一种具有诱导催化内源性n0释放功能的抗凝血材料制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有诱导催化内源性N0释放功能的抗凝血材料制备方法。其步骤包括配置碱性的Tris-buffer缓冲溶液，并向其中加入一定浓度的具有邻酚结构的化合物和具有二硫键或一■砸键的两端含胺基或琉基的化合物；将基底材料置入反应溶液中，控制反应温度和反应l-24h后取出基底，经清洗后、干燥后获得目的材料。本发明方法具有操作简单、反应条件温和易行的优点，制备的材料中具有二硫键或二砸键的两端含胺基或巯基的化合物组分单元含量可控，采用本发明方法制得的改性涂层具有优异的黏附性，并通过原位催化血液中的N0供体持续释放N0分子，抑制血小板的激活和聚集，抑制平滑肌细胞增殖，保护血管内皮层。
【专利说明】一种具有诱导催化内源性NO释放功能的抗凝血材料制备 方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学工程功能材料，尤其是具有优异抗凝血材料制备【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 心血管植入器械，如心血管支架、人工心脏瓣膜、下腔静脉滤器、人工血管等，长期 面临抗凝血的难题。具有优异性能的抗凝血材料表面也一直是血液接触类材料实现功能的 考察手段和目的。一氧化氮（N0)作为人体第一信号分子，发挥着极其重要的生物学功能， 多年的研究表明，N0可以抑制血小板的激活和聚集，能够极大的提升抗血栓形成的能力，并 且具有抑制平滑肌细胞的增殖能力。目前，N0供体型材料主要通过制备高分子涂层装载可 以释放N0分子的物质，在血液环境中，持续释放N0达到抗凝血的目的。然而这种N0释放 型模式，会带来释放速率过快，初期释放量过大，持续时间过短引起相应的血液病理状况及 抗凝血时效受限等问题，这也限制了其在抗凝血方面的应用。人体血液中含有大量的可再 生的N0供体，人体内的谷胱甘肽过氧化物酶（GPx)具有能催化供体释放N0的作用，因此， 原位催化N0再生模式的构建成为一种新型的抗凝血方案。近年的研究表明，具有二硫键或 二硒键的两端含胺基或巯基的化合物具有催化N0供体释放N0能力。研究还表明，一些多 酚类化合物（如EGCG)由于其良好的抗氧化能力可以消耗活性氧片段，保护血管内皮细胞 避免氧化应激毒性，在一定浓度范围可以促进血管内皮细胞增殖。因此研究探讨获得一种 便利有效的工艺方法，具有邻酚结构的化合物和具有二硫键或二硒键的两端含胺基或巯基 的化合物以化学交联的模式组装制备改性涂层得以实现，具有明显的必要。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供是一种诱导催化内源性N0释放的新型抗凝血材料制备方 法，以硒代胱胺化学交联的模式组装制备改性涂层，并使之具有操作简单、成本较低，普适 性广的优点。
[0004] 本发明一种诱导催化内源性N0释放的抗凝血材料制备方法，包括如下步骤：
[0005] 1、将需要改性修饰的基底材料进行抛光、清洗、干燥；
[0006] 2、将A步骤所得样品放置于pH = 5-12的Tris-buffer缓冲体系，然后向体系中 加入浓度为〇· 〇lmg/ml-10mg/ml的具有邻酚结构的化合物和浓度为0· 01mg/ml-10mg/ml的 具有二硫键或二硒键的两端含胺基或巯基的化合物，在10_30°C下，反应l_24h ;
[0007] 3、对B步骤所得样品，去离子水浸没，超声清洗3次，每次5min，然后在N2条件下 干燥，即得目标材料。
[0008] 采用本发明方法，通过将具有二硫键或二硒键的两端含胺基或巯基的化合物组装 到血液接触类材料表面，一方面可以控制N0的释放速度，另一方面可以获得长效的N0持续 释放，具有很高的应用价值。多酚类化合物较容易被氧化脱氢，其结构中的邻苯二酚易转 化成邻苯二醌结构，该结构可进一步与含有氨基的化合物发生迈克尔加成反应和希夫碱反 应，因此将多酚类化合物与分子结构中含两个或两个以上氨基的化合物反应，能形成聚合 涂层或交联聚合物涂层。胱胺和硒代胱胺具有两端氨基的分子结构，能与多酚类化合物发 生迈克尔加成反应和希夫碱反应，能在材料表面形成交联聚合涂层，因此就能实现有机硒 化合物在金属血液接触材料表面的负载，获得具有原位催化NO再生的催化活性表面。该抗 凝血涂层材料中的多酚类化合物相对胱胺和硒代胱胺是过量的，除了与胱胺或硒代胱胺形 成交联薄膜，剩余的多酚化合物还具有优异的抗氧化性和清除氧自由基的能力，对心脑血 管具有保护作用。多酚类化合物的分子结构中含有大量的邻位酚羟基，这些邻位酚羟基可 与金属形成稳定螯合作用，因此多酚类化合物能在金属表面形成较稳定的固定或结合，这 样的涂层与金属、陶瓷基底具有优良的结合力。此外该交联聚合涂层还能通过分子间疏水 相互作用和氢键作用，与聚合物基底材料具有良好结合力。因此，该涂层可广泛的应用于几 乎所有的生物材料表面。
