本发明涉及一种降解虾塘中亚硝酸盐及抑制病原菌的微生物制剂，尤其是一种降解亚硝酸盐的微生态制剂，属于养殖
技术领域：
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背景技术：
：目前随着水产养殖的不断发展，高密度养殖规模不断扩大，水体污染日益严重，其中氨氮和亚硝酸盐过高，不仅对养殖动物有直接的危害作用，同时恶化的水环境使致病菌大量繁殖，导致疾病暴发。微生物制剂用于降低水体的氨氮和亚硝酸盐得到了广泛的认可。目前已经出现很多复配的微生物制剂，然而使用效果却不稳定。自养型的硝化细菌相对于亚硝化细菌，繁殖速度缓慢，且不适用于水体严重富营养化的养殖水体。尤其当水质恶化后，池塘溶氧长时间处于较低水平，投入的硝化细菌对氨氮和亚硝酸盐的降解作用有限，因此常常出现使用效果不稳定的问题。光合细菌可以降低水体中的氨氮水平，但对降低水体亚硝酸盐效果差；枯草芽孢杆菌可以降低水体氨氮和亚硝酸盐水平，但效果有限；自养型的硝化细菌和亚硝化细菌，不适用于高度富营养化的养殖水体。反硝化细菌已经广泛地应用于污水处理中的脱氮反应，在生物反硝化系统中，反硝化菌可能利用碳源作为电子供体，硝酸根和亚硝酸根作为电子受体，将硝酸盐和亚硝酸盐还原成氮气，同时达到去除有机物和氮污染物的效果。目前已经分离出较多的菌株(如cgmccno.7330，cgmccno.7650，gcmccno.8539)，甚至包括异养硝化——厌氧反硝化的菌株(cctcc02m207075)。据我们对养殖水质跟踪调查发现，在青鱼塘和蟹塘水体和底泥中存在相当数量的反硝化细菌，这些菌株在培养基中对亚硝酸盐具有良好的降解作用，但是在养殖水体仍然出现高氨氮和亚硝酸盐的积累，表明其作用过程受阻。在高密度养殖水体，氨氮和亚硝酸盐最主要的来源即为饲料中的蛋白质分解。相对于禽畜养殖，水产动物相对较高的蛋白质含量决定了其饲料较高的蛋白质水平，而不同的养殖对象其饲料的蛋白质含量差异很大。虾蟹料和一些肉食性鱼类的饲料具有较高的蛋白质含量，从调查中可以发现，在虾蟹塘更容易出现氨氮和亚硝酸的积累，水体中的cod/tn约为6：1，c/n值显然更低。在污水处理中c/n值至少达到20才具有良好的氮去除率，而养殖水体较低的c/n值不利于反硝化作用的进行。因此，我们推测水体发生氨氮和亚硝酸盐积累的关键因素在于底泥和水体中碳源不足，导致反硝化细菌和异养硝化细菌对氮的代谢受阻，造成氨氮和亚硝酸盐积累。碳源是反硝化过程所不可缺少的一种物质。在污水处理中常用加外碳源主要包括：甲醇、乙醇、乙酸钠等。乙酸钠属于低分子简单化合物，易被微生物利用，且降解过程相对简单。调查发现，在以乙酸钠为外加碳源进行反硝化时，即使投加过量，出水cod值也能维持在较低水平。在反硝化系统中，用乙酸钠作为碳源具有效应速度快，优先进行反硝化，而不是菌体繁殖的特点，因此更能促进菌剂的使用效果。国内目前有益微生物在水质净化方面的应用日益被接受和重视，但研究仅处于起步阶段，微生态制剂主要关注在功能性微生物的简单混合，而忽略了水质环境对其功能发挥的影响。特别是在降解水体中的氨氮与亚硝酸盐方面，目前已经分离出许多具有降解氨氮亚硝酸盐的菌株，但是其使用效果不稳定，主要原因是忽略了使用环境对微生物代谢的影响。另外，微生物可减少水产养殖病害的发生，但仅限于作用效果的简单描述，对其作用机理知之甚少，本发明通过对养殖水体弧菌数量及病害发性情况进行监测，明确了其在实际生产中对水产动物疾病的控制作用。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种降解养殖池塘中亚硝酸盐的复合微生态制剂，具有抑制弧菌的作用，以解决亚硝酸盐积累与细菌性病害相继发生的问题。