一种富硒光滑假丝酵母菌株fxy-4及其培养方法和作为鱼饲料添加剂的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体地说，本发明设及一种富砸光滑假丝酵母菌株 FXY-4及其培养方法和作为鱼饲料添加剂的应用。
【背景技术】
[0002] 砸（Se)是动物体必需的微量元素，在维护动物健康方面发挥着重要作用，但过量 的砸会对机体产生毒害作用，因此砸在动物饲料中最适添加量的研究得到了广泛开展。鱼 类饲料中砸的营养学研究表明，饲料中过高或过低的砸含量均会影响鱼类健康。水产集约 化养殖过程中，一些致病菌，特别是肠道条件性致病菌，能迅速繁殖，进而引发相应的疾病。 目前，主要是通过在饲料中添加抗生素的方法来控制和减弱应激。抗生素补给后可W抑制 鱼肠道致病菌的生长繁殖、有利于有益菌的生长，从而维持肠道的正常微生物群落结构。然 而，抗生素在饲料中的大量使用存在着严重的弊端，比如抗生素引起内源性感染和二重感 染、耐药菌株的产生、免疫力下降和水产品及环境中残留等。益生菌具有安全、无污染、具有 免疫增强功能等优点，成为抗生素替代品的首选，而酵母更是益生菌中使用最广泛的一种 微生态制剂。
[0003] 充分发挥富砸酵母增强免疫和促进生长的活性，筛选得到富砸能力强的酵母，对 水产养殖业具有重要的现实意义。本专利筛选具有增强免疫和抗应激功能的富砸能力强的 光滑假丝酵母菌株；同时，饲料中添加该菌株后，可W降低抗生素在饲料中的添加量，从而 有效降低饲料生产成本。目前，高产富砸光滑假丝酵母在水产养殖饲料中的应用尚未有报 道。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术中存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种富砸光滑假丝酵 母，然后通过化学诱变方法，获得了 1株高产富砸酵母FXY-4。通过鉴定，该菌株不仅具有光 滑假丝酵母（Candidagl油rata)的生理生化特性，且同时具备高富砸能力和益生属性。 阳0化]本发明另一目的在于提供了上述所述光滑假丝酵母（Candidagl油rata)FXY-4的 培养方法。
[0006] 本发明的还一目的在于提供了上述所述富砸光滑假丝酵母（Candidagl油rata) FXY-4作为鱼饲料添加剂的应用。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采取W下技术方案：一种富砸光滑假丝酵母FXY-4,其 获得方式如下：
[0008] 将泡菜汁样品稀释后涂布到YEPDQOg酵母粉，20g蛋白腺，20g葡萄糖，1L水， P册.0)培养基的平板上，28Γ下培养，每隔一段时间观察菌落生长状态，并挑取单菌落转接 到YEPD斜面上保存，然后用含NazSeOs(终浓度为0. 5g/L)的YEPD培养基中进行富砸酵母菌 的筛选，随后将初筛得到的酵母菌用YEPD培养基进行培养，每株菌分为空白组和实验组进 行培养，在实验组中加入NazSeOs(终浓度为0. 5g/L)，空白组中不加入，培养24h后，采用国 家标准方法（GB5009. 93-2010)-原子巧光光度计法测定砸元素含量，获得1株富砸能力 最强的酵母原始菌株，经化学诱变后与生理生化鉴定后确定其分类命名为：光滑假丝酵母 (Candidagl油rata)FXY-4,该细菌已保藏于中国典型培养物保藏中屯、（CCTCC)，地址：中国 武汉武汉大学，其保藏编号为：CCTCCNO:M2015664,保藏日期为2015年11月6日。
[0009] 本发明另一目的在于提供了上述所述富砸光滑假丝酵母（Candidagl油rata) FXY-4的培养方法，所述方法包括如下步骤：
[0010] (1)将光滑假丝酵母（Candidagl油rata)FXY-4在摇瓶中进行发酵培养，发酵溫 度为28~30°C，抑值为6.0~6. 8,转速为180~2(K)r/min，发酵时间为24~32h，摇瓶 发酵培养基为YEPD液体培养基：葡萄糖2 %，蛋白腺2 %，酵母粉1 % ;
[0011] (2)摇瓶发酵结束后在发酵罐中进行中试发酵，取摇瓶发酵种子液接种到1化发 酵罐中，接种量为6~8%，发酵罐中装4~化的培养基，发酵溫度为28~30°C，抑值为 6. 3~6. 8,揽拌速度为3(K)r/min，发酵28~32h，通气比为1:1，发酵结束后将发酵培养液 置于4°C备用，其中，发酵培养基为：乳糖15g、蛋白腺20g、酵母粉lOg、硝酸钟2g、化2Se〇3 0. 5g、去离子水 1000ml，pH6. 5 ~6.8。
[0012] 一种富砸光滑假丝酵母FXY-4作为鱼饲料添加剂的应用，其应用方法为：将本发 明的富砸光滑假丝酵母（Candidagl油rata)FXY-4发酵液直接在商业鱼饲料中添加，添加 量为5X1〇6~10i°C即/Kg鱼饲料。
[0013] 所述鱼类可W为經鱼、罗非鱼、边鱼、武昌鱼等。
[0014] 与现有技术相比，本发明具有W下优点：
[0015] 1、本发明的光滑假丝酵母（Candidagl油rata)FXY-4具有显著增强免疫、促生长 的功能，并通过动物试验验证其对水产动物生长和健康具有促进作用，从而节省养殖成本， 提高经济效益，具有良好的应用前景；