[0009] 采用本发明方法制备的新型抗凝血材料表面，具有优异的催化人体内源性N0供 体释放的能力，能有效的抑制血小板在材料表面的激活和聚集，发挥较好的抗凝血功能。 [0010] 与现有技术相比，本发明的有益之处在于：
[0011] 1)传统的抗凝生物分子（如肝素、水蛭素、比伐卢定），无论是以共价接枝还是静 电组装到材料表面，都必须依赖分子的尺寸、构象、活性以及其在材料表面发挥抗凝作用的 稳定性及持久性。生物分子一旦在服役过程中失活或大量丢失，便不能有效发挥其生物学 功能。本发明利用N0信号分子的功能，其发挥功用的途径不受上述生物分子受限条件的影 响；
[0012] 2)传统的N0供体型材料表面，由于是以涂层包裹装载的方式，需要较厚的涂层装 载N0,在实际的器械表面涂层的厚度会受到一定的限制，这也意味着N0的持续释放受到限 制。N0的释放速率随时间而变化，而且存在初期N0释放速率过快等因素，也会引发负面的 生物学效应。本方法通过化学交联制备的有机催化涂层，可以原位催化血液中的N0供体持 续稳定地释放N0分子，抑制血小板的激活和聚集，抑制内膜增生；
[0013] 3)曾有相关表面接枝有机硒化合物，催化内源性N0释放的抗凝血表面的技术报 道，然而，接枝密度通常较低，难以提供足量的抑制血小板激活和内膜增生的N0浓度。本发 明通过化学交联，具有二硫键或二硒键的两端含胺基或巯基的化合物--胱胺、硒代胱胺、 硒代胱氨酸、胱氨酸和小分子巯基化合物共聚在改性涂层内，调控工艺参数，可以实现有机 催化分子量的合理掺入，确保了安全的N0的释放效率和合理的释放浓度，发挥其生物学功 能。
[0014] 4)本发明所需制备的涂层通常低于50nm，所得涂层较为均匀，原料投入很少，且 可以在多种材料表面进行修饰。与传统的抗凝血手段相比，操作简单，成本较低，普适性广。
[0015] 5)本发明材料中涉及的一些多酚类组分，均具有优异的抗氧化性，具有清除血管 中氧自由基的能力，对血管具有保护作用，通过与催化N0释放的组分共聚，既能获得良好 的抗凝血性能，又能获得良好的血管内皮层修复性能。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 下面结合附图和实施案例对本发明作进一步的详细说明。
[0017] 图1是本发明所制备功能涂层涂覆的316L SS表面的X射线光电子能谱（XPS)结 果，图中为工艺参数下的全谱元素及Se元素的百分比含量。
[0018] 图2a是用本发明制备的具有原位催化N0释放的新型抗凝血材料与新鲜人富血小 板血浆接触培养120min的扫描电镜照片。有机硒涂层制备在316L医用不锈钢表面（316L SS)，图中，Co(EGCG-Se):表没食子儿茶素没食子酸酯与硒代胱胺共聚涂层修饰的316L SS; Donor :血楽中添加 S-Nitroso-N-acetyl-DL-penicillamine (SNAP,)，模拟人血液中的内 源性N0供体环境；No-donor :血楽中未添加 SNAP,作为无催化底物的对照。
[0019] 图2b是316L SS表面与新鲜人富血小板血浆接触培养120min的扫描电镜照片， 左为不添加供体组，右为添加供体组。Donor与No-Donor与图2a中所示意义相同。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例对本发明的实施作进一步的描述。
[0021] 在实际实施中：
[0022] 所述具有邻酚结构的化合物为多巴胺、没食子酸、表没食子儿茶素没食子酸酯 EGCG、表儿茶素没食子酸酯ECG、表儿茶素 EC、表没食子儿茶素 EGC、邻苯二酚的一种。
[0023] 所述具有二硫键或二硒键的两端含胺基或巯基的化合物为胱胺、硒代胱胺、硒代 胱氨酸、胱氨酸和小分子巯基化合物的一种。