针对这一问题，本发明明确了本微生物制剂的使用对象为青鱼、虾类等高蛋白饲料投入的养殖池塘。为解决上述技术问题，本发明选用小分子碳源乙酸钠或丙酸钠或柠檬酸钠等作为碳源，促进水体的反硝化作用，以降低水体亚硝酸盐水平；选用具有反硝化作用的假单胞菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌，以麸皮、沸石粉、玉米淀维粉为辅料，制成粉剂小颗粒混合的微生态制剂。其中，假单胞菌为弗雷德里克斯堡假单胞菌(pseudomonasfrederiksbergensis)。其中，辅料沸石粉，用于吸附微生物，并使之沉入水底。其中，辅料麸皮，用于吸附微生物使之较长时间悬浮在水体中。其中，辅料乙酸钠或双乙酸钠或丙酸钠或柠檬酸钠，作为小分子碳源，促进反硝化细菌对氨氮、亚硝酸盐的降解速率。其中，辅料淀维粉，一方面，作为分散剂，保持菌剂干燥；另一方面，淀维粉极易溶于水，可作为碳源，或小分子碳源的补充剂。所述微生态制剂，颗粒型，以弗雷德里克斯堡假单胞菌粉与枯草芽孢杆菌粉，与辅料乙酸钠或丙酸钠或柠檬酸钠以质量比2：1：2制粒。所述微生态制剂，粉剂型，以弗雷德里克斯堡假单胞菌粉、枯草芽孢杆菌粉、解淀粉芽孢杆菌粉，与辅料乙酸钠或丙酸钠或柠檬酸钠、玉米淀维粉均匀混合，质量比为2：1：1：6：2。所述微生态制剂，颗粒型与粉剂型以质量比1：3混合。本发明一方面，将小分子碳源引入水体，增强池塘原有反硝化细菌、异氧硝化细菌的代谢活动；另一方面，通过不同比重的吸附剂，使微生物菌在池底和水体同时发挥作用，减少池底氨氮和亚硝酸盐的释放；第三，通过解淀粉芽孢杆菌的使用，在改良水质的同时可抑制弧菌等病原菌的数量，以减少鱼病的发生。河蟹塘在使用本微生物菌剂后，降解氨氮和亚硝酸盐效果显著。本发明通过下述技术方案实现的。一种微生态制剂，该微生态制剂配方为弗雷德里克斯堡假单胞菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌及辅料。所述微生态制剂，颗粒型，以弗雷德里克斯堡假单胞菌粉、枯草芽孢杆菌粉、辅料乙酸钠或丙酸钠或柠檬酸钠以质量比2：1：2制粒。所述微生态制剂，粉剂型，以弗雷德里克斯堡假单胞菌粉、枯草芽孢杆菌粉、解淀粉芽孢杆菌粉，与辅料乙酸钠或丙酸钠或柠檬酸钠、玉米淀维粉均匀混合，质量比为2：1：1：6：2。所述微生态制剂，颗粒型与粉剂型以质量比1：3混合。所述的微生态制剂在水产养殖领域的应用。所述的微生态制剂用于降低水体中的亚硝酸盐、氨氮的含量。所述的微生态制剂用于水产养殖动物细菌性疾病的防治。枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)保藏于中国典型培养物菌种保藏中心，保藏号为cctccab90008。弗雷德里克斯堡假单胞菌(pseudomonasfrederiksbergensis)，保藏于中国典型培养物菌种保藏中心，保藏号为cctccab212328。解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)jssw-la，保藏于中国典型培养物菌种保藏中心，保藏号为cctccm2015602。具体实施方式实施例1：弗雷德里克斯堡假单胞菌粉剂的制备(1)种子罐培养：准备一个内装玻璃珠的无菌三角瓶,用无菌水将茄子瓶斜面上的成熟菌泥刮洗下来,装入三角瓶,振荡分散菌泥,获得均匀的菌悬液，以体积比2％-10％的接种量接入100l种子罐,种子罐的装量系数为60％-70％(v/v),即100l种子罐装培养基60-70l。种子罐培养条件为:搅拌转速200r/min,通气量1-3m3/h,培养温度为25℃，培养时间为20-48h。