，鉴定结果为样品中含有黄姑鱼成分。PCR扩增产物可用凝胶电泳来检测。优选的，步骤⑵中所述的PCR扩增条件为93 95°C预变性3. 5 5min ；32 36个循环91 95°C变性28 32s，55 57°C退火42 50s，70 73°C延伸56 65s ；然后再70 73°C延伸9 12min。更优选的PCR扩增条件为94°C预变性4min ；35个循环94°C变性30s，56°C退火45s，72。。延伸 Imin ;然后再 72°C延伸 IOmin0本发明所涉及黄姑鱼的物种特异性标记引物和分子溯源方法，能对黄姑鱼从原料到制品进行成分的鉴定和溯源；甚至可以对呕吐物以及从消费者消化器官中采集的残渣中DNA进行快速检测；鉴定方法简便、快速、准确。本发明可用作水产品中黄姑鱼成分的鉴定及溯源，以便在食品安全事件中果断采取措施，尽可能缩小召回范围，最大限度地降低风险和经济损失。本发明分析海水鱼、淡水鱼、禽畜肉及植物的线粒体12S rDNA基因序列，通过比较和优化条件，设计出一对针对黄姑鱼的特异性PCR引物。提取黄姑鱼和常用于鱼糜制品原料的DNA，用该引物进行PCR扩增，证实该引物有特异性。再用该对引物对黄姑鱼原料、黄姑鱼鱼糜、黄姑鱼鱼丸等各个加工阶段的产品进行PCR扩增，检测发现有很高的灵敏度。用该引物PCR扩增后所得到的黄姑鱼的分子标记DNA片段大小为193bp。运用该对引物对黄姑鱼鱼丸加工的各个阶段进行PCR检测，都得到了 193bp的目标片段，且所设计的引物可以检出黄姑鱼比例仅占O. 5%的鱼糜混合物，结果表明此对引物对黄姑鱼DNA鉴定具有很高的特异性和灵敏度，从而达到了对黄姑鱼进行特异性分子追溯的目的。
图I为鱼丸中常见原料物种基因组DNA提取电泳图谱，其中，M = AHindIIImarker ；1 :黄姑鱼；2 :大黄鱼；3 :海鳗；4 :带鱼；5 :白鲢；6 :草鱼；7 :鳙鱼；8 :鸡肉；9 :猪肉；10 :玉米淀粉；11 :小麦淀粉。图2为黄姑鱼鱼糜各阶段产品基因组DNA提取电泳图谱，其中，M = AHindIIImarker ；1 :黄姑鱼原料；2 :黄姑鱼鱼糜；3 :加盐黄姑鱼鱼糜；4 :加工成型鱼丸；5 :经沸水蒸煮鱼丸；6 :经油炸的熟制鱼丸；7 :经口腔咀嚼后采集鱼丸碎片；8 :含胃液的鱼丸呕吐物。图3为黄姑鱼特异性引物对不同鱼糜原料进行PCR扩增的电泳图谱，其中，M :IOObp DNAladder N :阴性对照I :黄姑鱼；2 :大黄鱼；3 :海鳗；4 :带鱼；5 :白鲢；6 :草鱼；7 :鳙鱼；8 :鸡肉；9 :猪肉；10 :玉米淀粉；11 :小麦淀粉。图4为黄姑鱼特异性引物对不同比例混合鱼糜进行PCR扩增的电泳图谱，其中，M :IOObp plus DNA ladder ；N :阴性对照；1 :黄姑鱼鱼糜0% +大黄鱼鱼糜100% ;2 :黄姑鱼鱼糜O. 5% +大黄鱼鱼糜99. 5% ;3 :黄姑鱼鱼糜1% +大黄鱼鱼糜99% ；4 :黄姑鱼鱼糜3% +大黄鱼鱼糜97% ；5 :黄姑鱼鱼糜5% +大黄鱼鱼糜95% ；6 :黄姑鱼鱼糜10% +大黄鱼鱼糜90% ；7 :黄姑鱼鱼糜100% +大黄鱼鱼糜0%。图5为黄姑鱼特异性引物对不同加工阶段的黄姑鱼产品进行PCR扩增的电泳图谱，其中，M 100bp plus DNAladder ；N :阴性对照；1 :黄姑鱼原料；2 :黄姑鱼鱼糜；3 :加盐黄姑鱼鱼糜；4 :加工成型鱼丸；5 :经沸水蒸煮鱼丸；6 :经油炸的熟制鱼丸；7 :经口腔咀嚼后采集鱼丸碎片；8 :含胃液的鱼丸呕吐物。
图6为实施例6对黄姑鱼原料、黄姑鱼鱼糜、加盐黄姑鱼鱼糜、加工成型鱼丸(水发鱼丸配方)、经沸水蒸煮鱼丸、经油炸的熟制鱼丸、经咀嚼后采集鱼丸碎片及鱼丸呕吐物(含胃液)八个阶段的样品进行DNA提取及PCR扩增的电泳图谱。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步详细、完整地说明。PCR扩增仪，德国Eppendorf公司；DK_8D型电热恒温水槽，上海一恒科技有限公司；DYY-6C型电泳仪，北京六一仪器厂；高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；凝胶成像系统，购自美国伯乐Bio-RAD(美国)；琼脂糖购自上海基因科技有限公司(进口分装)。实施例I黄姑鱼物种特异性引物的设计根据常用于常用鱼糜原料的12S rDNA序列，设计出黄姑鱼物种特异性引物Forward 5' -aacctcacccttccttgtcct-3'；Reverse 5' -atcctccttcaggcgtgtttcaa-3'；目的片段约193bp，引物由上海生物工程公司合成。 