[0024] 所述的一种诱导催化内源性N0释放的新型抗凝血材料制备方法，其特征在于，所 述基底材料可为金属生物材料、陶瓷生物材料、天然和合成的高分子生物材料、杂化生物材 料。所述金属生物材料包括不锈钢、钴基合金、钛及其合金、金、镁及其合金、锌合金、钽及其 合金、纯铁及其合金。所述陶瓷生物材料包括医用无机材料与薄膜_Ti02、各向同性热解碳 LTIC、羟基磷灰石，磷酸钙、金刚石及类金刚石。所述天然和合成的高分子生物材料包括：天 然生物材料一胶原、明胶、丝素蛋白、纤维素、壳聚糖、海藻酸、透明质酸，人工合成高分子材 料一漆纶PET、聚四氟乙烯PTFE、聚氨酯PU、聚甲醛Ρ0Μ、硅橡胶、聚乳酸PLA、乙交酯-丙交 酯共聚物PLGA、聚三亚甲基碳酸酯PTMC、聚己内酯PCL。所述杂化生物材料包括聚乳酸/羟 基磷灰石、壳聚糖/羟基磷灰石。
[0025] 在以下实施例中，基体以外的化学试剂除特别声明的外均为化学纯。
[0026] 实施例1
[0027] -种具有诱导催化内源性N0释放功能的新型抗凝血材料制备方法，由如下步骤 获得：
[0028] A、将需要改性修饰的纯铁材料进行抛光、清洗、干燥；
[0029] B、将A步骤所得样品放置于pH = 5的缓冲体系，然后向体系中加入浓度为 0. 01mg/ml的多巴胺的化合物和浓度为0. 01mg/ml的胱胺，在1(TC下，反应lh ;
[0030] C、对B步骤所得样品，去离子水浸没，超声清洗3次，每次5min，然后在N2条件下 干燥，即得目标材料。
[0031] 实施例2
[0032] -种具有诱导催化内源性N0释放功能的新型抗凝血材料制备方法，由如下步骤 获得：
[0033] A、将需要改性修饰的镁基材料进行抛光、清洗、干燥；
[0034] B、将A步骤所得样品放置于pH = 12的缓冲体系，然后向体系中加入浓度为10mg/ ml的表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG)和浓度为lOmg/ml的硒代胱胺，在30°C下，反应 24h ；
[0035] C、对B步骤所得样品，去离子水浸没，超声清洗3次，每次5min，然后在N2条件下 干燥，即得目标材料。
[0036] 实施例3
[0037] -种具有诱导催化内源性NO释放功能的新型抗凝血材料制备方法，由如下步骤 获得：
[0038] A、将需要改性修饰的医用316L不锈钢进行抛光、清洗、干燥；
[0039] B、将A步骤所得样品放置于pH = 7的缓冲体系，然后向体系中加入浓度为2mg/ml 的表儿茶素没食子酸酯（ECG)和浓度为3mg/ml的硒代胱氨酸，在15°C下，反应4h ;
[0040] C、对B步骤所得样品，去离子水浸没，超声清洗3次，每次5min，然后在N2条件下 干燥，即得目标材料。
[0041] 实施例4
[0042] 一种具有诱导催化内源性N0释放功能的新型抗凝血材料制备方法，由如下步骤 获得：
[0043] A、将需要改性修饰的钴基合金材料进行抛光、清洗、干燥；
[0044] B、将A步骤所得样品放置于pH = 9的缓冲体系，然后向体系中加入浓度为5mg/ml 的没食子酸和浓度为5mg/ml的胱氨酸，在20°C下，反应8h ;
[0045] C、对B步骤所得样品，去离子水浸没，超声清洗3次，每次5min，然后在N2条件下 干燥，即得目标材料。
[0046] 实施例5
[0047] -种具有诱导催化内源性N0释放功能的新型抗凝血材料制备方法，由如下步骤 获得：
[0048] A、将需要改性修饰的钛进行抛光、清洗、干燥；
[0049] B、将A步骤所得样品放置于pH = 10的缓冲体系，然后向体系中加入浓度为6mg/ ml的具有表儿茶素（EC)的化合物和浓度为7mg/ml的具有二硫键或二硒键的两端含胺基或 巯基的化合物，在25°C下，反应10h ;
[0050] C、对B步骤所得样品，去离子水浸没，超声清洗3次，每次5min，然后在N2条件下 干燥，即得目标材料。
[0051] 实施例6
[0052] 具有诱导催化内源性N0释放功能的新型抗凝血材料制备方法，由如下步骤获得：
[0053] A、将需要改性修饰的纯铁材料进行抛光、清洗、干燥；
[0054] B、将A步骤所得样品放置于pH = 8的缓冲体系，然后向体系中加入浓度为0. lmg/ ml的表没食子儿茶素和浓度为0. 3mg/ml的胱胺，在12°C下，反应16h ;
[0055] C、对B步骤所得样品，去离子水浸没，超声清洗3次，每次5min，然后在N2条件下 干燥，即得目标材料。
[0056] 实施例7
