专利名称：一组控制水稻抽穗期的dth2基因及其单倍型和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一组控制水稻抽穗期的DTH2基因及其单倍型和应用。
背景技术：
抽穗期是一个重要的农艺性状，并且可能在作物的驯化过程中被选择(Izawa T. Journal of Experimental Botany 58 :3091-3097 (2007)) 栽培稻目前分布在世界范围内的从北纬53°到南纬40°之间的广大地区(Chang T. T. Euphytica 25， 425-441 (1976)) ο然而,亚洲栽培稻的祖先普通野生稻，主要分布在南亚,东南亚和澳大利亚北部，其分布的最北限位于北纬28°的东乡野生稻。水稻驯化的一个重要目的是产生适应各地区种植的水稻品种，从而扩大栽培面积。影响栽培稻向北扩张的主要限制因素就是抽穗期。在高纬度地区(例如亚洲东北部)，早抽穗和对光周期不敏感的特性，保证了水稻能在寒冷天气来临之前种子发育成熟。因此，为满足日益增长的人口对粮食的需求，寻找能扩大栽培稻种植面积的关键基因，并克隆相应基因，阐明其遗传基础和分子机理，对培育广适性水稻品种具有重要的理论和实践意义。水稻品种的抽穗期主要由其感光性、感温性和基本营养生长性决定(Chang T T, Li C C，Vergara B S. (1969) Euphytica, 18 :79 91 ；Tsai K H. (1985) Rice Genet Newslett, 2 :77 78 ;Tsai K H. (1986)In Rice Genetics. International Rice Research Institute, 339 349)。水稻品种感光性、感温性和基本营养生长性组合的多样性，使得抽穗期的遗传表现异常复杂，经典遗传学和分子遗传学都证明抽穗期是由少数质量性状基因和多个数量性状基因(QTL Quantitative Trait Locus)控制的。到目前为止，已经有20个水稻抽穗期基因被克隆，其中有6个是通过精细定位图位克隆的途径克隆的。如Hdl，Hd6， Hd3a，Ehdl，Ghd7和DTH8(Yano，M. et al. (2000) Plant Cell 12，2473-2483 ;Takahashi，Y.， Shomura,A. ,Sasaki,T. & Yano’M. (2001)Proc Natl Acad Sci USA 98,7922-7927 ；Kojima, S，，Takahashi, Y. & Kobayashi, Y. (2002)Plant Cell Physiol 43，1096-1105 ;Doi，K. et al. (2004)Genes. Dev. 18,926-936 ；Xue, ff. Y. et al. (2007)Nat. Genet. 40，761-767 ；ffei, X.J.et al. (2010)Plant. Physiol. 153,1747-1758)。对于抽穗期基因来说，由于各地光周期的差异，不同地区的人可能会选择不同类型的光敏感材料以适应当地的光照条件。研究发现Hdl和Ghd7的等位基因的自然变异和水稻的分布区有关，但Hdl和Ghd7的等位变异对于品种抽穗期的改变过于剧烈，对其它基因也有很强的上位作用，因此，在品种抽穗期的改良上很难应用。而微效基因的改变较易适应环境的缓慢变化，更具有适应性，在育种上有重要意义。另外判断一个基因是否是驯化基因，主要看该基因在野生稻中的等位基因类型对人类是无利的，而经过驯化以后栽培稻中的等位基因类型对人类是有利的。即人类驯化选择了对人类有利的性状，但并不是所有的有利性状都是驯化的。利用源于粳稻品种Asominori和籼稻品种IR24的重组自交系(RILs)群体，我们之前的研究检测到多个抽穗期 QTL(Wei XJ, et al. (2010)Mol Breeding 25 :287-298)，其
3中我们关注位于第二染色体长臂末端RM318和RM240之间的微效抽穗期QTL (该QTL在本发明中被命名为DTH2)，在自然长日照条件下，包含Asominori等位基因的植株比包含IR24 等位基因的植株提前抽穗。到目前为止，还没有发现通过QTL克隆的基因属于在长日照条件下促进开花的类型(Tsuji H, Taoka KI and Shimamoto K (2010) Current Opinion in Plant Biology 14:1-8)。精细定位水稻抽穗期QTL最好的办法就是构建染色体片段置换系(CSSL)或近等基因系(NIL)，使目标QTL位点之外的绝大部分背景保持一致，使该位点表现为典型的孟德尔遗传，即数量性状质量化。但是对于微效QTL来说，在F2群体里，由于杂合型单株和隐性纯合型单株的表型差异较小，在构建NIL的基础上，还需要把F2群体繁衍成F2:3家系群体，使表型易于鉴定。之后把QTL分解为单个基因并进行图位克隆，即通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定目的基因在染色体上的物理位置。