实施例2鱼糜制品的加工(I)取原料鱼(黄姑鱼、大黄鱼、带鱼、白鲢、草鱼、鳙鱼、鳗鱼等)，去头、去内脏后清洗，采肉，漂洗，精滤，脱水后，将配料擂溃，得到鱼糜；(2)取鱼糜制成水发鱼丸和油炸鱼丸；配方I (水发鱼丸)冷冻鱼糜lkg、精盐2%、味精I %、鸟苷酸+肌苷酸O. I %、玉米淀粉10 %、蔗糖4 %、山梨醇4 %、多磷酸盐O. 3 %、蛋清5 %、黄酒2mL、清水适量。配方2 (油炸鱼丸)冷冻鱼糜lkg、精盐2%、味精I %、鸟苷酸+肌苷酸O. I %、玉米淀粉10 %、蔗糖4%、山梨醇4%、多磷酸盐O. 3 %、蛋清5 %、黄酒2mL、猪油脂3 %、蒜泥、姜汁适量、清水适量。将冷冻鱼糜按配比与其他原料混合成型，分段加热(40°C，20min ；75°C,3min)后冷却。实施例3常用于鱼糜制品中原料DNA的提取
大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)、黄姑鱼(Nibea albiflora)、带鱼(Coiliaspp)、白链(Hypophthalmichthysmolitrix)> 草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鋪鱼(Aristichthysnobilis)(购自上海芦潮港水产市场)，獲鱼(Muraenesox cinereus)、鸡肉(Gallus gallus domestica)、猪肉(Sus domesticus)、玉米(Zea mays L.)淀粉、小麦(Triticum aestivumLinn.)淀粉。其中鱼类DNA提取采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒，植物类DNA提取采用植物基因组DNA提取试剂盒，禽畜类DNA提取采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，按说明书提取所有样品基因组DNA，以上试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司。
并用同样方法提取不同加工阶段的黄姑鱼产品的基因组DNA :黄姑鱼原料、黄姑鱼鱼糜、加盐黄姑鱼鱼糜、加工成型鱼丸(水发鱼丸配方)、经沸水蒸煮鱼丸、经油炸的熟制鱼丸、经咀嚼后采集鱼丸碎片及鱼丸呕吐物(含胃液)。实施例4所提取原料基因组DNA的质量鉴定从NCBI中检索到真核生物18SrDNA的部分序列，用Primer 5. O软件设计引物Forward 5; -attacccatttccgacac-3'；Reverse :5' -tctcccgagatccaacta-3'；目的片段约230bp，引物由上海生物工程公司合成。扩增在型号为TC_24/H(b)的PCR仪上进行。扩增条件为每次扩增采用25 μ L体系，反应混合液含有2 μ L模板DNA，
O.25 μ L Taq酶(lU/yL，购自 TAKARA公司)，2.5yL 10XPCR buffer,2y L MgCl2(25mmol/L)，2 μ L dNTP (2. 5mmol/L)，弓丨物各 O. 3 μ L (25mol/L)。反应条件为95°C预变性5min，35个循环(95°C变性30s，60°C退火45s，72°C延伸2min)，然后72°C延伸IOmin。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后在紫外光下凝胶成像。鱼丸中常用物种黄姑鱼、大黄鱼、海鳗、带鱼、白鲢、草鱼、鳙鱼、肌肉、猪肉、玉米淀粉及小麦淀粉基因组DNA鉴定的电泳图谱如图I ;不同加工阶段的黄姑鱼产品的基因组DNA鉴定的电泳图谱如图2所示；鱼丸中常用物种18Sr RNA PCR产物扩增结果电泳图谱如图3所示。从电泳图谱可见，各原料基因组的DNA模板经上述方法扩增后，均产生约230bp的片段。说明提取的模板DNA质量均满足PCR扩增的要求。实施例5黄姑鱼特异性片段PCR扩增反应利用实施例I的黄姑鱼物种特异性引物对实施例3得到的各原料基因组DNA序列进行扩增Forward :5' -aacctcacccttccttgtcct-3'；Reverse :5' -atcctccttcaggcgtgtttcaa-3'；目的片段约193bp，扩增在型号为TC_24/H(b)的PCR仪上进行。扩增条件为每次扩增采用25 μ L体系，反应混合液含有2 μ L模板DNA，O. 25 μ L Taq酶(IU/ μ L，购自TAKARA公司)，2.5yL 10XPCR buffer,2y L MgCl2 (25mmol/L), 2 μ L dNTP (2· 5mmol/L)，引物各O. 3μ L(25mol/L)。