[0057] 具有诱导催化内源性N0释放功能的新型抗凝血材料制备方法，由如下步骤获得：
[0058] A、将需要改性修饰的涤纶（PET)材料进行清洗、干燥；
[0059] B、将A步骤所得样品放置于pH = 6的缓冲体系，然后向体系中加入浓度为7mg/ml 的具有邻苯二酚结构的化合物和浓度为9mg/ml的具有二硒代胱胺，在6°C下，反应9h ;
[0060] C、对B步骤所得样品，去离子水浸没，超声清洗3次，每次5min，然后在N2条件下 干燥，即得目标材料。
[0061] 实施例8
[0062] 一种具有诱导催化内源性N0释放功能的新型抗凝血材料制备方法，由如下步骤 获得：
[0063] A、将需要改性修饰的聚四氟乙烯（PTFE)材料进行清洗、干燥；
[0064] B、将A步骤所得样品放置于pH = 11的缓冲体系，然后向体系中加入浓度为lmg/ ml的具有表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG)和浓度为lmg/ml的硒代胱胺酸，在18°C下， 反应4h ;
[0065] C、对B步骤所得样品，去离子水浸没，超声清洗3次，每次5min，然后在N2条件下 干燥，即得目标材料。
【权利要求】
1. 一种具有诱导催化内源性NO释放功能的抗凝血材料制备方法，由如下步骤获得： A、 将需要改性修饰的基底材料进行抛光、清洗、干燥； B、 将A步骤所得样品放置于pH = 5-12的Tris-buffe缓冲体系，然后向体系中加入浓 度为0· 01mg/ml-10mg/ml的具有邻酚结构的化合物和浓度为0· 01mg/ml-10mg/ml的具有二 硫键或二硒键的两端含胺基或巯基的化合物，在10_30°C下，反应l_24h ; C、 对B步骤所得样品，去离子水浸没，超声清洗3次，每次5min，然后在N2条件下干燥， 即得目标材料。
2. 如权利要求1所述的一种诱导催化内源性NO释放的抗凝血材料制备方法，其特征在 于，所述具有邻酚结构的化合物为多巴胺、没食子酸、表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG、表 儿茶素没食子酸酯ECG、表儿茶素 EC、表没食子儿茶素 EGC、邻苯二酚的一种。
3. 如权利要求1所述的一种诱导催化内源性NO释放的抗凝血材料制备方法，其特征在 于，所述Tris缓冲体系包括磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液。
4. 如权利要求1所述的一种诱导催化内源性NO释放的抗凝血材料制备方法，其特征 在于，所述具有二硫键或二硒键的两端含胺基或巯基的化合物为胱胺、硒代胱胺、硒代胱氨 酸、胱氨酸和小分子巯基化合物的一种。
5. 如权利要求1所述的一种诱导催化内源性NO释放的抗凝血材料制备方法，其特征在 于，所述基底材料可为金属基生物材料、陶瓷基生物材料、高分子基生物材料、杂化材料等。
6. 如权利要求5所述的一种诱导催化内源性NO释放的抗凝血材料制备方法，其特征在 于，所述金属基生物材料包括：不锈钢、钴基合金、钛及其合金、金、镁及其合金、锌合金、纯 铁及其合金。
7. 如权利要求5所述的一种诱导催化内源性NO释放的抗凝血材料制备方法，其特征在 于，所述陶瓷基生物材料包括：医用无机材料与薄膜、Ti02薄膜、各向同性热解碳LTIC、硅 和Si0 2、羟基磷灰石、磷酸钙、金刚石及类金刚石。
8. 如权利要求5所述的一种诱导催化内源性NO释放的抗凝血材料制备方法，其特征 在于，所述天然和合成的高分子生物材料包括：天然生物材料--胶原、明胶、丝素蛋白、纤 维素、壳聚糖、海藻酸、透明质酸，人工合成高分子材料--漆纶PET、聚四氟乙烯PTFE、聚氨 酯PU、聚甲醛P0M、硅橡胶、聚乳酸PLA和乙交酯-丙交酯共聚物PLGA、聚三亚甲基碳酸酯 PTMC、聚己内酯PCL。
9. 如权利要求5所述的一种诱导催化内源性NO释放的抗凝血材料制备方法，其特征在 于，所述杂化生物材料包括聚乳酸/羟基磷灰石、壳聚糖/羟基磷灰石。
【文档编号】A61L33/02GK104208761SQ201410394981
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年8月12日 优先权日:2014年8月12日
【发明者】王进, 罗日方, 杨志禄, 黄楠, 翁亚军, 赵元聪, 冷永祥, 杨苹 申请人:西南交通大学