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供了一组控制水稻抽穗期的DTH2 基因及其单倍型和应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现一个控制水稻抽穗期基因DTH2，它来自水稻，长度为7867bp，相应编码CCT/B-box 锌指蛋白的407个氨基酸，显性等位基因DTH2-a(DTH2等位基因来自一个日本的粳稻品种 Asominori)全序列为SEQ ID NO. 1，其CDS序列如SEQ ID NO. 2所示，属于DTH2基因的单倍型 5 (Haplotype5, Hap5)。所述的控制水稻抽穗期基因DTH2在水稻品种改良中的应用。所述的基因DTH2的隐性等位基因DTH2_i (DTH2等位基因来自一个国际水稻所的籼稻品种IR24)，核苷酸全序列如SEQ ID NO. 3所示，其CDS序列如SEQ ID NO. 4所示，属于 DTH2 基因的单倍型 I (Haplotypel，Hapl)。所述的基因DTH2的隐性等位基因DTH2_i在水稻品种改良中的应用。所述的基因DTH2的单倍型2 (Hap2)，其⑶S序列如序列表SEQ ID NO. 5所示。所述的基因DTH2的单倍型2在水稻品种改良中的应用。所述的基因DTH2的单倍型3 (Hap3)，其⑶S序列如序列表SEQ ID NO. 6所示。所述的基因DTH2的单倍型3在水稻品种改良中的应用。所述的基因DTH2的单倍型4 (Hap4)，其⑶S序列如序列表SEQ ID NO. 7所示。所述的基因DTH2的单倍型4在水稻品种改良中的应用。根据图I的技术路线，本发明为精细定位QTL DTH2，利用以Asominori为背景亲本，IR24为供体亲本的染色体片段置换系(CSSLs)群体(南京农业大学水稻研究所保存)，鉴定出晚抽穗的携带DTH2-i插入片段的家系CSSL18。从CSSL18与Asominori杂交构建的次级F2群体中，再次检测到DTH2(L0D值24. 70，贡献率26. 22% )0进一步利用分子标记辅助选择的方法(MAS)，构建了仅携带DTH2的近等基因系一NIL(DTH2)并利用 NIL(DTH2) XAsominori的次级F2、F2l3以及F3:4群体，最终将DTH2限定在标记dCAPS3与 dCAPS5之间约37. 6kb的区间范围内，共有9个候选基因。序列分析发现第5个基因，编码 CCT/B-box锌指蛋白，且与拟南芥C0L9同源，暗示着该基因可能是目的基因。通过构建一个包含该基因的7867bp基因组区段的转基因组全长互补载体，转入NIL(DTH2)中，发现T2R转基因家系抽穗提前。通过Real-time RT PCR发现，DTH2在水稻抽穗期途径中位于Hd3a 和RFTl的上游。随后通过对79份栽培稻和48份野生稻的测序，发现在DTH2编码区存在 5个碱基差异，导致3个氨基酸变化，产生5种单倍型。并证明DTH2在驯化中被选择，且起源于中国。有益效果I.本发明通过构建近等基因系NIL(DTH2)，并利用NIL(DTH2) XAsominori的次级 f2、f2:3以及f3:4群体，通过图位克隆的方法，最终克隆了一个扩大栽培稻向北分布区及控制水稻抽穗期的微效基因DTH2，此基因是第一个通过图位克隆的方法克隆的在长日条件下促进水稻抽穗的基因，为扩大栽培稻向北分布区提供新的基因资源，也为其他作物利用电子克隆法克隆相关基因提供了基因序列，进一步分析发现该基因是一个驯化基因，为水稻的进化研究提供新的思路。2.将DTH2_a导入包含DTH2_i的育种材料中，可以使该材料的抽穗期提前，种植范围由其原产地向北迁移，扩大栽培稻的向北分布区。3.本发明克隆的基因与驯化相关，其驯化模式可为水稻、玉米和大豆等农作物的光周期反应和分子进化研究提供参照。
图I.本发明的总体技术流程2. DTH2的精细定位和转基因全长互补T2代和干扰T2代的结果。A图是DTH2精细定位图；B图表示DTH2的基因结构；C_D图表示转基因全长互补 T2代和干扰T2代及两亲本Asominori和NIL(DTH2)的表型(C)和抽穗期数据(D)，P1和P2 分别指全长互补转基因植株和NIL(DTH2)及干扰植株和Asominori之间的P值，采用威尔科克森符号秩检验，P3指两亲本之间的P值，采用双尾t检测，η指实验中检测的植株数，平均值 ± s. e. nio图3.本发明中用到的双元载体PCAMBIA1305. I的载体图。图4. DTH2编码区的自然变异和地理分布分析。图A是对79个栽培稻和48个野生稻的DTH2编码区测序的结果，显示了 5个SNP 和5种单倍型；图B显示了 5种单倍型的地理分布；图C显示了 5种单倍型的转基因结果， 平均值土s. e. m, P值采用双尾t检测得出；图D显示了 5种单倍型在不同亚种之间的分布和它们之间的进化关系。