反应条件为94°C预变性 4min，35 个循环(94°C, 30s ；56°C,45s ；72°C,lmin)，然后 72°C延伸 IOmin0PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后在紫外光下凝胶成像。结果如图4所示，只有黄姑鱼基因组的DNA序列在扩增后产生约193bp的特异性片段。PCR产物经测序，长度为193bp，序列为aacctcacccttccttgtccttccgcctatataccgccgtcgtcagcttaccttgtgaaagactaatagtaagcgaaattggtacagccctaaacgccaggtcgaggtgtagcgtatggaaggggaagaaatgggctacattctctaatatagagaac acggatgacgtgttgaaacacgcctgaaggaggat ;艮P SEQ ID No. 3。
实施例6黄姑鱼物种特异性PCR扩增的灵敏度分析用上述实施例5的方法检测(I)黄姑鱼鱼糜与大黄鱼鱼糜以不同比例混合
黄姑鱼鱼糜与大黄鱼鱼糜比例分别以黄姑鱼鱼糜重量比例(m/m)为0%、0. 5%、1%,3%,5%,10%,100%充分混合，随机采样，用实施例3方法进行DNA提取，并用实施例5的方法进行PCR扩增。电泳图谱如图5所示。从电泳结果可见，用该特异性引物及特异性PCR扩增方法，在含有黄姑鱼成分的鱼糜中可检测出193bp的特异性片段，而在大黄鱼鱼糜中不出现该特异性片段，而且随着黄姑鱼含量的增长，扩增条带也逐渐变亮。(2)黄姑鱼从原料至食用各阶段采样在制作黄姑鱼鱼丸以及食用阶段，实验选取了黄姑鱼原料、黄姑鱼鱼糜、加盐黄姑鱼鱼糜、加工成型鱼丸(水发鱼丸配方)、经沸水蒸煮鱼丸、经油炸的熟制鱼丸、经咀嚼后采集鱼丸碎片及鱼丸呕吐物(含胃液)八个阶段的样品进行DNA提取及PCR扩增。电泳图谱如图6所示，证明本发明的黄姑鱼特异性引物，可对从原料到各食用阶段的样品进行检测和追溯。PCR产物测序，目的片段长度193bp，序列为SEQ ID No. 3。
权利要求
1.一种黄姑鱼物种特异性标记引物，其特征在于，DNA序列如SEQ ID No. I和SEQ IDNo2所示； 上游引物序列为5' -aacctcacccttccttgtcct-31 ； 下游引物序列为5' -atcctccttcaggcgtgtttcaa-3'。
2.黄姑鱼成分的分子溯源方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)取样品，提取基因组DNA，得到模板DNA; (2)采用权利要求I所述黄姑鱼物种特异性标记引物，PCR扩增模板DNA，扩增产物为193bp DNA片段的，鉴定结果为样品中含有黄姑鱼成分。
3.权利要求2所述黄姑鱼成分的分子溯源方法，其特征在于，步骤(2)中所述的PCR扩增条件为 93 95°C预变性3. 5 5min ；32 36个循环91 95°C变性28 32s，55 57°C退火42 50s，70 73°C延伸56 65s ;然后再70 73°C延伸9 12min。
4.权利要求2所述黄姑鱼成分的分子溯源方法，其特征在于，步骤(2)中所述的PCR扩增条件为 94°C预变性4min ;35个循环94°C变性30s，56°C退火45s，72°C延伸Imin ;然后再72°C延伸IOmin0
5.权利要求2所述黄姑鱼成分的分子溯源方法，其特征在于，用凝胶电泳检测步骤(2)所得的PCR扩增产物。
全文摘要
本发明涉及分子生物学和食品安全领域，公开了一种黄姑鱼物种特异性标记引物和黄姑鱼成分的快速溯源方法，以便在食品安全事件中及时采取措施，最大限度地降低风险和经济损失。引物序列为5′-aacctcacccttc cttgtcct-3′；和5′-atcctccttcaggcgtgtttcaa-3′。检测方法为提取基因组DNA，特异PCR扩增产物的获得，产物为193bp DNA片段的，鉴定结果为样品中含有黄姑鱼成分。此对引物对黄姑鱼DNA鉴定具有很高的特异性和灵敏度；本方法能对黄姑鱼从原料到制品，甚至是消费者消化器官中采集样品的DNA进行快速检测，可用作水产品中黄姑鱼成分的鉴定及分子溯源。
文档编号C12N15/11GK102618636SQ201210054388
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月2日 优先权日2012年3月2日
发明者汪之和, 潘迎捷, 王锡昌, 赵勇, 赵文秀 申请人:上海海洋大学