用于确定花粉群的花粉活力和/或成熟度的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于确定花粉群的花粉活力和/或成熟度的方法，以及微流体设备的用途，所述微流体设备包括至少一个特定微流体芯片并且适配于用交流电(AC)实施阻抗式流式细胞术(IFC)。
【背景技术】
[0002]细胞活力的分析，特别是花粉粒的细胞活力的分析，在植物育种以及通过种子的植物产生过程的各个方面扮演重要角色。
[0003]未成熟的花粉粒(小孢子)的活力的分析对于纯合的亲本系的产生及其特定方案或方法的开发是重要的。从花粉粒中产生亲本系使得育种循环的许多代安全，并因此被认为对于有效亲本系产生是至关重要的。然而，为了这些系的最佳产生，它们的供体植物必须在最佳条件下生长。
[0004]花粉质量的分析在雄性不育母系的选择期间扮演重要角色。基于只通过雌性遗传的细胞质雄性不育性的雄性不育母系的使用，不仅在虫媒和风媒授粉物种中是优选的，而且在人工授粉物种中也是优选的。由于花粉丢失，雄性不育母系不能自授粉，这防止了 Fl种子被母系材料污染，并且具有可以省去劳动密集型去雄步骤的优点。
[0005]高质量的花粉对于有效的Fl杂交种子的产生至关重要。高花粉质量将带来最大结籽率(seed set)，而较低的质量将导致较低的产量，并因此导致每粒种子的更高生产成本。花粉质量受其遗传组成、植株生长条件的影响，但也受杀虫剂的影响。在产生过程之前和产生过程期间施用杀虫剂以保持结果植物(fruit-bearing plants)健康是常规实践，因为这可以在可以分别收获果实和种子之前的长达两个月开始。因此，花粉的活力应该在种子产生期间被持续监测，分别以预示/预测和控制产生，以估计授粉的最佳时间点，例如，施用杀虫剂之后，或者测试哪种杀虫剂是不合适的，或者检查其他化学制品(例如，化肥)的效果，或者生长情况。
[0006]育种和Fl杂交种子产生以及种质保存程序中的另一种常规实践是使用储存的花粉进行。对于任何储存程序，应该使用最高质量的花粉。该领域中的常规花粉活力分析将允许储存方案和后续过程的优化。
[0007]当前，不存在有效、高通量且容易实施的技术来原地(on-site)分析花粉质量。
[0008]通常，通过各种经典方法，如染色技术或者体外萌发测定来确定花粉活力。然而，来自各种染色技术的结果不总是与体外萌发相关，并且其不适用于所有物种。该染色技术基于酶促反应，该酶促反应可能不是在所有植物物种的花粉中存在，并且体外花粉萌发高度取决于正确的条件，该条件需要单独调整。现有分析花粉活力和萌发的方法均受限于在特定时间范围内可以分析的细胞的数量，并且它们在制备和分析中是耗时的。
[0009]另外，当前技术接下来需要特定的化学制品，各种特定设备，如，荧光显微镜、培养箱，以及本领域技术人员。通常，这意味着这些分析在分析实验室中实施，而不能在温室或旷野的植物之间“原地”实施。最终，由于这些分析实施起来相当复杂并且涉及从样品制备到分析的数个易错步骤，所以它们的再现性在跨越整个种子产生过程的不同位置(即急需这些数据的不同地点)变化巨大。因此，经验显示，在不同地理位置和甚至在密切相关的分析实验室中获得的花粉活力数据也不总是可比较的，并且遭受主观误差。
[0010]对于评价花粉和植物质量的可靠装置和方法的需求被广泛认可。WO 2012/129199A2公开了此类用于鉴别和分选花粉以及确定花粉活力的方法。对于这些分析，需要常规的基于荧光的流式细胞仪或者光密度测量。对于基于荧光的分析，遗传标记物的存在/不存在是强制性的，以便当特定染料结合于各个细胞时允许鉴别。即使该技术提供了统计数据，其仍不适合于原地分析，并且只有在此类遗传标记物可用时才起作用。另一方面，光密度测量提供了一种用于鉴别正在分裂的花粉(lysing pollen)的手段，但如果花粉细胞处于具有潜在变化的光密度和仍然活性特征的不同发育阶段，则该光密度测量可能提供混淆数据。在这方面，WO 2012/129199 A2没有公开支持数据。
[0011]就节约生产和后续成本而言，例如即将用在Fl杂交种子产生中的花粉细胞的“原地”分析具有巨大的商业利益。在低质量(低活力)花粉的情况下，可以决定不将其用于授粉，减少花粉储存程序、大规模人工授粉、培育材料直到果实收获，种子摘取和进一步处理的后续努力。育种材料的花粉的“原地”分析允许简单且直接地选择雄性可育/雄性不育、耐热和/或耐盐植物，使得选择过程更有效以及减少培育和维持选择的个别植物的劳动。
[0012]不仅种子产生，而且果实产生，均依赖于用良好质量花粉的花的受精。一方面杀虫剂的未知影响以及另一方面对大规模人工授粉的需求(例如由于各种昆虫的灭绝)需要简单的工具以确定花粉质量。
[0013]因此，本发明要解决的问题是克服现有技术的缺陷，并提出了在植物育种和/或种子产生过程中以有效且可靠的方式简单且快速的分析植物细胞的方法。另外，所述分析应该允许在特定过程内的标准化并且在不同位置可适用，在同样的研究/产生地点(温室、旷野、实验室)或在不同的地理区域也是如此，因为种子制造商通常全球操作。
[0014]用于上述过程的植物细胞分析的高度复杂性这一问题通过如方法权利要求1和用途权利要求中要求保护的本发明而解决。更多有利的实施方式在各个从属权利要求(subclaims)中要求保护。
【发明内容】
[0015]根据权利要求1，用于确定花粉群的花粉活力和/或成熟度的方法，包括:
[0016]从花中机械移取未成熟或成熟的花粉粒；
[0017]在导电的、特定的且明确定义的缓冲液中重悬花粉粒，用于使所述植物细胞保持活性；
[0018]将花粉悬浮液通过具有适合于微流体设备的孔径的适当的过滤器，所述微流体设备适配于实施阻抗式流式细胞术(IFC);
[0019]将过滤的悬浮液通过针对各个花粉类型校准的微流体设备，并以预定频率测量花粉粒的阻抗；
[0020]存储测量的各花粉的阻抗值以及测量频率，所述阻抗值具有幅值和其相关相位角；
[0021]计数过滤的悬浮液中的花粉粒；以及
[0022]根据振幅和/或相位值，通过手工或自动设定合适的门控以鉴别花粉粒，并确定分析的花粉群的活力比或成熟度。
【具体实施方式】
[0023]本发明描述了在导电的、特定的且明确定义的缓冲液中重悬收获的花粉粒，用于使所述植物细胞保持活性，以及使用射频阻抗分析用于原地花粉质量确定，以及将其整合进相关蔬菜和果实植物的植物育种和种子产生过程中。导电、特定的且明确定义的缓冲液必须具有使细胞在制备和测量期间保持存活的能力，以及为通过使用射频阻抗分析的所述测量提供充分导电性的能力。因此，该缓冲液必须适合于被分析物种的细胞类型。
[0024]通过该方法，不仅可以容易地原地区分活的和死的花粉细胞，而且还可以以高效的方式区别发育中花粉的不同发育阶段。该分析方法能够在植物育种过程以及种子产生期间施用，且通过以下有助于植物育种:通过选择雄性不育系，通过经由监