具体实施例方式实施例I DTH2近等基因系的构建I. DTH2的QTL检测，回交与选择利用Asominori和IR24的RILs群体，我们之前的研究检测到多个控制抽穗期的基因位点，其中的一个位点DTH2,在自然长日照(natural long-day, NLD)条件下,包含 DTH2-a的植株比包含DTH2-i的植株提前抽穗。利用以Asominori为背景亲本，IR24为供体亲本的CSSLs群体，我们发现CSSL18比背景亲本Asominori具有极显著迟熟且表达稳定，由于CSSL18与背景亲本Asominori相比，仅在某些片段上插入了 IR24片段，因此插入的籼稻片段IR24是导致CSSL18具有极显著迟熟的根本原因。我们将CSSL18与Asominori 杂交一次，连续回交4次，然后自交构建一个包含374个单株的CSSL18/ASominori BC4F2群体，采用IciMapping v2. I软件，从中再次检测到DTH2。目标区段确定在两个SSR(Simple Sequence Repeat)标记RM318和RM240之间(RM系列引物公知公用，见网站www. gramene. org)，遗传距离9. 6cM(厘摩)。从表I可以看出在这个区间存在一个控制抽穗期的QTL，贡献率26. 22 %，运用MAS技术，选择在DTH2区段为纯合IR24基因型，而在其他区段为纯合 Asominori背景的单株即为NIL(DTH2)。表I.位于RM318和RM240之间控制抽穗期的QTL
QTL标记区间染色体LOD%PVEadDTH2RM318-RM240224.7026.225.03-1.17% PVE :解释表型变异率；a :加性效应；d :显性效应。2.微卫星标记基因型鉴定方法(SSR技术)PCR标准程序参见J.萨姆布鲁克等，2002,分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社。PCR采用20 μ I反应体系如下DNA模版20-50ng，引物O. 5μΜ， dNTPlOO μ Μ, I Xbuffer (Mg2+ plus)和 IU rTaqDNA 聚合酶(购自日本 Takara 公司)。PCR 扩增条件为=98°预变性3分钟；94° 30秒，55° 30秒，72° I分钟，35个循环；72°延伸 7分钟。PCR产物在6%的聚丙烯酰胺凝胶上分离后进行银染(Basam，et al. (1991)Anal. Biochem. 196 :80-83)。实施例2 DTH2的精细定位与图位克隆I.两亲本的抽穗期表型鉴定抽穗期指单株的第一个穗子抽出的日期；抽穗期天数指单株自播种到第一个穗子抽出的天数；极端晚抽穗单株指抽穗期与亲本NIL(DTH2)相同或更晚的单株；极端晚抽穗家系指一个随机家系中大部分单株抽穗都相同或晚于亲本NIL(DTH2)的家系。在北京NLD 条件下(中国农业科学院作物科学研究所东门网室)，NIL(DTH2)比Asominori晚抽穗7. 4 天(表I,图2C)。而在海南自然短日照(natural short-day,NSD)条件下(海南陵水南京农业大学南繁基地)，两亲本抽穗没有显著差异。经过光照培养箱严格的长日照(LD，14小时光照/10小时黑暗)与短日照(SD，10小时光照/14小时黑暗)处理，结果分别与在NLD 和NSD条件下的一致(表2)。表2. Asominori和NIL(DTH2)在不同光照条件下的抽穗期表现
权利要求
1.一个控制水稻抽穗期基因DTH2，它来自水稻，长度为7867bp，相应编码CCT/B-box 锌指蛋白的407个氨基酸，显性等位基因DTH2-a全序列为SEQ ID NO. 1，其⑶S序列如SEQ ID NO. 2 所示。
2.权利要求I所述的控制水稻抽穗期基因DTH2在水稻品种改良中的应用。
3.权利要求I所述的基因DTH2的隐性等位基因DTH2-i，核苷酸序列如SEQID NO. 3 所示，其CDS序列如SEQ ID NO. 4所示。
4.权利要求3所述的基因DTH2的隐性等位基因DTH2-i在水稻品种改良中的应用。
5.权利要求I所述的基因DTH2的单倍型2，其⑶S序列如序列表SEQID NO. 5所示。
6.权利要求5所述的所述的基因DTH2的单倍型2在水稻品种改良中的应用。
7.权利要求I所述的基因DTH2单倍型3，其⑶S序列如序列表SEQID NO. 6所示。
8.权利要求7所述的所述的基因DTH2的单倍型3在水稻品种改良中的应用。
9.权利要求I所述的基因DTH2的单倍型4，其⑶S序列如序列表SEQID NO. 7所示。
10.权利要求9所述的所述的基因DTH2的单倍型4在水稻品种改良中的应用。
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域，涉及一组控制水稻抽穗期的DTH2基因及其单倍型和应用。该基因编码一个CCT/B-box锌指蛋白，属于CONSTANS-Like转录因子基因家族，显性等位基因序列如SEQ ID NO.1所示，只在长日照条件下促进开花。隐性等位基因的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。通过转基因实验证明了该基因具有使水稻抽穗期提前的功能。通过对79份栽培稻和48份野生稻的测序，发现在DTH2编码区存在5个碱基差异，导致3个氨基酸变化，产生五种单倍型。并证明该基因在驯化中被选择，且起源于中国。
文档编号C12N15/29GK102586277SQ201210054659
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月5日 优先权日2012年3月5日
发明者万建民, 吴玮勋, 江玲, 郑晓明, 钟铮铮, 陆广文 申请人:南京农业大学