种子罐培养基：葡萄糖6g/l、酵母粉12g/l、mgso4.7h2o3.5g/l、kh2po42.5g/l、cacl21.5g/l，ph7.0-7.2。(2)发酵培养：种子培养液以体积比5.0％-10.0％的接种量接入1t发酵罐，发酵罐装量系数为60％-70％(v/v)，温度25℃，搅拌速度为200r/min，通气量1-3m3/h，培养48h-72h。发酵结束时发酵液菌体数量≥8×108cfu/ml。发酵罐培养基：葡萄糖10g/l、酵母粉10g/l、mgso4.7h2o3.5g/l、kh2po42.5g/l、cacl21.5g/l，ph7.0-7.2。(3)微胶囊制备：a.包埋剂的制备将步骤(2)所得发酵液通过离心收集湿菌体，加入无菌水制成菌悬液，菌体浓度≥1.0×1010cfu/ml。制备含有重量百分比浓度为0％～2.0％的海藻酸钠，0.2％～0.5％的乙酸钠或丙酸钠或柠檬酸钠三者之一，0.5％～3.0％的明胶，再含有0.1％～1.0％的淀维粉，所使用的溶剂为去离子水，充分混合制得包埋剂。b.交联剂的制备配制重量百分比浓度为2.0％～3.0％的氯化钙去离子水溶液，灭菌待用；c.微胶囊颗粒的制备按体积比为菌液:包埋剂＝1:3～5配制成壁材与菌液的混合胶液，充分搅匀后，将混合胶液喷雾至磁力搅拌的已灭菌的浓度为2.0％～3.0％的氯化钙去离子水溶液中，形成2～3mm的微胶囊，静置固化12～24h，即得弗雷德里克斯堡假单胞菌微胶囊颗粒，每ml菌液可制得200-300粒2～3mm的微胶囊；(4)微胶囊颗粒内活菌数测定：将上述1ml菌液制得的微胶囊颗粒加入到9ml0.2mol/l柠檬酸钠溶液振荡溶解微胶囊颗粒，采用平板计数法进行活菌计数。(5)粉剂的制备：将步骤(3)获得的微胶囊颗粒进行真空冷冻干燥，干燥后的微胶囊颗粒用粉碎机粉碎，过筛，按上述方法制得的弗雷德里克斯堡假单胞菌活菌数≥5.0×108cfu/ml。实施例2：枯草芽孢杆菌粉剂的制备(1)菌种活化：无菌开启枯草芽孢杆菌的冻干保藏菌种，划线接种于营养琼脂试管斜面，于30-37℃培养24-48h，然后划线转接于营养琼脂茄子瓶斜面，30-37℃培养24-48h；镜检，当90％以上菌体形成芽孢时，即为成熟。斜面培养基组成以g/l计：蛋白胨10，牛肉膏3，nacl5，琼脂15-20，以蒸馏水定容配制，ph7.0-7.2；种子罐培养：准备一个内装玻璃珠的无菌三角瓶，用无菌水将茄子瓶斜面上的成熟菌泥刮洗下来，装入三角瓶，振荡分散菌泥，获得均匀的菌悬液。将菌悬液在80℃水浴中加热10分钟,以体积比2％-10％的接种量接入100l种子罐，种子罐的装量系数为60％-70％(v/v)，即100l种子罐装培养基60-70l。发酵培养：种子培养液以体积比5.0％-10.0％的接种量接入1t发酵罐，发酵罐装量系数为60％-70％(v/v)，温度37℃，搅拌速度为200r/min，通气量1-3m3/h，培养15h-30h。培养基组成以g/l计：淀粉1.0-5.0，麸皮1.0-5.0，nacl1.0-2.0，酵母膏2.0-10.0，kh2po40.1-0.5，ph7.0-7.2。菌粉制剂制备：将步骤(3)所得发酵液通过连续离心收集湿菌体，根据离心菌体质量制备含有重量百分比浓度为1.0-3.0％淀维粉和1.0-3.0％明胶，充分混合，进行喷雾干燥，进风温度为160℃-180℃，出风温度为60℃-80℃，获得的枯草芽孢杆菌粉剂，其菌浓度≥5.0×109cfu/g。实施例3：解淀粉芽孢杆菌粉剂的制备(1)菌种活化：无菌开启解淀粉芽孢杆菌jssw-la的冻干保藏菌种，划线接种于营养琼脂试管斜面，于30-37℃培养24-48h，然后划线转接于营养琼脂茄子瓶斜面，30-37℃培养24-48h；镜检，当90％以上菌体形成芽孢时，即为成熟。