[0016] 2、本发明的光滑假丝酵母（Candidagl油rata)FXY-4能在生长繁殖过程中富砸， 从而在饲料中实现有机砸的补给； 阳017] 3、本发明的光滑假丝酵母（Candidagl油rata)FXY-4添加到饲料中后，可W增加 水产品中的有机砸含量，增加其附加值，节省有机砸在饲料中的添加量，从而有效降低饲料 生产成本。
【具体实施方式】
[001引 W下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围，如未特别说明，本发明 所用方法为常规技术，所用试剂均购自生化商店。
[0019] 实施例1:
[0020] 光滑假丝酵母FXY-4,其获得方式如下：
[0021] 原始菌株的分离：
[0022] 将泡菜汁样品稀释后涂布到YEPD培养基的平板上，28°C下培养，每隔一段时间观 察菌落生长状态，并挑取单菌落转接到YEPD斜面上保存，经过初筛筛选到如下酵母菌株： FXY-1、FXY-3、FXY-4、FXY-5、FXY-7、FXY-10、FXY-11、FXY-19、FXY-21、FXY-23、FXY-24、 FXY-25、FXY-38、FXY-42、FXY-43、FXY-44、FXY-46、FXY-47、FXY-49、FXY-50、FXY-53、FXY-55、 FXY-56。
[0023] 在含NazSeOs(终浓度为0. 5g/L)的YEPD培养基中进行富砸酵母菌的筛选，随后将 初筛得到的酵母菌用YEPD培养基进行培养，每株菌分为空白组和实验组进行培养，在实验 组中加入NazSeOs(终浓度为0. 5g/L)，空白组中不加入，培养24h后，采用国家标准方法（GB 5009. 93-2010) 一一原子巧光光度计法测定砸元素含量，获得1株富砸能力最强的酵母原始 菌株。接着将此菌株接种到YEPD培养基中，摇瓶180转/min, 3(TC培养到对数生长期，取 菌液5血离屯、并用抑值为7. 0的憐酸缓冲液（PBS)洗两次，再用PBS稀释到浓度约为1〇1° 个/mU转入10血离屯、管中，加入0. 8%的硫酸二乙醋（DE巧溶液，30°C诱变处理20min，再 按照2. 5倍DES溶液体积加入25 %硫代硫酸钢溶液终止反应，将诱变后的菌液取200μL涂 布在含NazSeOs(终浓度为0. 5g/L)的YEPD平板上，30°C培养4化后挑取单菌落，获得一批 诱变菌株，最后采用原子巧光光度计法测定每株诱变酵母菌的砸含量，得到1株富砸能力 最强的诱变酵母菌株，经过18SITSRNA序列测定与生理生化鉴定后被命名为富砸光滑假 丝酵母（Candidagl油rata)FXY-4,该细菌已于2015年11月6日送往中国典型培养物保藏 中屯、进行保藏，分类命名：光滑假丝酵母（Candidagl油rata)FXY-4 ;保藏编号：CCTCCNO: Μ2015664 ;地址：中国武汉武汉大学。
[0024] 实施例2 阳0巧]酵母菌株FXY-4(保藏编号：CCTCCNO:Μ2015664) 18SITSrRNA基因序列分析：
[0026] (1)染色体DM(小量）的提取：
[0027] 1.取 1. 5血菌液于 1. 5mLE卵endo;rf管中，12OOOr/min离屯、5min;
[0028] 2.弃上清，900 μ L憐酸缓冲液（PB巧重悬沉淀，4°C12OOOr/min离屯、5min;
[0029] 3.弃上清，加入300TE和200μLlOmg/血溶菌酶，吹吸混匀，37°C溫育比，每隔 15min颠倒混匀一次；
[0030] 4.向沉淀加入 600TENS裂解液（200mmol/L化Cl，100mmol/LTrU-肥 1P册.0， 2.0%SDS，50mmol/L邸TA，0.5%TritonX-100)和 20mg/mL蛋白酶KlOyL，颠倒混匀， 55°C溫育比，每隔15min颠倒混匀一次； 阳的1] 5. 4°C12OOOr/min离屯、5min，取上清；
[0032] 6.向上清中加入等体积的P:C: 1(25 : 24 : 1)充分混匀，4°C12OOOr/min 离屯、lOmin; 阳03引 7.重复步骤6;
[0034] 8.将上清转入新的EP管中，加入1/10体积的3mol/L醋酸钢，2倍体积的无水乙 醇，混匀，-20°C下放置 60min，4°C12OOOr/min离屯、lOmin;
[0035] 9.弃上清，将离屯、管倒扣在吸水纸上，吸干液体后风干，加入30μL无菌水和 lOmg/mLRNaseA0. 5yL，-20°C保存。
[0036] 1. 2 18SITSrRNA基因序列的PCR扩增
[0037] (2)PCR扩增 W38]W刚提取并检测合格的染色体DM为模板，利用由上海英驗生物公司 合成的引物（上游引物口51，5'-1'(1^了466了644(：口'6〔66-3'；下游引物口54， 5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）进行口SrRNA基因序列的PCR扩增，PCR扩增体系见表1。 [0039]表1PCR扩增引物
[0040]
阳〇W PCR扩增条件：
[0042] Step]； 预变t'l; 94T，lOniin; St