斜面培养基组成以g/l计：蛋白胨10，牛肉膏3，nacl5，琼脂15-20，以蒸馏水定容配制，ph7.0-7.2；(2)种子罐培养：准备一个内装玻璃珠的无菌三角瓶，用无菌水将茄子瓶斜面上的成熟菌泥刮洗下来，装入三角瓶，振荡分散菌泥，获得均匀的菌悬液。将菌悬液在80℃水浴中加热10分钟,以体积比2％-10％的接种量接入100l种子罐，种子罐的装量系数为60％-70％(v/v)，即100l种子罐装培养基60-70l。(3)发酵罐培养：种子培养液以体积比5.0％-10.0％的接种量接入2t发酵罐，发酵罐装量系数为60％-70％(v/v)，温度37℃，搅拌速度为200r/min，通气量1-3m3/h，培养15h-30h。培养基组成以g/l计：麸皮5-30，酵母膏1.0-3.0，nacl2.0-5.0，以蒸馏水定容配制，ph7.0；(4)菌粉制剂制备：方法与实施例2相同，获得的解淀粉芽孢杆菌粉剂，其菌浓度≥5.0×109cfu/g。实施例4：复合微生态制剂的制备颗粒型：将弗雷德里克斯堡假单胞粉剂与枯草芽孢杆粉剂，与辅料乙酸钠或丙酸钠或柠檬酸钠以重量比2:1:2混合均匀，造粒。其中，造粒工艺：利用圆盘造粒机造粒：造粒过程中间歇性用喷水壶喷水，颗粒不超过50℃的条件下风干至含水量至20％以下分筛，成品粒径在1-4mm，即为颗粒型制剂。粉剂型：以弗雷德里克斯堡假单胞粉剂、枯草芽孢杆粉剂、解淀粉芽孢杆菌粉剂，与辅料乙酸钠或丙酸钠或柠檬酸钠、玉米淀维粉均匀混合，重量比为2:1:1:6:2。所述微生态制剂，颗粒型与粉剂型以质量比1:3混合均匀。实施例5：室内实验实验池3个，体积一方，取池塘中氨氮和亚硝酸盐高的水，于三个池子中，为模仿养殖池塘动态，每个池子分别放养10尾小鲤鱼，三天后测水体氨氮、亚硝酸盐为初始值，使用微生物菌剂2ppm，使用一次后，每天测定水体的氨氮、亚硝酸盐。水质氨氮数据表氨氮(mg/l)初始值第二天第三天第四天第七天17.196.075.044.211.7124.384.063.652.381.1335.284.673.522.181.25水质亚硝酸盐数据表实施例6：蟹塘实验相邻河蟹塘3个，每个50亩，4月底开始出现亚硝酸盐积累，至5月份情况不见好转，5月21号开始使用微生态制剂，第一次500克/亩，以后每周使用200克/亩。使用前测定水体氨氮、亚硝酸盐水平。使用后跟踪测定水体氨氮、亚硝酸盐，取其平均值(6月5日第1次检测，6月25日第2次检测，7月5日第3次检测，7月25日第3次检测。)。水质氨氮数据表氨氮(mg/l)初始值1234何0.730.270.540.440.23dc50.520.440.340.240.13邱0.370.540.20.10.4水质亚硝酸盐数据表微生物制剂使用后，发病情况：河蟹塘在使用微生物菌剂后，降解氨氮和亚硝酸盐效果显著。三个蟹塘开始定期使用本微生态制剂，每周使用一次按200克/亩，使用后，蟹塘未发生大面积死亡。尤其在6、7月份经常阴天降雨的情况下，此三个蟹塘水质相对稳定，未出现大面积死亡，而在邻近的蟹塘死亡量相对较大。6-7月，每月两次采样监测发现，使用微生物菌剂的蟹塘，水体中弧菌数量平均为23cfu/ml，而未使用微生物菌剂的发病蟹塘，弧菌数量平均为130cfu/ml。最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明，而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。当前第1页12